Triterpenos de Styrax camporum (styracaceae)

Triterpenes from Styrax camporum (styracaceae)

Resumo

Chemical investigation of the leaves of Styrax camporum (Styracaceae) resulted in the isolation of the lignan lariciresinol and six triterpenes: ursolic acid, 2alpha,3alpha-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid and mixtures of uvaol and erythrodiol, as well as 3beta-O-trans-p-coumaroyl-2alpha-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid and 3b-O-trans-p-coumaroylmaslinic acid. The structures of these compounds were established by spectroscopic analysis. This paper deals with the first report of these compounds in S. camporum.

Styrax camporum; Styracaceae; triterpenes

Styrax camporum; Styracaceae; triterpenes

Artigo

TRITERPENOS DE Styrax camporum (STYRACACEAE)

Patrícia Mendonça Pauletti, Angela Regina Araújo e Vanderlan da Silva Bolzani

Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, CP 359, 14800-900 Araraquara - SP

* e-mail: [e-mail]

Maria Claudia Marx Young

Secção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica, CP 4005, 01061-970 São Paulo - SP

Recebido em 27/11/00; aceito em 20/12/01

TRITERPENES FROMStyrax camporum (STYRACACEAE). Chemical investigation of the leaves of Styrax camporum (Styracaceae) resulted in the isolation of the lignan lariciresinol and six triterpenes: ursolic acid, 2a,3a-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid and mixtures of uvaol and erythrodiol, as well as 3b-O-trans-p-coumaroyl-2a-hydroxy-urs-12-en-28-oic acid and 3b-O-trans-p-coumaroylmaslinic acid. The structures of these compounds were established by spectroscopic analysis. This paper deals with the first report of these compounds in S. camporum.

Keywords:Styrax camporum; Styracaceae; triterpenes.

INTRODUÇÃO

Styracaceae inclui espécies de plantas predominantemente arbóreas,¹ distribuídas em áreas distintas do continente americano, sudoeste da Ásia e região mediterrânea². Nas Américas, ocorre desde a região central dos Estados Unidos até o norte da Argentina. A família é bastante conhecida pela produção de resinas balsâmicas cujo nome genérico é benjoin, sendo o ácido benzóico o constituinte predominante das mesmas^3,4. Na indústria de perfumes e cosméticos, o benjoim é a matéria prima principal para a obtenção do ácido benzóico; na medicina tradicional, devido às suas propriedades expectorantes é utilizado como coadjuvante para inalação das vias respiratórias. Nas cerimônias religiosas da antiguidade foi muito apreciado como defumatório, pelos sacerdotes hebreus e da Índia ^3,4.

Styrax camporum Pohl é conhecida pela população brasileira como "benjoeiro", "cuia-do-brejo", "canela-poca", "fruta-de-pomba" e "pinduíba". A planta adulta pode atingir uma altura média de 6-10 m e diâmetro do tronco de 30-40 cm. No Brasil, ocorre nos cerrados de Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso do Sul e Paraná na floresta semidecídua da bacia do Paraná⁵.

Dados fitoquímicos de espécies de Styrax registram a ocorrência de lignanas, norlignanas^6-15 e triterpenos^15-18 como constituintes predominantes no gênero. Em ensaios preliminares, visando a detecção de atividade antitumoral, o extrato bruto das folhas dessa planta apresentou atividade inibidora do crescimento de linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae (Rad+, Rad 52Y e RS 321) que perderam a capacidade de regenerar o DNA. O presente trabalho descreve o isolamento de uma lignana e seis triterpenos pentacíclicos inéditos para o gênero. Para um deles, o ácido 2a,3a-diidroxi-urs-12-en-28-óico, foi observada atividade inibidora seletiva da linhagem 52Y de S. cerevisiae, indicando ação específica no DNA. A norlignana egonol, já relatada para a espécie¹⁹, também foi isolada.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Investigação fitoquímica das folhas de Styrax camporum Pohl resultou no isolamento do lignóide lariciresinol (1) e de seis triterpenóides: ácido ursólico (2), ácido 2a,3a-diidroxi-urs-12-en-28-óico (3) e as misturas de uvaol (4) e eritrodiol (5) bem como as do ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-2a-hidroxi-urs-12-en-28-óico (6) e ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-maslínico (7). As substâncias 1, 3, 4, 5, 6 e 7 estão sendo identificadas pela primeira vez neste gênero.

As estruturas destas substâncias foram elucidadas a partir dos dados obtidos por análises espectroscópicas de RMN ¹H e ¹³C, experimentos DEPT 90° e 135°, COSY , IV e EM. Comparação dos registros na literatura para as substâncias obtidas neste estudo foram fundamentais para a confirmação de suas estruturas moleculares e atribuições de suas estereoquímicas relativas.

Os espectros de RMN ¹H e RMN ¹³C, experimento COSY ¹H -¹H e EM-ES permitiram identificar a substância 1 como sendo o (+)-lariciresinol ([a]_D²⁵ = + 8,89^o )^20-22.

Análise dos espectros de RMN de ¹H e ¹³C permitiram identificar a estrutura do triterpeno 2 como o ácido ursólico^23,24.

O triterpeno 3 apresentou bandas em 3400 (OH) e 1700 cm^-1 (carbonila) no espectro de IV. O espectro de RMN de ¹H de 3 mostrou sinais em 5,20 d (1H, t, J= 3,5 Hz, H-12), característicos de hidrogênio olefínico, em 3,90 d (1H, m, H-2) e 3,36 d (1H, sl, H-3) relativos aos hidrogênios carbinólicos, além de sinais em 0,72-1,25 d e 1,34-2,34 d, que foram atribuídos aos hidrogênios metílicos, metilênicos e metínicos, respectivamente. Exame dos dados de RMN ¹³C (Tabela 1) permitiram definir o esqueleto de um triterpeno do tipo ursano, principalmente pela presença dos sinais em 124,7 d e 138,0 d relativos à ligação dupla entre os C-12 e C-13. Entre outros, os sinais em 65,6 d e 78,2 d correspondem a dois carbonos hidroximetínicos em C-2 e C-3. A comparação dos dados de RMN de ¹³C de 3 com os valores registrados na literatura, levaram a concluir que a substância 3 é o ácido 2a, 3a-diidroxi-urs-12-en-28-óico²³.

O espectro de RMN de ¹H de 4 e 5 permitiu a visualização de sinais em 5,13 d (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12) e 5,07 d (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12), característicos de hidrogênios olefínicos de triterpenos, em 3,14 d (4H, dd, J = 11,0 Hz e 3,7 Hz, H-28) e 3,48 d (2H , dd, J_a-a= 10,8 Hz e J_a-e= 4,2 Hz, H-3) relativos aos hidrogênios carbinólicos. Observaram-se também duas regiões espectrais muito complexas em 0,73 - 1,25 d, com sinais que foram atribuídos a grupos metílicos e em 1,32-1,82 d que correspondem a hidrogênios metilenicos e metínicos. Os pares de sinais de RMN ¹³C (Tabela 1) em 125,0 d e 138,7 d e em 122,3 d e 144,2 d , característicos de carbonos olefínicos, confirmaram a presença de uma mistura de triterpenos ursano e oleano. Análise dos dados de RMN de ¹³C e comparação de dados da literatura para substâncias análogas ^23,25,26 levaram a concluir que a mistura é formada pelos triterpenos uvaol e eritrodiol.

O espectro de RMN de ¹H de 6 e 7 apresentou sinais em 7,65 d (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7'), 7,40 d (2H, d, J = 7,4 Hz, H-2' e H-6'), 6,85 d (2H, d, J = 7,4 Hz, H-3' e H-5'), 6,33 d (1H, d, J = 16,0 Hz, H-8'), relativos a hidrogênios aromáticos pertencentes a uma unidade p-cumaroíla. Os demais sinais em 5,20 d (1H, sl, H-12) característicos de hidrogênio olefínico e vários sinais entre 0,83 - 1,94 d indicaram a natureza triterpênica desta substância. O sinal em 4,63 d (1H, d, J_a-a = 9,9 Hz, H-3) foi atribuído ao H-3 e encontra-se mais desblindado devido à esterificação com o ácido p-cumárico. Os sinais do espectro de RMN ¹³C (Tabela 1) em 125,3 d, 138,1 d, em 121,9 d e 143,8 d, característicos de ligações duplas, confirmaram a presença de uma mistura de triterpenos do tipo ursano e oleano. Aos carbonos C-2 e C-3 foram atribuídos os valores de 66,0 d e 84,1 d, respectivamente. A fórmula molecular C₃₉H₅₄O₆ foi confirmada pelos dados de RMN ¹³C e EM-ES. O espectro de massas apresentou os seguintes picos: m/z 658 [M+K+H]⁺ (22%), m/z 642 [M+Na+H]⁺(100), íon RDA: m/z 247 (15%), m/z 203 (33%), m/z 164 (4%), m/z 147 (63%) e m/z 119 (25%).

Essas informações permitiram identificar 6 e 7 como o ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-2a-hidroxi-urs-12-en-28-óico e ácido 3b-O-trans-p-cumaroil-maslínico ^{23, 27}.

A norlignana com atividade antifúngica, 5-(3"-hidroxifenil)-2-(3´,4´-metilenodioxifenil)-7-metoxibenzofurano, conhecida como egonol, foi identificada através da comparação de seus espectros de RMN com aqueles obtidos para uma amostra autêntica ¹⁵.

Pesquisa bibliográfica sobre a constituição química de Styracaceae revelou a presença marcante de arilpropanóides monoméricos, lignóides ^6-15 e triterpenóides ^15-18 . O gênero Styrax , o mais importante da família e com maior volume de informações, caracteriza-se pelo acúmulo de norlignóides do tipo benzofurânicos, uma vez que os mesmos foram isolados em todas as espécies do gênero investigadas até o momento . A presença de triterpenos do tipo oleanano e ursano em S. officinalis ¹⁶ e S. japonica ^17-18 não se configura como um dado químico relevante para análise quimiotaxonômica, devido à baixa variabilidade estrutural observada para estes metabólitos encontrados nas duas espécies acima mencionadas, assim como à baixa ocorrência dos mesmos nos táxons afins estudados.

As substâncias 1-7 foram ensaiadas nas três linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae sendo que o triterpeno 3 apresentou inibição moderada do crescimento da linhagem 52Y. Embora a atividade observada para 3 seja fraca, ela foi seletiva para um dos mutantes deficientes nas vias de reparo de DNA, indicando especificidade sobre o mesmo ²⁸. Outro dado bastante significativo deste resultado é que este é o primeiro registro da atividade de triterpenos sobre o reparo de DNA. Os demais triterpenos isolados mostraram-se inativos

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentação e material cromatográfico

Os espectros de RMN foram registrados em CDCl₃, DMSO-d₆ e piridina-d₅ no espectrômetro Bruker Ac-200 F operando a 200 MHz para ¹H e 50 MHz para ¹³C, respectivamente, usando TMS como padrão de referência. Os experimentos de COSY, DEPT 90^o e 135^o foram realizados em espectrômetro Bruker Ac-200 F. O espectro de absorção no IV foi obtido no espectrômetro PERKIN ELMER- FT-IR, utilizando-se pastilhas de KBr. Os espectros de massas foram registrados em espectrômetro de massas de baixa resolução FISONS-Modelo VG Platfform II, no modo Eletrospray. Nas análises por CCDC e CCDP foram utilizadas placas de sílica gel 60 G F₂₅₄ . As placas foram observadas sob luz UV 254 - 366 nm (Chromatovus) e reveladas com vapores de iodo ressublimado e solução de anisaldeído seguido de aquecimento. Nas cromatografias em coluna foram utilizadas sílica gel 60 G 230 - 400 e 70 - 230 mesh. A atividade óptica foi medida no Polamat A (Carlzeiss Jena).

Material vegetal

A espécie vegetal Styrax camporum Pohl foi coletada na Estação Ecológica e Experimental de Mogi-Guaçú-SP em dezembro de 1997. A exsicata do material vegetal encontra-se depositada no Herbário do Instituto de Botânica da Secretaria do Meio Ambiente de São Paulo-SP.

Bioensaio

Para a detecção de atividade antitumoral em extratos e substâncias puras, foram utilizadas três linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae ( rad+, 52Y e RS321) segundo a metodologia descrita na literatura²⁸.

Extração

As folhas de S. camporum (1770,30 g) foram secas, pulverizadas e extraídas exaustivamente com etanol, à temperatura ambiente. Após a remoção do solvente sob vácuo, foram obtidos 404,27 g do extrato bruto etanólico. Este foi solubilizado em CH₃OH : H₂O (8:2) e extraído sucessivamente com hexano, CHCl₃ e AcOEt. Após a concentração dos solventes, cada extrato originou 3,36 g, 16,8 g e 28,86 g, respectivamente.

O resíduo CHCl₃ (16,8 g) foi fracionado em uma coluna de sílica gel eluída com : Hexano; Hexano:CHCl₃ (1:1); CHCl₃; AcOEt:CHCl₃ (1:1); AcOEt; CH₃OH:AcOEt (1:1) e CH₃OH. Desta coluna resultaram 10 subfrações.

A subfração 3 (4,68 g) foi submetida a uma coluna de sílica gel 60 G empregando gradiente de CH₂Cl₂:CH₃OH. Desta coluna foram separadas 7 subfrações. A subfração 3.4 (2,68 g) foi recromatografada em coluna de sílica gel 60 G usando gradiente de CH₂Cl₂:CH₃OH, fornecendo 17 subfrações. A subfração 3.4 (4-6) (389,7 mg) foi fracionada em coluna de sílica gel 60 G usando gradiente de CH₂Cl₂:CH₃OH. Desta coluna resultaram 33 subfrações. A subfração 3-9 (202,9 mg) foi fracionada em coluna de sílica gel 60 G usando gradiente de Hexano:CHCl₃:AcOEt (9:1). Assim, foram obtidas 39 subfrações, sendo que da subfração 24-28 foram isoladas as substâncias 4 e 5 (33,6 mg) e da subfração 29-30, egonol (19,8 mg). Da subfração 3.4 (10) (127,3 mg) foi isolada a substância 2 (42,3 mg), após lavagem com CH₃OH. A subfração 3.4 (17) (304,0 mg) foi fracionada em coluna de sílica gel 60 G usando gradiente de Hexano:CHCl₃:AcOEt (9:1). Desta coluna foram obtidas 17 subfrações. A subfração 2-4 (211,9 mg) foi fracionada em coluna de sílica gel 60 G usando gradiente de CH₂Cl₂:CH₃OH. Esta coluna forneceu 55 subfrações. Da subfração 41-47 (38,2 mg) foram isoladas as substâncias 6 e 7 e da subfração 38-40 (53,5 mg) foi identificada a substância 3, após coluna de sílica gel 60 G usando gradiente de CH₂Cl₂:CH₃OH na subfração 26-27 (32,4 mg).

A fração 4 (1,33 g) foi submetida a uma coluna cromatográfica usando sílica gel 60 G e gradiente de CH₂Cl₂:CH₃OH como eluente em ordem crescente de polaridade. Foram obtidas 47 subfrações. A substância 1 foi isolada da subfração 4 (26-29), após coluna de Sephadex LH-20 utilizando CH₃OH como eluente.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao programa Biota-FAPESP, CNPq e CNPq-PRONEX pelas bolsas e auxílios concedidos.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Ago 2002
• Data do Fascículo
  Maio 2002

Histórico

• Recebido
  27 Nov 2000
• Aceito
  20 Dez 2001