Triterpenos e ferulatos de alquila de Maprounea guianensis

Triterpenes and alkyl ferulates from Maprounea

Resumo

This work describes the phytochemical study of hexane extracts from the stem of Maprounea guianensis. Besides 3-oxo-21alpha-H-hop-22(29)-en (moretenone), beta-sitosterol, lupenone and lupeol, a mixture of dodecosyl, tetracosyl, hexacosyl, octacosyl and triacontyl ferulates was also isolated, as well as 3-beta-acetoxy-lup-20(29)-en-28-oic acid, 3beta-O-trans-p-coumaroyl-lup-20(29)-en-28-oic acid and 3beta-O-trans-p-coumaroyl-urs-12-en-28-oic acid. The structures of these compounds were established by spectroscopic analysis.

Maprounea guianensis; triterpenes; alkyl ferulates

Maprounea guianensis; triterpenes; alkyl ferulates

ARTIGO

Triterpenos e ferulatos de alquila de Maprounea guianensis

Triterpenes and alkyl ferulates from Maprounea

Juceni P. DavidI, ^*; Marilena Meira^II; Jorge M. David^II; Maria Lenise da S. Guedes^III

^IFaculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador - BA

^IIInstituto de Química, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador - BA

^IIIInstituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador - BA

ABSTRACT

This work describes the phytochemical study of hexane extracts from the stem of Maprounea guianensis. Besides 3-oxo-21a-H-hop-22(29)-en (moretenone), b-sitosterol, lupenone and lupeol, a mixture of dodecosyl, tetracosyl, hexacosyl, octacosyl and triacontyl ferulates was also isolated, as well as 3-b-acetoxy-lup-20(29)-en-28-oic acid, 3b-O-trans-p-coumaroyl-lup-20(29)-en-28-oic acid and 3b-O-trans-p-coumaroyl-urs-12-en-28-oic acid. The structures of these compounds were established by spectroscopic analysis.

Keywords:Maprounea guianensis; triterpenes; alkyl ferulates.

INTRODUÇÃO

Maprounea guianensis Aublet é uma árvore pertencente à família Euphorbiaceae, que consiste de 290 gêneros e 7500 espécies distribuídas nas regiões tropicais e temperadas do globo, concentrando-se principalmente na África e América tropical¹. A família Euphorbiaceae consiste de plantas dicotiledôneas, ervas, arbustos e árvores, algumas suculentas semelhantes a cactos, que são caracterizadas freqüentemente pela ocorrência de seiva leitosa geralmente tóxica¹. Entre as espécies mais conhecidas desta família encontram-se quebra-pedra, aveloz, mandioca, mamona e seringueira².

O estudo do gênero Maprounea tem despertado o interesse dos pesquisadores devido às atividades biológicas de suas espécies. Por exemplo, tem sido atribuída potente atividade anti-HIV e anti-tumoral à espécie M. africana³. Este gênero é pouco representado no Brasil, não se podendo afirmar se este contribui com uma ou duas espécies no país, haja vista que a identificação botânica da espécie M. guianensis tem levantado controvérsias, sendo que alguns autores a identificam como sendo M. brasiliensis⁴. Deste modo, o estudo fitoquímico com as espécies do gênero tem grande importância quimiossistemática. O estudo anteriormente realizado com o caule de M. guianensis coletada em Demerara - Georgetown (Guiana) relata o isolamento de 3-oxo-21b-H-hop-22(29)-eno (moretenona) e ácido 3-acetilaleuritólico⁵. Este trabalho descreve o isolamento e elucidação estrutural de metabólitos secundários presentes no extrato hexânico do caule desta espécie, em comparação com os resultados previamente reportados. Deste extrato, além de 3-oxo-21a-H-hop-22(29)-eno ou moretenona (1), b-sitosterol, lupenona e lupeol foi isolada a mistura dos E-ferulatos de dodecosila (2), tetracosila (3), hexacosila (4), octacosila (5), triacontila (6), bem como os ácidos 3-b-acetoxi-lup-20(29)-eno-28-óico (7), 3b-O-trans-p-cumaroil—lup-20(29)-eno-28-óico (8) e 3b-O-trans-p-cumaroil-urs-12-eno-28 -óico (9). A identificação estrutural destas substâncias foi realizada por meio da análise de dados espectrométricos de EMIE e RMN de ¹H e ¹³C (PND e DEPT).

PARTE EXPERIMENTAL

Os espectros de RMN foram obtidos em espectrômetro Gemini 300 da Varian, sendo utilizado o sinal do solvente como referencial interno. Os espectros de massas foram obtidos por meio de injeção direta no detetor de massas da HP modelo 5973.

Os caules de Maprounea guianensis foram coletados na restinga do Parque Metropolitano da Lagoa do Abaeté (Salvador, BA). A identificação da espécie foi realizada e uma exsicata desta foi depositada sob número 041211 no Herbário Alexandre Leal Costa, do Instituto de Biologia da UFBA. Para avaliação da citotoxicidade, tanto dos extratos brutos quanto das substâncias isoladas, foi utilizado o teste de letalidade de Artemia salina⁶.

Isolamento dos constituintes

Os caules foram secos e moídos, sendo a seguir macerados com MeOH. O extrato metanólico do caule foi então submetido a sucessivas partições entre hexano:MeOH/H₂O (9:1), CHCl₃:MeOH/H₂O (6:4) e AcOEt:H₂O (6:4).

O extrato hexânico obtido (8,68 g) foi submetido a CC de sílica gel, usando como sistema de solvente hexano:AcOEt em ordem crescente de polaridade e as frações obtidas foram, então, purificadas como descrito a seguir. A fração eluída em hexano:AcOEt (9:1) foi submetida a nova CC sob sílica gel (40-60 mm) utilizando como eluente CHCl₃ que, a seguir, foi purificada por recristalização em hexano. A parte insolúvel foi identificada como 3-oxo-21a-H-hop-22(29)-eno (1, 265,0 mg). A fração da CC inicial eluída em hexano:AcOEt (8:2) foi submetida a CC sob sílica gel (40-60 mm) utilizando como eluentes CHCl₃:AcOEt (99:1). Deste modo, obteve-se o ácido 3-b-acetoxi-lup-20(29)-eno-28-óico (7, 11,8 mg). A fração (CC inicial) eluída em hexano:AcOEt (6:4) foi submetida a CC sob sílica gel (40-60 mm) utilizando como eluente hexano:AcOEt (7:3), seguida de purificação por CCDP desenvolvida com CHCl₃:AcOEt (95:5), fornecendo o ácido 3b-O-trans-p-cumaroil—lup-20(29)-eno-28-óico (8, 21,7 mg) e o ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-urs-12-eno-28-óico (9, 27,6 mg). Enquanto que a mistura de ferulatos (2 - 6) foi obtida a partir de quatro CC sucessivas em SiO₂ usando como eluente em cada coluna, hexano/AcOEt (6:4), CHCl₃/AcOEt (99:1), hexano/AcOEt (8:2) e hexano:AcOEt (9:1), respectivamente.

Dados físicos das substâncias isoladas

3-Oxo-21a-H-hop-22(29)-eno (1), C₃₀H₄₈O. EM m/z (int. rel.): 424 (24), 205 (29), 189 (100), 190 (22), 191 (13), 149 (12), 148 (14), 147 (18), 123 (14), 121 (22), 120 (8), 119 (17), 109 (20), 108 (9), 107 (27), 105 (17), 95 (30), 93 (28), 91 (16), 69 (20), 68 (15), 67 (25), 55 (28). RMN ¹H [300 MHz, CDCl₃, d (ppm), multiplicidade, J (Hz)]: d 2,41 (m, H-2), 1,05 (s, Me-23), 0,93 (s, Me-24), 1,00 (s, Me-25 e Me-26), 0,91 (s, Me-27), 0,67 (s, Me-28), 4,65 (d, H-29a, J=1,1 Hz), 4,67 (d, H-29 b, J= 1,1 Hz), 1,65 (s, Me-30). Dados de RMN ¹³C (Tabela 1).

Mistura dos E-ferulatos de dodecosila (2), tetracosila (3), hexacosila (4), octacosila (5), triacontila (6). EM m/z: 502 (C₃₂H₅₄O₄), 530 (C₃₄H₅₈O₄), 558 (C₃₆H₆₂O₄), 586 (C₃₈H₆₆O₄) e 614 (C₄₀H₇₀O₄). Dados de RMN ¹H e ¹³C comparados com os encontrados na literatura^7,8. RMN ¹H [300 MHz, CDCl₃, d (ppm), multiplicidade, J (Hz)]: d 0,89 (H₃C, t, 7,0), 1,27 (n-1, m), 1,27 (H-4'a, n-2, m), 1,59 (H-2' e H-3', m), 3,94 (H₃CO, s), 4,20 (H-1', t, 6,8), 6,31 (H-8, d, 15,9), 6,93 (H-5, d, 8,2), 7,05 (H-2, d, 1,8), 7,08 (H-6, dd, 1,8; 8,1), 7,62 (H-7, d, 15,9). RMN ¹³C [75 MHz, CDCl₃, d (ppm)]: d 127,09 (C-1), 109,33 (C-2), 147,91 (C-3), 146,76 (C-4), 114,69 (C-5), 123,00 (C-6), 144,57 (C-7), 115,74 (C-8), 167,32 (C-9), 55,93 (H₃CO), 64,59 (C-1'), 31,91 (C-2'), 25,98 (C-3'), 26,0 - 29,67 (n-3), 31,91 (n-2'), 22,66 (n-1'), 14,07 (H₃C').

Ácido 3-b-acetoxi-lup-20(29)-eno-28-óico (7), C₃₂H₅₀O₄. EM m/z (int. rel.): 498 (3), 482 (2), 452 (3), 438 (24), 423 (12), 395 (15), 248 ( 23), 234 (16), 203 (26), 189 (100), 190 (44), 191 (26), 175 (27). RMN ¹H [300 MHz, CDCl₃, d (ppm), multiplicidade, J (Hz)]: d 4,49 (dd, J=9,7 e 5,9 Hz, H-3), 2,06 (s, H₃CCOO), 0,98 (s, Me-23), 0,94 (s, Me-24), 0,86 (s, Me-25), 0,85 (s, Me-26), 0,84 (s, Me-27), 4,75 (d, H-29a), 4,62 (d, H-29b), 1,71 (s, Me-30). Dados de RMN ¹³C (Tabela 1).

Ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-lup-20(29)-eno-28-óico (8), C₃₉H₅₄O₅. EM m/z (int. rel.): 602 (2), 438 (14), 439 (6), 395 (12), 248 (33), 203 (20), 191 (22), 190 (30), 189 (38), 187 (18), 175 (13), 164 (20), 163 (13), 147 (100), 136 (13), 135 (12), 133 (17), 121 (27), 120 (10), 119 (23), 107 (18), 93 (16), 91 (14), 83 (11), 81 (17), 71 (10), 69 (22), 57 (14), 55 (21). RMN ¹H [300 MHz, CDCl₃, d (ppm) , multiplicidade, J (Hz)]: d 7,43 (d, J=9 Hz, H-2' e H-6'), 6,85 (d, J=9 Hz, H-3' e H-5'), 7,61 (d, J=15,9 Hz, H-7'), 6,30 (d, J=15,9 Hz, H-8'), 4,15 (m, H-3), 4,75 (sl, H-29a), 4,62 (sl, H-29b), 1,72 (s, Me-30), 0,99 (s, Me-23), 0,95 (s, Me-24), 0,92 (s, Me-25), 0,89 (s, Me-26), 0,88 (s, Me-27). Dados de RMN ¹³C (Tabela 1).

Ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-urs-12-eno-28-óico (9). C₃₉H₅₄O₅. EM m/z (int. rel.): 602 (2), 438 (6), 395 (1), 248 (100), 249 (20), 219 (13), 203 (82), 204 (25), 205 (11), 192 (15), 191 (81), 190 (89), 189 (44), 187 (7), 188 (7), 175 (17), 165 (13), 163 (11), 147 (50), 133 (39), 121 (10), 119 (9), 105 (8). RMN ¹H [300 MHz, CDCl₃, d (ppm), multiplicidade, J (Hz)]: d 7,39 (d, J=9 Hz, H-2' e H-6'), 6,81 (d, J=9 Hz, H-3' e H-5'), 7,58 (d, J=15,9 Hz, H-7'), 6,26 (d, J=15,9 Hz, H-8'), 4,55 (t, H-3), 5,20 (t, H-12), 0,95 (s, Me-23), 0,75 (s, Me-24), 0,89 (s, Me-25), 0,82 (s, Me-26), 1,05 (s, Me-27). Dados de RMN ¹³C (Tabela 1).

Teste de citotoxicidade

Teste de letalidade de Artemia salina. O teste foi realizado a partir do método adaptado por Serrano e colaboradores⁶. A descrição do procedimento experimental detalhado encontra-se na literatura⁹. O extrato hexânico do caule de Maprounea guianensis não apresentou atividade citotóxica (DL > 1000). No entanto, o extrato clorofórmico e acetato de etila apresentaram 90% e 100% de atividade, respectivamente. As substâncias 1-9 foram testadas e mostraram-se inativas (DL > 1000).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O b-sitosterol, a lupenona e o lupeol foram identificados através da comparação dos dados de RMN com os descritos na literatura^8,10.

A substância 1 apresentou o pico do íon molecular em m/z 424 no espectro de massas que, aliado aos dados obtidos dos espectros de RMN ¹³C (Tabela 1), permitiu sugerir a fórmula molecular C₃₀H₄₈O. Além disso, o pico base registrado em m/z 189 indicou que esta substância possuía um esqueleto triterpênico pentacíclico da série lupeno ou hopeno¹¹. Esta observação foi suportada pela análise dos dados de RMN, uma vez que o espectro RMN ¹H mostrou a presença de sete metilas (singletos), destacando-se dentre estes o sinal da metila ligada a carbono sp² em d 1,65 que, juntamente com os dubletos em d 4,67 e d 4,65 atribuídos aos dois hidrogênios olefínicos, caracterizam o grupo isopropenil. Nesse espectro foi também observada a presença de um multipleto em d 2,41 atribuído aos dois hidrogênios a-carbonílicos. No espectro de RMN de ¹³C, a presença do sinal em d 217 e a ausência do sinal do carbono oximetínico (d 79) sugeriu a presença de uma carbonila em C-3. Comparação dos deslocamentos químicos encontrados nos espectros RMN ¹³C especialmente do C-17, C-18, C-19, C-21 e do grupo isopropenil da substância 1 com os mesmos carbonos no 21aH-hop-22(29)-eno, hopeno e derivados de lupeno permitiu determinar que a substância 1 pertence à série 21aH-hop-22(29)-eno¹². Triterpenos do grupo hopeno podem apresentar o grupo isopropil no C-21 em pseudo-axial e pseudo-equatorial. Estes podem ser diferenciados pelos deslocamentos químicos do C-17, C-18, C-19 e especialmente C-21. Nos triterpenos onde o grupo isopropil possui a configuração pseudo-axial, o C-21 é registrado em menor deslocamento químico (d 46,5) e naqueles em que este grupo está pseudo-equatorial (série 21aH), o C-21 encontra-se mais desprotegido (d 48). Na literatura^5,10 são encontrados dados de RMN ¹³C comparáveis com os encontrados para a substância 1.

O espectro RMN de ¹H de 2 - 6 mostrou os sinais característicos do grupo trans-feruloíla. Entre estes, pode-se observar sinais para três hidrogênios aromáticos 1,2,4-tri-substituído, além de dois hidrogênios olefínicos conjugados à carbonila em relação trans (J = 15,9 Hz), bem como a presença do sinal de metoxila ligado a anel aromático (d 3,94). A presença da cadeia alcoxílica foi caracterizada pelo tripleto em d 0,89 referente aos hidrogênios do grupo metila terminal, pelo singleto largo em d 1,27 correspondente aos hidrogênios metilenos e pelo tripleto desprotegido em d 4,20 referente aos hidrogênios oximetilênicos. A análise dos espectros de RMN de ¹³C (Tabela 1) e de massas, bem como comparação com dados da literatura⁸ sugeriu que estas substâncias eram ferulatos de alquilas. Assim, foi determinado o comprimento das cadeias alquílicas dos ferulatos presentes e a proporção entre eles, com base nos valores dos picos do EM e suas abundâncias relativas. Os picos dos íons moleculares registrados em m/z 614 (3), 586 m/z (357), m/z 558 (719), m/z 530 (76) e m/z 502 (24) no espectro EMIE mostraram que esta mistura era constituída dos E-ferulatos de triacontila, (C₄₀H₇₀O₄, 2), octacosila (C₃₈H₆₆O₄, 3), hexacosila (C₃₆H₆₂O₄, 4), tetracosila (C₃₄H₅₈O₄, 5) e dodecosila (C₃₂H₅₄O₄, 6) nas proporções 0,3 : 30,3 : 61,0 : 6,4 : 2,0 respectivamente.

Os espectros de RMN ¹H de 7 e 8 mostraram a presença de sinais característicos de hidrogênios olefínicos entre d 4,7 - d 4,6 bem como os duplos dubletos (d 4,49 e 4,15), que foram atribuídos aos hidrogênios oximetínicos, que encontravam-se mais desprotegidos que o esperado na posição 3 dos triterpenos. Este sinal sugere a esterificação de triterpenos nesta posição. Nos espectros de RMN ¹³C foram verificados os sinais característicos dos carbonos olefínicos dos triterpenos do grupo lupeno em aproximadamente d 150 (C-20) e d 109 (C-29), bem como o sinal do carbono oximetínico (C-3) mais desprotegido que o esperado, devido à esterificação em ca. d 80. O triterpeno 7 apresentou 32 sinais no espectro de RMN ¹³C e, juntamente com o pico do íon molecular registrado em m/z 498 no espectro EMIE, permitiram sugerir a fórmula molecular C₃₂H₅₀O₄. Foram ainda observados nos espectros de RMN de ¹H e de ¹³C, o singleto característico de metila de grupo acetoxila (d 2,06), além dos sinais dos carbonos carbonílico e metílico de grupo acetoxila em d 171,0 e 21,3, respectivamente, e o sinal referente ao grupo carboxílico de ácido (C-28) em d 181,5. Comparação com os valores de RMN ¹³C da literatura empregando dois modelos de triterpenos como referência, o ácido betulínico¹³ e 3-b-acetiloxi-lup-20-(29)-eno¹⁰ permitiu atribuir os valores dos deslocamentos químicos dos carbonos e determinar a estrutura da substância 7 como sendo ácido 3-b-acetiloxi-lup-20(29)-eno-28-óico.

Os dados obtidos dos espectros de RMN ¹³C (Tabela 1) e RMN ¹H além do pico do íon molecular registrado em m/z 602 no espectro EMIE sugeriram a fórmula molecular C₃₉H₅₄O₅ para a substância 8. O espectro de RMN ¹H desta substância apresentou também os sinais em d 7,61 e d 6,30, característicos para o sistema carbonílico a,b-insaturado com configuração trans (d, J = 15,9 Hz). Foi ainda observado o par de dubletos integrado para dois hidrogênios cada em d 7,43 e d 6,85 (J = 9 Hz) indicativos de anel aromático para-dissubstituído. Este conjunto de dados foi sugestivo da esterificação da unidade triterpênica com o ácido p-cumárico. Os sinais do espectro de RMN ¹³C quando comparados com os valores da literatura confirmaram a presença da unidade p-cumaroíla¹⁴. Esta informação foi corroborada pelo espectro de massas, cujo pico base foi o fragmento em m/z 147, típico da unidade p-cumaroíla. No espectro de RMN ¹³C além dos sinais da unidade p-cumaroíla, pode-se observar a presença da carboxila de ácido na posição C-28, através do sinal em d 181,7. A comparação com os valores de RMN ¹³C da literatura empregando dois modelos de triterpenos como referência, respectivamente o ácido betulínico e 3-b-acetiloxi-lup-20-(29)-eno¹⁰ permitiu propor a estrutura da substância 8 como sendo o ácido 3-b-O-trans-p-cumaroil-lup-20(29)-eno-28-óico.

A substância 9, semelhantemente à substância 8, apresentou no espectro de RMN ¹H sinais que caracterizavam a unidade p-cumaroíla esterificada com um triterpeno. Foram também observados no espectro de RMN ¹H sinais característicos de substância contendo esqueleto triterpênico. Entretanto, o sinal em d 5,20 do hidrogênio olefínico H-12 foi indicativo do esqueleto urseno. No espectro de RMN ¹³C verificou-se, além dos deslocamentos químicos referentes à unidade p-cumaroíla, a presença dos sinais característicos dos carbonos olefínicos dos triterpenos do grupo urseno em d 125,4 (C-12) e d 138,1 (C-13). Da mesma forma que o observado para a substância 8, a presença do íon molecular registrado em m/z 602 no espectro de massas sugeriu a fórmula molecular C₃₉H₅₄O₅, corroborando a informação que o triterpeno estava esterificado com o ácido p-cumárico. Este espectro mostrou ainda o pico base em m/z 147, típico da unidade p-cumaroíla. A comparação com os valores de RMN ¹³C da literatura empregando como modelos o ácido 3-b-O-trans-p-cumaroil-2a-hidroxi-urs-12-en-28-óico e acetato de a-amirina permitiu propor a estrutura da substância 9 como sendo o ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-urs-12-eno-28-óico.

O primeiro estudo realizado com o caule de um espécime de M. guianensis coletada em Demerara - Georgetown (Guiana) relata o isolamento de 3-oxo-21b-H-hop-22(29)-eno (moretenona) e ácido 3-acetilaleuritólico⁵. Neste reestudo a partir do caule de um espécime coletado na Bahia (Brasil) não foi isolado o ácido 3-acetilaleuritólico e apenas a presença do 3-oxo-21a-H-hop-22(29)-eno ou moretenona, foi coincidente. Entretanto, além de 1, foram isolados b-sitosterol, lupenona e lupeol e a mistura dos E-ferulatos de dodecosila (2), tetracosila (3), hexacosila (4), octacosila (5), triacontila (6), bem como os ácidos 3-b-acetoxi-lup-20(29)-eno-28-óico (7), 3b-O-trans-p-cumaroil—lup-20(29)-eno-28-óico (8) e 3b-O-trans-p-cumaroil-urs-12-eno-28-óico (9). A ocorrência de triterpenos esterificando ácido benzóico e derivados de ácido cinâmico parece ser comum em espécies do gênero Maprounea, tendo sido também registrada em M. africana e M. membranacea¹⁵.

O extrato hexânico do caule de Maprounea guianensis não apresentou atividade citotóxica (DL > 1000), enquanto que os extratos clorofórmico e acetato de etila apresentaram 90% e 100% de atividade, respectivamente. As substâncias 1-9 apresentaram DL₅₀ > 1000, mostrando-se inativas. Substâncias que apresentam LD₅₀ > 1000 µg/mL são consideradas inativas e as substâncias que apresentam LD₅₀£ 100 µg/mL são muito ativas, comparáveis à camptotecina e ao sulfato de vincristina. As substâncias medianamente ativas são comparáveis ao ácido hipúrico e apresentam DL₅₀³ 100 µg/mL, no intervalo entre 100 e 900 µg/mL⁹.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES e ao CNPq pelas bolsas e auxílio financeiro.

REFERÊNCIAS

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Recebido em 20/3/03; aceito em 13/6/03

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Mar 2004
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Aceito
  13 Jun 2003
• Recebido
  20 Mar 2003