Histologia mamária após uso de esteróides sexuais - estudo em ratas

Breast histologic changes in female rats treated with sex steroids

ARTIGO ORIGINAL

Histologia mamária após uso de esteróides sexuais - estudo em ratas

Breast histologic changes in female rats treated with sex steroids

José Tadeu Vicelli; Maria Salete Costa Gurgel^*; Marcelo Alvarenga

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar as alterações histológicas em mamas de ratas submetidas à terapêutica com estrogênio, progestogênio e tibolona.

MÉTODOS: Estudo experimental com 40 ratas, sendo 20 sem prole (grupo A) e 20 com prole (grupo B). Todas as ratas foram castradas e, após quatro semanas, alocadas aleatoriamente em subgrupos: A1, A2, A3, A4, A5 e B1, B2, B3, B4, B5. Os esteróides foram administrados da seguinte forma: A1 e B1 – benzoato de estradiol; A2 e B2 – acetato de medroxiprogesterona; A3 e B3 – benzoato de estradiol e acetato de medroxiprogesterona; A4 e B4 - tibolona; A5 e B5 - placebo. Após dez semanas de tratamento, os animais foram sacrificados e suas glândulas mamárias submetidas à análise histológica. Os parâmetros avaliados foram: proliferação epitelial, atividade secretora e atipias epiteliais nas unidades de ductos ou alvéolos terminais. A associação entre os achados histológicos e os esquemas terapêuticos foi avaliada por meio do odds ratio e intervalo de confiança de 95%.

RESULTADOS: Alterações histológicas foram observadas em 29 ratas: hiperplasia moderada (52,5%), hiperplasia alvéolo-nodular (42,5%), atipia sem proliferação (35%), hiperplasia leve (32,5%), atividade secretora (20%) e hiperplasia severa (5%). Em ratas sem prole observou-se 1,3 mais chance, em relação ao grupo controle, de apresentar hiperplasia alvéolo-nodular no grupo que recebeu estrogênio, hiperplasia moderada no grupo tratado com progestogênio, e hiperplasia alvéolo-nodular e atipia sem proliferação epitelial com a associação entre estrogênio e progestogênio.

CONCLUSÃO: Hiperplasia moderada e atipia epitelial associaram-se à terapia combinada de estrogênio e progestogênio, e o antecedente de prole reduziu a ocorrência destas alterações e de hiperplasia alvéolo-nodular.

Unitermos: Mama. Proliferação epitelial. Esteróides sexuais. Atipia epitelial.

SUMMARY

OBJECTIVE: To evaluate the association of histologic changes in the breasts of female rats undergoing therapy with sex steroids.

METHODS: An experimental study was conducted of 40 castrated female non-pubertal rats, 20 had given birth (Group B) and 20 had no offspring (Group A). After four weeks, these rats were randomly allocated to subgroups: A1, A2, A3, A4, A5 and B1, B2, B3, B4, B5. Steroids were given to subgroups as follows: A1 and B1 – estradiol benzoate; A2 and B2 – medroxyprogesterone acetate; A3 and B3 - estradiol benzoate and medroxyprogesterone acetate; A4 and B4 – tibolone; A5 and B5 - placebo. After 10 weeks of treatment, animals were sacrificed and their mammary glands were analyzed. Histologic parameters evaluated were: epithelial cell proliferation, epithelial cells with secretory activity; and cell atypia in terminal duct units and buds or terminal alveoli. The association between microscopic analysis and diverse therapeutic regimens were analyzed by calculating the odds ratio and its respective 95% confidence interval.

RESULTS: Histologic changes were observed in 29 rats: moderate hyperplasia (52.5%), hyperplastic alveolar nodule (42.5%), epithelial atypia (35%), mild hyperplasia (32.5%), secretory activity (20%) and severe hyperplasia (5%). In rats with no offspring when compared to the control, 1.3 times more hyperplastic alveolar nodules were found in the group treated with estradiol, the same was true for moderate hyperplasia in the rats that received medroxyprogesterone acetate, hyperplastic alveolar nodules and epithelial atypia in the group treated with estradiol plus medroxyprogesterone acetate. In the rats with offspring 1.3 times more secretory activity was found with estradiol.

CONCLUSION: Epithelial hyperplasia and epithelial atypia with no proliferation are strongly associated to combined therapy with estradiol plus medroxyprogesterone acetate, mainly in the rats without offspring.

Key words: Breast. Epithelial proliferation. Sex steroids. Epithelial atypia.

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, estudos demonstraram os benefícios da terapia hormonal (TH) no climatério, representados pelo alívio de sintomas, prevenção e tratamento da atrofia urogenital e da osteoporose^1,2,3. A despeito dos benefícios da TH, o seu uso pode apresentar alguns efeitos indesejáveis, como o aumento do risco de câncer de mama^4,5,6. Existem diversos esquemas de TH, porém os mais utilizados são o uso exclusivo de estrogênio ou a associação deste com progestogênio.

Além destes esteróides, a tibolona - um esteróide sintético - vem sendo utilizada para o tratamento dos sintomas climatéricos, possuindo ações estrogênica, progestogênica e androgênica⁷. Estudos experimentais demonstraram que, in vitro, a tibolona reduz a proliferação de células mamárias e a produção de estradiol⁸, enquanto in vivo reduz o volume tumoral de carcinomas mamários⁹. Contudo, estudos de coorte demonstraram aumento do risco relativo para desenvolvimento de câncer de mama em usuárias de tibolona^6,10. Dessa forma, permanece incerto o papel da tibolona na indução de alterações proliferativas e no risco de câncer de mama.

Hofseth et al. (1999)¹¹, estudando biópsias de mamas de mulheres na pós-menopausa, observaram que a proliferação do epitélio mamário foi maior em usuárias de TH, principalmente em usuárias de estrogênio e progestogênio, quando comparadas a um grupo de não usuárias de TH. Nesse mesmo estudo, verificou-se que a maioria das alterações localizava-se na unidade ducto-lobular terminal, onde se desenvolve a maior parte dos cânceres de mama. Estudos experimentais também verificaram alterações proliferativas nas mamas de ratas ooforectomizadas submetidas a TH¹².

As glândulas mamárias humanas e da rata exibem alterações proliferativas comparáveis quando submetidas a TH, suportando a validade do estudo dessas alterações no modelo murino na pós-menopausa¹². O uso do modelo animal permite a avaliação do efeito direto da TH sobre o tecido mamário, eliminando-se os efeitos de potenciais variáveis confundidoras que podem estar presentes em ensaios clínicos como idade, tempo de menopausa e tempo de uso de TH¹³.

Considerando esses aspectos, realizou-se o presente estudo com o objetivo de avaliar a associação de alterações histológicas epiteliais nas mamas de ratas castradas após tratamento exclusivo com estrogênio, progestogênio e tibolona e com a associação de estrogênio-progestogênio segundo o esquema terapêutico, e se o antecedente de prole interfere nesta associação.

MÉTODOS

Trata-se de estudo experimental, no qual foram utilizadas 40 ratas (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar com 250 dias de vida, sendo que 20 já procriaram e amamentaram suas proles (grupo B), enquanto as outras 20 não tiveram prenhez (grupo A). As ratas foram castradas sob anestesia geral com injeções intraperitoniais de cetamida (Vetaset^R, Fort Dodge Laboratories) e xilazina (Rompum^R, Bayer) ambas na dose de 50mg/kg^14,15, ficando em observação por três semanas a fim de esgotar a ação dos esteróides ovarianos endógenos e entrarem em fase de hipoestrogenismo, permitindo que o tecido mamário fique em repouso¹⁶. O hipoestrogenismo foi confirmado antes do início da terapêutica pela realização de esfregaços vaginais¹⁷.

Os tratamentos hormonais foram realizados por dez semanas, sendo que as dosagens foram calculadas segundo tabela de cálculo halométrico, que converte a dose utilizada em humano para a correspondente na espécie animal utilizada no estudo: 1-benzoato de estradiol (E₂), 37,6 mg/rata/7 dias diluído em óleo de amendoim estéril, que é o veículo original do produto, de tal forma que a dosagem está contida em 0,1ml da solução; 2-acetato de medroxiprogesterona na forma de depósito na dosagem de 11, 28mg/rata/23 dias (AMP); diluído em solução fisiológica, de tal forma que a dosagem está contida em 0,1ml da solução final; 3-benzoato de estradiol (E₂) 37,6 mg/rata/7 dias + acetato de medroxiprogesterona na forma de depósito na dosagem de 11, 28 mg/rata/23 dias (AMP); 4-tibolona, 200mg/rata/dia. Os estrogênios e progestogênios foram administrados por via subcutânea na região dorsal dos animais, uma vez ao dia. A tibolona foi administrada por via oral, uma vez ao dia, diluída em água para ser administrada por gavagem.

Cada animal foi alocado, aleatoriamente, em dez subgrupos de quatro ratas (A1, A2, A3, A4, A5 e B1, B2, B3, B4, e B5) e assim designados segundo o tipo de tratamento:_. A1 e B1 – benzoato de estradiol e placebo para o AMP (solução fisiológica); A2 e B2 – acetato de medroxiprogesterona e placebo para E₂ (óleo de amendoim); A3 e B3 – benzoato de estradiol e acetato de medroxiprogesterona; A4 e B4 – tibolona e placebo (óleo de amendoim e solução fisiológica); A5 e B5 – placebo (solução fisiológica e óleo de amendoim).

Os animais permaneceram no biotério do Laboratório de Pesquisas Bioquímicas do Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) em caixas com iluminação de 12 horas/dia e temperatura constante, além de água e alimentação ad libitium. Os quatro animais de cada subgrupo foram mantidos em uma única caixa com cuidados diários e limpeza. Ao final de dez semanas, todas as ratas foram sacrificadas em câmara de CO₂¹⁸. Em seguida foram dissecadas e removidas as segundas glândulas mamárias torácicas, juntamente com a pele que as recobre. Todo o material obtido foi imediatamente fixado em formalina a 10%, tamponado (pH 7,4) e enviado ao Laboratório de Patologia Experimental do CAISM/ Unicamp. Após 24 horas de fixação, o tecido mamário foi recortado, submetido ao processamento histológico, incluído em blocos de parafina e recortado em micrótomo de 4m de espessura, colocado em várias lâminas e corado pela técnica de hematoxilina–eosina (HE).

Foram avaliados todos os blocos correspondentes à totalidade das mamas de cada rata pelo mesmo patologista, sem que este conhecesse a terapêutica a que cada rata havia sido submetida; utilizou-se um microscópio Nikon E 200 com objetiva de 40 vezes. Foram analisados a proliferação epitelial e atipias celulares nas unidades de ductos terminais e os brotos ou alvéolos terminais, sendo que o exame foi realizado baseando-se em um sistema de graduação histopatológico para anomalias epiteliais induzidas por 7,12-dimetilbenzantraceno (DMBA) em tecido mamário de fêmeas de ratos. O sistema de graduação histopatológica referente à hiperplasia epitelial e células epiteliais com atividade secretora seguiu critérios padronizados e estabelecidos previamente¹⁹, e foi classificado conforme a seguinte descrição: normal; atipia sem proliferação epitelial; HEB 1 - hiperplasia epitelial da unidade ductal terminal lobular leve; HEB 2 – hiperplasia epitelial da unidade ductal terminal lobular moderada; HEB 3 - hiperplasia epitelial da unidade ductal terminal lobular severa; HAN - hiperplasia alvéolo-nodular; atividade secretora em células epiteliais. Para a análise dos dados foram feitas tabelas de contingência e calculado o odds ratio com respectivo intervalo de confiança de 95%, sendo utilizado o programa de computador SAS, 2001.

Este estudo seguiu as normas da Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) do Instituto de Biologia (IB) da Unicamp, sendo aprovado pelo protocolo de nº 651-1.

RESULTADOS

Ao final de dez semanas de terapia hormonal ou placebo, 29 ratas apresentaram alterações epiteliais focais em suas glândulas mamárias, sendo: hiperplasia epitelial da unidade ductal terminal lobular leve ou HEB 1 em 13 casos (32,5%), hiperplasia epitelial da unidade ductal terminal lobular moderada ou HEB 2 em 21 casos (52,5%), hiperplasia epitelial da unidade ductal terminal lobular severa ou HEB 3 em dois casos (5%), hiperplasia alvéolo-nodular ou HAN em 17 casos (42,5%), atipia sem proliferação epitelial em 14 casos (35%) e atividade secretora (AS) em oito casos (20%). Onze ratas (27,5%) apresentavam mamas histologicamente normais ao final do estudo (Figura 1).

Analisando as alterações histológicas segundo o antecedente de prole e de acordo com o esquema terapêutico, observou-se que, no grupo sem prole, no subgrupo tratado com E2, todas as ratas desenvolveram HEB 2 ou 3, HAN e um caso apresentou atipia epitelial sem proliferação. No subgrupo tratado com AMP isoladamente, todas as ratas apresentaram HEB 2, três delas atipia sem proliferação epitelial, dois casos de HAN e dois casos de atividade secretora. No subgrupo tratado com a associação de estrogênio e progestogênios, todas as ratas desenvolveram HEB 2 ou 3, HAN e atipia sem proliferação epitelial. No subgrupo tratado com tibolona, observaram-se duas ratas sem alterações mamárias e as outras duas apresentaram HEB 2, atipia sem proliferação e atividade secretora. No grupo placebo, três ratas apresentaram apenas foco único de HEB 1 (Tabela 1).

Analisando as alterações histológicas observadas no grupo com prole (grupo B), notamos que, com o tratamento exclusivo com estrogênio, sete ratas desenvolveram HEB 1 ou 2 e quatro delas apresentaram atividade secretora. Nenhuma atipia celular foi observada. As ratas tratadas com AMP exclusivo apresentaram padrão semelhante em relação às HEB, porém houve três casos de HAN e uma rata desenvolveu atipia sem proliferação epitelial. Já no subgrupo tratado com associação de estrogênio com progestogênios, observaram-se índices de 100% para a HEB 2, HAN e atipia sem proliferação. As ratas tratadas com tibolona desenvolveram apenas HEB 1 em três casos e 100% das ratas no subgrupo placebo tinham mamas histologicamente normais (Tabela 1).

Ao se avaliar as chances de desenvolvimento das alterações histológicas segundo o esquema terapêutico, observou-se que dentre as ratas sem prole (grupo A), aquelas expostas isoladamente ao E2 tiveram, pelo menos, 1,3 mais chance de desenvolver HAN em comparação ao grupo controle. Aquelas submetidas à terapêutica com AMP isolado tiveram aumento da chance de mesma magnitude para desenvolvimento de HEB 2. Já as ratas tratadas com E2 + AMP tiveram aumento significativo, e de mesma magnitude, para o desenvolvimento de atipias sem proliferação epitelial e HAN. O subgrupo tratado com tibolona não apresentou aumento da chance de desenvolver qualquer alteração histológica mamária em relação ao grupo controle (Tabela 2). A mesma análise feita no grupo de ratas com prole (grupo B) demonstrou haver associação entre a terapêutica de estrogênio e progestogênios combinados com a presença de atividade secretora nas células epiteliais (Tabela 3).

DISCUSSÃO

No presente estudo houve associação do uso de esteróides sexuais com proliferação e atipias epiteliais e, ainda, atividade secretora celular, alterações essas observadas em animais que receberam terapia isolada com estrogênios ou progestogênios, embora o maior efeito tenha sido observado com a combinação de ambos. Estas alterações epiteliais, apesar de se basearem em anomalias induzidas por DMBA em tecido mamário de fêmeas de ratos¹⁹, têm sido utilizadas na maioria dos estudos in vivo que utilizam o modelo murino^12,20.

É possível fazer uma analogia entre as alterações descritas nas mamas de ratas com as observadas na mama humana. A HEB, graduada em leve, moderada e grave ou severa, corresponderia na mulher: HEB 1 a hiperplasia ductal típica (HDT) leve, alteração considerada sem risco para câncer invasor; a HEB 2 a HDT moderada, alteração considerada de risco leve (duas vezes) para o câncer invasor; e a HEB 3 a hiperplasia ductal atípica (HDA), lesão associada a risco cinco vezes aumentado para o câncer invasor da mama²¹.

Observou-se, também, a presença de atipias celulares sem proliferação epitelial ainda não descritas em ratas, muito semelhantes às alterações designadas de atipia plana na mama humana. Esta entidade é caracterizada por células epiteliais nativas constituídas em camadas simples ou por três a cinco camadas e com atipias leves. Segundo a classificação da Organização Mundial da Saúde, seria uma lesão intermediária entre a HDT e HDA²¹.

A atipia epitelial plana tem sido denominada por outros patologistas como alteração ou hiperplasia de células colunares com atipias^22-23 ou ainda CAPSS – columnar alteration with prominent apical snouts and secretions²⁴ (alteração colunar epitelial com secreção do tipo decapitação²⁵). Atualmente, o nível de risco para o desenvolvimento de carcinoma invasivo associado com estas lesões é desconhecido. No entanto, já foi verificado que o risco relativo das lesões colunares em geral foi 2,08 vezes maior que os controle e, para as lesões colunares com atipia, o risco foi de 2,32²⁶.

A hiperplasia alvéolo-nodular (HAN), lesão epitelial caracterizada por área nodular bem delimitada, constituída de grupamentos de dúctulos e alvéolos terminais, cujas células apresentam citoplasma vacuolizado semelhante a células apócrinas, apesar da denominação "hiperplasia", acredita-se que reflita atividade secretora. É alteração descrita apenas em ratas e sem correspondência na mama humana¹⁹. No entanto, estudos mais recentes em modelo murino evidenciaram associação dessa entidade com o carcinoma mamário induzido por DMBA, podendo ser considerada como potencial lesão precursora de neoplasias²⁷.

Estudos prévios sobre a ação dos esteróides sexuais em mamas de ratas utilizaram doses variadas e muitas vezes elevadas²⁸. Como se sabe, o estrogênio pode ser mitogênico em doses elevadas²⁹. Essa pesquisa objetivou descrever as alterações histológicas nas mamas submetidas a doses análogas às usadas por mulheres climatéricas, por meio de cálculo halométrico, equacionando a dose de acordo com o peso e o metabolismo animal^30-31. Além disso, as ratas foram selecionadas de tal forma que o número de ciclos estrais correspondessem aos da mulher no menacme.

Neste estudo houve associação dos estrogênios com a hiperplasia das células epiteliais mamárias. Isto ficou demonstrado no grupo de ratas que usou estrogênio apresentando muito mais HEB que o grupo controle. Não se observou associação dos estrogênios isoladamente com atipias celulares em qualquer dos grupos de animais, com ou sem prole, embora na literatura existam estudos que evidenciam ação genotóxica do 17 B estradiol sobre as células mamárias^32,33.

Em estudos experimentais com modelos animais observou-se que a progesterona não é protetora da carcinogênese mamária, evidenciando a ausência de bloqueio da atividade proliferativa estrogênica por ação do progestogênio, aliada ao estímulo proliferativo epitelial^11,34,36. Observou-se, ainda, maior atividade mitótica na fase lútea^29,37,38.

Os resultados deste estudo mostram que o progestogênio, quando utilizado isoladamente, também causou aumento da atividade proliferativa celular mamária equivalente ao grupo que usou estrogênio. Isso leva a inferir que o progestogênio potencializaria o efeito estrogênico e que não haveria necessidade da ação estrogênica prévia para sua ação. Estudos prévios observaram que a administração de progestogênio induz maior proliferação de células acinares e atividade mitótica, à semelhança da ação estrogênica, propondo que o estrogênio atuaria estimulando a proliferação celular e o progestagênio faria o mesmo, além de induzir a diferenciação quando há ação estrogênica^39,40,41,42.

Os esteróides sexuais, mesmo que acarretem a diferenciação celular ao estimularem a atividade proliferativa mamária, podem propiciar alterações carcinogenéticas, celulares. Assim, se os processos de proliferação e diferenciação mamária ocorrerem antes da ação do agente carcinogênico, diminui-se a chance de desenvolvimento do câncer no futuro⁴³. Isto explicaria o fato do AMP administrado em ratas na fase puberal diminuir o risco de desenvolvimento tumoral, enquanto a administração após essa fase não propicia o mesmo efeito protetor⁴⁴. O mesmo explicaria a proteção conferida pela primeira gestação a termo em idade precoce. Neste estudo, o fato de ter prole parece ter influenciado de forma protetora a resposta celular aos esteróides sexuais.

A tibolona, neste estudo, não mostrou associação com hiperplasia ou atipia epitelial mamária. Esses resultados encontram respaldo em estudos sobre a ação da tibolona em células mamárias normais obtidas de mastoplastia redutora, de mulheres com idade inferior a 25 anos. Após sete dias sob ação da tibolona, ocorreu lenta diminuição na taxa de proliferação das células epiteliais⁴⁵.

Muito embora este estudo tenha objetivado avaliar as alterações histológicas em mamas submetidas à terapêutica hormonal, podemos inferir que a proliferação celular, assim como as atipias encontradas com a associação de estrogênios e progestogênios e com estrogênios isolados, possam estar relacionadas com risco aumentado para câncer de mama.

A maior contribuição deste estudo talvez seja a de subsidiar outras informações relativas à ação destas substâncias sobre o tecido mamário normal e, com isso, nortear a escolha terapêutica das mulheres na menopausa. Discutem-se atualmente esquemas com associações progestogênicas trimestrais ou quadrimestrais, visando minimizar a exposição a este grupo de esteróide⁴⁶; baixas dosagens de esteróides sexuais e associações de estrogênio com progestogênios de ação específica para seus receptores, e isso deve ser encarado como um incentivo à pesquisa e à disponibilização de substâncias que poderiam agir como progestogênios no endométrio e não na mama, ou seja, seriam moduladores seletivos de receptores de progesterona, à semelhança dos moduladores seletivos de receptores de estrógeno⁴⁷.

CONCLUSÃO

A hiperplasia epitelial e atipia sem proliferação epitelial associaram-se, mais intensamente, à terapia combinada de estradiol e acetato de medroxiprogesterona, principalmente no grupo de ratas sem antecedente de prole.

Conflito de interesse: não há

Artigo recebido: 11/05/2005

Aceito para publicação: 06/03/2006

Trabalho realizado no Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher (CAISM) da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) e defendido como Tese de Doutorado pelo Departamento de Tocoginecologia da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Dez 2006
• Data do Fascículo
  Out 2006

Histórico

• Recebido
  11 Maio 2005
• Aceito
  06 Mar 2006