Utilização de parâmetros morfoanatômicos na análise da fitotoxidez do flúor em folhas de Magnolia ovata (A. St.-Hil.) Spreng. (Magnoliaceae)

Use of morphoanatomic parameters in the analysis of fluoride toxicity in leaves of Magnolia ovata (A. St.-Hil.) Spreng. (Magnoliaceae)

Utilização de parâmetros morfoanatômicos na análise da fitotoxidez do flúor em folhas de Magnolia ovata (A. St.-Hil.) Spreng. (Magnoliaceae)

Use of morphoanatomic parameters in the analysis of fluoride toxicity in leaves of Magnolia ovata (A. St.-Hil.) Spreng. (Magnoliaceae)

Bruno Francisco Sant'Anna-Santos^I; Reinaldo Duque-Brasil^I; Aristéa Alves Azevedo^I; Alice de Souza Silveira^I; João Marcos de Araújo^II; Rosane Aguiar^I

^IDepartamento de Biologia Vegetal da Universidade Federal de Viçosa (UFV), 36570-000 Viçosa,MG, Brasil

^IIDepartamento de Biologia Geral da UFV

RESUMO

Com os objetivos de avaliar o grau de suscetibilidade e caracterizar as injúrias na morfoanatomia de folhas de Magnolia ovata, mudas foram submetidas à chuva simulada com flúor (10 µg.ml^-1 de F^-) por 10 dias consecutivos. No tratamento controle, utilizou-se apenas água deionizada. Folhas foram coletadas para quantificação de flúor na matéria seca e fixadas para análises em microscopia de luz e eletrônica de varredura. As folhas apicais apresentaram pequena porcentagem de necroses intervenais e marginais em uma ou ambas as faces e maior acúmulo de flúor, em relação ao controle, quando comparadas com as folhas da porção basal. A análise micromorfológica das folhas aparentemente sadias indicou alterações nas paredes periclinais externas da epiderme e formação de concavidades, além de cristas estomáticas danificadas, erosão de ceras epicuticulares e presença de esporos e hifas de fungos. A caracterização estrutural das injúrias evidenciou retração de protoplasto das células epidérmicas, colapso das células do mesofilo e da epiderme e acúmulo de compostos fenólicos em células das regiões necrosadas. As alterações micromorfológicas das folhas ocorreram antes que sintomas fossem observados, o que comprova a importância da micromorfologia na diagnose precoce da injúria. As plantas de M. ovata apresentaram poucos sintomas visuais em resposta ao flúor, entretanto as alterações morfoanatômicas indicam que essa espécie possui potencial para ser utilizada como bioindicadora.

Palavras-chave: Flúor, anatomia foliar e Magnolia ovata.

ABSTRACT

This work aimed to evaluate the degree of susceptibility and characterize the injuries caused by fluoride in the morphoanatomy of Magnolia ovata. Seedlings were subjected to fluoride simulated rain (10 µg.ml^-1 of F^-) during 10 consecutive days. In the control treatment, only deionized water was used. Leaves were collected for quantification of fluoride in the dry weight and fixed for light and scanning electron microscopy analyses. The apical leaves presented a small percentage of interveinal and margin necrosis in one or both leaf surfaces and greater fluoride accumulation, in relation to the control, than the basal portion leaves. Micromorphological analyses indicated that the areas apparently healthy of epidermis presented alterations in the external periclinal walls and formation of concave shapes, beyond damaged stomatic ledge, erosion of epicuticular waxes and presence of spores and fungal hyphae. The structural characterization of the injuries showed retraction of the protoplast of the epidermal cells, collapse of the mesophyll and epidermal cells and accumulation of phenolic compounds in cells of the necrotic regions. The micromorphological variations occurred before leaf symptoms, confirming the importance of micromorphology in early diagnosis of the injury. Plants of M. ovata presented few visible symptoms in response to fluoride; however, morphoanatomic responses suggest that this species possesses potential features to be used as a bioindicator.

Keywords: Fluoride, leaf anatomy and Magnolia ovata.

1. INTRODUÇÃO

O flúor encontrado na atmosfera, principalmente sob a forma de ácido fluorídrico (HF), apresenta grande fitotoxicidade (SMITH e HODGE, 1979) e pode ser liberado na atmosfera durante a produção de alumínio, tijolos, vidros e aço (FORNASIERO, 2001). A concentração de flúor na precipitação atmosférica varia entre 1 e 1000 µg.L^-1, podendo atingir 10 mg.L^-1 em áreas industriais (ARNDT et al., 1995). No Brasil, apesar de serem poucos os dados sobre a concentração de flúor na atmosfera, siderúrgicas e usinas alimentadas a carvão estão incluídas entre as principais fontes de emissão (DOBBS, 1974).

No Brasil, a água da chuva é afetada pela emissão de poluentes em regiões metropolitanas, como as do Rio de Janeiro e São Paulo (KLUMPP et al., 1994; MELLO, 2001), sendo algumas zonas industriais, como a do Vale do Aço em Minas Gerais, definidas como áreas de preocupação ambiental (JORDÃO et al., 1996). Mesmo em países desenvolvidos, com grande redução na emissão de fluoretos, injúrias na vegetação causadas pelo flúor ainda são muito comuns, devido à sua grande fitotoxicidade, justificando a seleção de espécies vegetais bioindicadoras (WEINSTEIN e DAVISON, 2003).

Algumas espécies capazes de tolerar a presença de poluentes, denominadas biosensores, reagem discretamente aos efeitos da poluição, sem sintomas visuais, sendo, dessa forma, fundamental a detecção de alterações utilizando-se técnicas microscópicas (DE TEMMERMAN et al., 2004). Já as espécies muito sensíveis, ou bioindicadores, reagem visualmente à ação de poluentes (DE TEMMERMAN et al., 2004). Entretanto, análises micromorfológicas e anatômicas podem auxiliar o diagnóstico precoce da injúria, antes do surgimento de sintomas visíveis (SILVA et al., 2000; SANT'ANNA-SANTOS et al., 2006a).

A análise qualitativa dos parâmetros morfoanatômicos vem sendo utilizada na determinação da sensibilidade das espécies vegetais a poluentes atmosféricos (SILVA et al., 2000; FORNASIERO, 2001; SOUKUPOVÁ et al., 2001; CHAVES et al., 2002; FORNASIERO, 2003; SILVA et al., 2005a,b; SANT'ANNA-SANTOS et al., 2006b). Alterações na estrutura dos órgãos vegetais provocadas por agentes estressantes têm sido verificadas (GAO et al., 1988; BURROWS et al., 1992; PAPADAKIS et al., 2004; TUFFI SANTOS et al., 2005), evidenciado-se que as análises quantitativas auxiliam na identificação dos efeitos negativos da poluição atmosférica (SOUKUPOVÁ et al., 2001).

No Brasil estão sendo realizados estudos visando determinar a resposta e o grau de sensibilidade de plantas nativas aos poluentes atmosféricos, com o intuito de selecionar espécies como bioindicadoras da qualidade do ar (WEINSTEIN e HANSEN, 1988; ARNDT et al., 1995; SILVA et al., 2000; DOMINGOS et al., 2004).

Magnolia ovata, popularmente conhecida como baguaçu, alcança até 30 m de altura, e sua madeira é empregada na indústria de caixotaria pequena, além de apresentar características ornamentais que a recomendam para o paisagismo. Adaptada a terrenos brejosos, cresce normalmente em solo inundado, razão por que é indicada para reflorestamentos mistos destinados à recomposição da vegetação em áreas ciliares degradadas (LOBO e JOLY, 1995; LORENZI, 2002). Estudos que avaliem a suscetibilidade de M. ovata a poluentes se justificam em face da ocorrência dessa espécie em florestas do Sudeste brasileiro, em áreas sujeitas à poluição atmosférica (MELLO e ALMEIDA, 2004).

A caracterização de sintomas ocasionados por fatores estressantes, de natureza biótica e, ou, abiótica, é, em geral, negligenciada em vários trabalhos de fisiologia, o que tem limitado a utilização dos sintomas visíveis de injúria para diagnóstico do fator de estresse (VOLLENWEIDER et al., 2003; VOLLENWEIDER e GÜNTHARDT-GOERG, 2005). Objetivou-se, neste estudo, caracterizar o efeito do flúor em folhas de plantas de M. ovata, por meio de parâmetros morfológicos e de sua correlação com as alterações anatômicas, contribuindo com informações sobre a sensibilidade da espécie.

2. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Espécie e condições de cultivo

Foram utilizadas mudas de Magnolia ovata St. Hill (Magnoliaceae), com cerca de 23 cm de altura e seis meses de idade, fornecidas pelo Viveiro do Instituto Estadual de Florestas (VIEF). As plantas foram cultivadas em substrato utilizado no VIEF (Tabela 1). Todas as plantas receberam solução nutritiva de Hoagland a ¼ de força (HOAGLAND e ARNON, 1950) a cada cinco dias, seguindo a metodologia proposta por Silva et al. (2005b).

O experimento foi realizado na Unidade de Crescimento de Plantas, da Universidade Federal de Viçosa, (UFV) em Viçosa, MG, localizada a 649 m de altitude, 20^° 45' 20" de latitude sul e 42^° 52' 40"de longitude oeste. O clima da região é tropical de altitude, tipo Cwb, com verões brandos de temperatura média do mês mais quente inferior a 22⁰C (KÖEPPEN, 1948).

2.2. Tratamentos

O experimento de simulação seguiu metodologia proposta por Silva et al. (2000). As plantas de M. ovata foram expostas por 10 dias consecutivos e períodos de 20 min/dia à chuva com flúor e água (controle), totalizando 18,7 mm/dia de precipitação em uma câmara de simulação, com sistema de "spray", adaptada do modelo proposto por Evans et al. (1977). O tratamento com flúor foi preparado adicionando-se fluoreto de potássio em água deionizada (10 mg.L^-1) e o controle – somente água deionizada (pH=6,0). Antes e após os tratamentos, as plantas ficaram expostas sob um painel luminoso composto por oito lâmpadas incandescentes de mercúrio (E-27, 220-230 volts, 250 watts) por 15 min sob densidade de fluxo radiante de 95 W.m^-2. As plantas de M. ovata foram mantidas em condições ambientais (Figura 1) durante o experimento (28 de julho a 6 de agosto de 2004). Após a chuva, todas as folhas foram fotografadas, com o objetivo de documentar as modificações visíveis ocasionadas pelo poluente.

2.3. Determinação do teor de flúor

Para a quantificação do conteúdo de flúor foram coletadas folhas da região apical (1^º ao 3^º nó a partir da gema apical) e basal (4^º ao 6^º nó) das plantas de M. ovata, 24 h depois da aplicação da última chuva. As amostras foram previamente secadas em estufa, a 70 °C, e reduzidas, em moinho do tipo Wiley, a partículas com dimensões inferiores a 1 mm. Posteriormente, alíquotas de 0,5 g, de cada repetição, foram submetidas à extração com ácido perclórico 0,1 M (GARCIA-CIUDAD et al., 1985), utilizando-se o ajustador de força iônica (LARSEN e WIDDOWSON, 1971), para determinação potenciométrica do teor de flúor, com eletrodo específico. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com cinco repetições por tratamento.

2.4. Análise micromorfológica

Folhas jovens (2º nó) e expandidas (5º nó) de cinco plantas foram coletadas 24 h após o término das simulações, fixadas em solução de glutaraldeído (2,5%), paraformaldeído (4%) em tampão cacodilato de sódio pH 7,2 e acrescido de cloreto de cálcio 5 mM (KARNOVSKY, 1965). As amostras de folhas foram pós-fixadas em tetróxido de ósmio 1%, desidratadas em série etílica, e a secagem ao ponto crítico em equipamento apropriado (modelo CPD 020, Bal-Tec, Balzers). Em metalizador (modelo FDU010, Bal-Tec, Balzers), a superfície das folhas foi coberta com ouro e documentada em microscópio eletrônico de varredura com câmera digital (modelo JSMT200, Jeol Co.), do Núcleo de Microscopia e Microanálise da UFV.

2.5. Análise micromorfométrica e estrutural

Para a análise micromorfométrica, cinco lâminas foliares expandidas (5º nó) foram fixadas em FAA (preparado com etanol 70%), desidratadas em série etílica e incluídas em metacrilato (Historesina, Leica Instruments). Para montagem de lâminas permanentes, cortes transversais das folhas, com 4 µm de espessura, obtidos em micrótomo rotativo de avanço automático (modelo RM2155, Leica Microsystems Inc.), foram corados com azul de toluidina pH 4,0 (O'BRIEN e McCULLY, 1981) e montados em Permount. As espessuras do limbo e do mesofilo e a altura das células epidérmicas foram mensuradas nas folhas de M. ovata, utilizando-se o software Image-Pro Plus 4.1; foram realizadas 45 medidas/repetição/parâmetro, totalizando 225 registros. Na comparação estatística das médias dos tratamentos, utilizaram-se a análise de variância e o teste de Tukey a 5% de probabilidade (p<0,05).

Para a caracterização estrutural das regiões das folhas jovens (2º nó) compreendendo a nervura mediana, margem e porção intervenal, amostras foram fixadas em FAA (preparado com etanol 70%), desidratadas em série etílica/butílica e incluídas em parafina histológica. Secções transversais das folhas, com 10 µm de espessura obtidos em micrótomo rotativo (modelo Spencer 820, American Optical Corporation, New York, USA), foram corados com fucsina básica 0,1% durante 60 min e azul de astra 1% por 3 min e montados em Permount. As observações e documentação fotográfica foram realizadas em fotomicroscópio (modelo Olympus AX70TRF, Olympus Optical) com sistema U-Photo.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

A morfologia das folhas de Magnolia ovata (Figura 2) apresentou poucos danos visíveis (0,8% da área) em resposta ao tratamento com flúor com pequenas manchas necróticas intervenais e marginais em uma ou ambas as faces (Figura 2B-E), observada após o quinto dia de tratamento somente em folhas da porção apical de uma planta das repetições.

Os sintomas visíveis nas folhas têm sido empregados no monitoramento do efeito dos estresses abióticos e bióticos (VOLLENWEIDER e GÜNTHARDT-GOERG, 2005), com os primeiros sintomas de cloroses na região marginal e intervenal e necroses ocorrendo em teores de flúor elevados (WEINSTEIN e DAVISON, 2003). Os sintomas causados pelo flúor em folhas de M. ovata foram similares aos observados por Silva et al. (2000) em Gallesia gorazema, Genipa americana, Joannesia princeps, Peltophorum dubium e Spondias dulcis.

As folhas jovens de Pinus contorta são mais sensíveis ao flúor (WEINSTEIN e DAVISON, 2003), conforme observado nas de M. ovata, com as injúrias formadas somente em folhas em desenvolvimento. Entretanto, em folhas de plantas de Hypericum perforatum submetidas pelo sistema radicular ao flúor, as injúrias iniciaram-se em folhas totalmente expandidas, enquanto as em desenvolvimento não apresentaram sintomas visíveis (FORNASIERO, 2001). Silva et al. (2000) submeteram plantas de espécies arbóreas nativas à chuva simulada com flúor, observando maior intensidade de sintomas em folhas jovens de Joannesia princeps e Peltophorum dubium e em folhas desenvolvidas de Spondias dulcis e Gallesia gorazema.

Apesar de plantas de M. ovata não apresentarem danos visuais expressivos, houve acúmulo de flúor na matéria seca das folhas da sua região apical e basal quando expostas ao poluente de 28 e 7,6% maior do que no controle, respectivamente (Tabela 2). O conteúdo de flúor nas folhas das plantas situa-se entre 2-20 µg.g^-1 da sua matéria seca (POSTHUMUS, 1983; KLUMPP et al., 1994), conforme verificado no tratamento controle. Em plantas expostas ao flúor, a quantidade acumulada e o grau de injúria nos tecidos foliares variam com a espécie, idade da folha, características do solo e ritmo de crescimento das plantas (SILVA et al., 2000).

Em microscopia eletrônica de varredura, observou-se que as folhas de M. ovata são desprovidas de tricomas (Figuras 3A-C). No tratamento com flúor, ocorreram alterações na epiderme como a formação de concavidades em certas regiões (Figuras 3B-E), danos nas cristas estomáticas (Figura 3F) e erosão de ceras epicuticulares (Figura 4C), além da colonização da superfície foliar por fungos (Figuras 4D-E) e aglomeração de esporos (Figura 4F). Nas folhas jovens e expandidas sem sintomas, o flúor causou danos severos na superfície epidérmica, evidenciando-se que as alterações micromorfológicas antecedem os danos visíveis e estruturais também relatados em outras espécies arbóreas e herbáceas expostas ao flúor e à chuva ácida (CHAVES et al., 2002; SILVA et al., 2005a,b; SANT'ANNA-SANTOS et al., 2006b). Essas alterações podem estar relacionadas com a possibilidade de atuação do flúor na desestruturação da cutícula e das ceras epicuticulares, facilitando a sua entrada na epiderme e permitindo a invasão por patógenos (HEREDIA et al., 1998).

O mesofilo e a epiderme representam, respectivamente, 83,2 e 16,8% da espessura total da folha de plantas de M. ovata, sem diferença significativa em relação as submetidas ao flúor (Tabela 3). A espécie apresenta folhas dorsiventrais e hipoestomáticas, epiderme unisseriada e idioblastos localizados entre o parênquima paliçádico e o lacunoso (Figura 5A). O sistema vascular apresenta feixes vasculares colaterais com fibras associadas (Figura 5B); na nervura mediana, os feixes se dispõem em círculo, delimitando uma medula parenquimática, com destaque para as fibras de parede lignificada externas ao floema (Figura 5B). Na margem das folhas ocorrem idioblastos com paredes lignificadas (Figuras 5C-D), que se assemelham aos idioblastos traqueoidais descritos por Tucker (1964), para espécies do gênero Magnolia.

A epiderme na região da mancha necrótica tem intensa coloração avermelhada da fucsina e distorções na forma das células (Figura 5F), não observada no controle (Figura 5E). Nas manchas necróticas intervenais, observou-se a condensação do conteúdo celular da epiderme (Figura 6A), o colapso de células da face abaxial da epiderme e o acúmulo de compostos escuros no parênquima lacunoso (Figura 6B). Em outras áreas necróticas, as células epidérmicas apresentam aspecto plasmolisado e conteúdo escuro, e os elementos xilemáticos encontram-se colapsados (Figura 6C). Em áreas aparentemente sadias, as células epidérmicas apresentam retração do protoplasto (Figura 6A), indicando que esse sintoma antecede o colapso celular e o subseqüente acúmulo de compostos escuros, verificado em áreas necrosadas (Figura 6C). Na região da margem da folha também observaram-se condensação do conteúdo celular e diminuição do volume de algumas células epidérmicas (Figura 6E), em contraste com o tratamento controle (Figura 6D).

O estudo anatômico das regiões necrosadas demonstrou que as alterações observadas são similares às encontradas em espécies visualmente mais sensíveis, porém submetidas a concentrações mais elevadas de flúor (SILVA et al., 2000; CHAVES et al., 2002). Os conteúdos escuros intensamente corados pela fucsina, em áreas necróticas das folhas de M. ovata, são atribuídos por Silva et al. (2000) e Chaves et al. (2002), em plantas expostas ao poluente, ao acúmulo de compostos fenólicos como comprovado, por meio de reações histoquímicas específicas, em espécies do gênero Picea (SOUKUPOVÁ et al., 2001). O acúmulo de fenóis tem sido interpretado como um mecanismo de defesa das plantas, ativado por fatores bióticos e abióticos que induzem ao estresse (VAUGHN e DUKE, 1984).

Os sintomas visíveis das folhas da região apical das plantas de M. ovata indicam maior suscetibilidade, provavelmente por acumularem mais flúor. Em algumas espécies vegetais existe relação entre o maior grau de injúria e as taxas elevadas de acúmulo de flúor (KLUMPP et al., 1995; SILVA et al., 2000; FORNASIERO, 2001). Alterações severas foram observadas na superfície das folhas aparentemente sadias, revelando que os sintomas externos são restritivos na avaliação do efeito de substâncias fitotóxicas e para a diagnose de injúrias, como observado em clones de Eucalyptus submetidos à ação do herbicida glyphosate (TUFFI SANTOS et al., 2007).

Os resultados obtidos permitem afirmar que as plantas de M. ovata apresentaram alterações significativas na micromorfologia foliar em resposta ao flúor, mesmo nas folhas sem injúrias visíveis. Pela extensão dos sintomas externos, conclui-se que as plantas da espécie foram levemente injuriadas, mostrando manchas cloróticas e necróticas esparsas. As respostas morfoanatômicas nas folhas, características dos efeitos do flúor, indicam que essa espécie possui potencial como bioindicadora de ambientes impactados pelo flúor.

4. AGRADECIMENTOS

À FAPEMIG (CRA910/02), pelo aporte financeiro, ao Instituto Estadual de Florestas (IEF), pelo fornecimento das plantas; e à Profª Luzimar Campos da Silva, pelas sugestões na redação do texto deste artigo.

5. REFERÊNCIAS

Recebido em 20.10.2006 e aceito para publicação em 29.03.2007

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Set 2007
• Data do Fascículo
  Ago 2007

Histórico

• Aceito
  29 Mar 2007
• Recebido
  20 Out 2006