Efeitos comparativos de vitamina C sobre os efeitos dos anestésicos locais ropivacaína, bupivacaína e lidocaína em condrócitos humanos

Resumos

JUSTIFICATIVA:

Injeções de anestésicos locais por via intra-articular são comumente usadas para melhorar a analgesia no período pós-operatório de cirurgia ortopédica como artroscopia. No entanto, relatos recentes de complicações graves devido ao uso de anestésico local por via intra-articular causou preocupações.

OBJETIVOS:

O objetivo do estudo foi avaliar o uso de vitamina C para reduzir os efeitos adversos dos anestésicos mais comumente usados (ropivocaína, bupivacaína e lidocaína) sobre condrócitos humanos.

MÉTODOS:

A viabilidade dos condrócitos após a exposição à bupivacaína a 0,5% ou ropivacaína a 0,75% ou lidocaína a 1,0% e/ou vitamina C em doses de 125, 250 e 500 µM foi determinada pelo ensaio Vivo/Morto e coloração com anexina V. Os níveis de expressão das caspases 3 e 9 foram avaliados com o uso de anticorpos pela técnica Western blotting. Citometria de fluxo foi feita para analisar a geração de espécies reativas ao oxigênio.

RESULTADOS:

Na exposição aos anestésicos locais, condrotoxicidade foi encontrada na seguinte ordem: ropivacaína < bupivacaína < lidocaína. A vitamina C efetivamente melhorou a redução da viabilidade dos condrócitos e diminuiu os níveis elevados de apoptose após a exposição à anestesia. Em doses mais altas, a vitamina C foi eficiente para reduzir a geração de espécies reativas ao oxigênio e assim regular negativamente a expressão das caspases 3 e 9.

CONCLUSÕES:

Observamos que a vitamina C foi eficaz na proteção dos condrócitos contra a agressão tóxica dos anestésicos locais ropivacaína, bupivacaína e lidocaína.

Condrócitos; Vitamina C; Anestésicos locais; Ropivacaína; Bupivacaína; Lidocaína

BACKGROUND:

Intra-articular injections of local anesthetics are commonly used to enhance post-operative analgesia following orthopedic surgery as arthroscopic surgeries. Nevertheless, recent reports of severe complications due to the use of intra-articular local anesthetic have raised concerns.

OBJECTIVES:

The study aims to assess use of vitamin C in reducing adverse effects of the most commonly employed anesthetics - ropivacaine, bupivacaine and lidocaine - on human chondrocytes.

METHODS:

The chondrocyte viability following exposure to 0.5% bupivacaine or 0.75% ropivacaine or 1.0% lidocaine and/or vitamin C at doses 125, 250 and 500 µM was determined by LIVE/DEAD assay and annexin V staining. Expression levels of caspases 3 and 9 were assessed using antibodies by Western blotting. Flow cytometry was performed to analyze the generation of reactive oxygen species.

RESULTS:

On exposure to the local anesthetics, chondrotoxicity was found in the order ropivacaine < bupivacaine < lidocaine. Vitamin C effectively improved the reduced chondrocyte viability and decreased the raised apoptosis levels following exposure to anesthesia. At higher doses, vitamin C was found efficient in reducing the generation of reactive oxygen species and as well down-regulate the expressions of caspases 3 and 9.

CONCLUSIONS:

Vitamin C was observed to effectively protect chondrocytes against the toxic insult of local anesthetics ropivacaine, bupivacaine and lidocaine.

Chondrocytes; Vitamin C; Local anesthetics; Ropivacaine; Bupivacaine; Lidocaine

Introdução

Os anestésicos locais são comumente usados em várias situações clínicas para a prevenção ou o alívio da dor sintomática. Durante a prática da ortopedia, são administrados por muitas vias, como espinal, epidural ou intra-articular, para o alívio da dor no pós-operatório ou como uma modalidade no tratamento de osteoartrite. Vários estudos clínicos demonstraram que a injeção intra-articular de anestésicos locais tem taxas elevadas de sucesso quando administrada para analgesia no pós-operatório.^1,2and3

A preocupação com os efeitos prejudiciais dos anestésicos locais veio a público quando vários estudos de caso demonstraram toxicidade grave em cartilagem e condrólise após infusões de anestésico local na articulação glenoumeral após artroscopia.^{4, 5, 6,7and8} Como as evidências de condrotoxicidade devido a anestésicos locais estão aumentando, pesquisas sobre o uso de outras substâncias para inibir ou reduzir a toxicidade estão sendo feitas. Em cirurgias ortopédicas, além dos efeitos dos anestésicos locais, a limitação do potencial de cura da cartilagem articular hialina também é problema bem conhecido.⁹

Entre os anestésicos locais que são usados com mais frequência para o alívio da dor, lidocaína e bupivacaína são membros do grupo amida, mas o tempo de ação da lidocaína é cerca de metade daquele de bupivacaína.¹⁰ Ropivacaína é um anestésico local do tipo amino-amida, de ação prolongada, que pertence ao grupo das pipecoloxilididase e é um substituto promissor para bupivacaína para raquianestesia.¹ Contudo, estudos recentes demonstraram os efeitos deletérios desses anestésicos sobre os condrócitos.^{11, 12,13and14} Lo et al.¹⁴ mostraram que bupivacaína, ropivacaína e lidocaína apresentam um efeito negativo de forma dependente da dose e da duração sobre a viabilidade dos condrócitos.

Estudos in vitro mostraram que lidocaína e bupivacaína podem ter efeitos citotóxicos sobre os neurônios e miócitos. A morte celular ocorre tanto por necrose quanto por apoptose. ^{15 and16} Em condrócitos, a exposição a esses anestésicos também leva à morte celular por apoptose e necrose de uma forma dependente da dose e da duração. ^1and17 Fedder et al.¹⁸ relataram que a exposição à ropivacaína, lidocaína e bupivacaína reduziu a viabilidade dos fibroblastos, o que está ligado à geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Apoptose é um processo altamente regulado, diferente de necrose, que ocorre em resposta a trauma, toxinas, citocinas e agentes patogênicos. ^19and20 Portanto, a inibição da apoptose de condrócitos foi descrita como um meio potencial para reduzir a perda de condrócitos. ^20and21

As vitaminas são consideradas vitais. A vitamina C, uma substância exógena solúvel em água,²² é um cofator na construção de vasos sanguíneos e assume o papel de um antioxidante,²³ atua como um doador de elétrons e agente redutor e, assim, impede a oxidação de lípidos, proteínas e DNA.²⁴ Há um reconhecimento crescente da importância de fatores nutricionais para a manutenção da saúde óssea e articular.²⁵ A matriz óssea contém mais de 90% das proteínas, como colágeno,²⁶ e a vitamina C é um cofator essencial para a formação de colágeno e síntese de hidroxiprolina e hidroxilisina.²⁷ Portanto, a vitamina C pode ajudar no fortalecimento dos ossos e prevenir fraturas. Deficiência de vitamina C induzida experimentalmente em animais leva ao dano de massa óssea, cartilagem e tecido conjuntivo.²⁸ Um estudo com acompanhamento por 17 anos conduzido por Sahni et al.²⁹ demonstrou que a suplementação de vitamina C diminui o risco de fratura de quadril e osteoporose. Por conseguinte, considerando os efeitos da vitamina C, o presente estudo investigou se a vitamina C inibe a perda de condrócitos e protege a cartilagem contra os efeitos adversos de anestésicos locais.

Métodos

Produtos químicos e células

Condrócitos humanos normais foram adquiridos da Promocell, Alemanha, e colocados em meio de cultura, sob condições laboratoriais padrão (atmosfera umidificada de 95% de ar e 5% de CO₂ a 37 °C). A cultura de condrócitos em monocamada há muito é usada como um método para a avaliação in vitro de respostas celulares ao tratamento. As células na passagem 5 foram semeadas a uma densidade de 10³ células/cm² em placas de 96 poços e cultivadas até 75-80% de confluência. Ao atingir a confluência desejada, as células foram expostas aos anestésicos locais. Todos os produtos químicos usados no estudo foram obtidos de Sigma-Aldrich, MO, EUA; caso contrário, eles são mencionados.

Exposição anestésica

Os condrócitos foram expostos durante uma hora a 1 mL das soluções dos anestésicos locais bupivacaína a 0,5% ou ropivacaína a 0,75% ou lidocaína a 1,0%.^21and30 Todas as amostras foram tratadas com o uso do mesmo protocolo. Especificamente, o meio de cultura foi aspirado; 1 mL de soro fisiológico normal a 0,9% ou de anestésico foi adicionado a cada poço; as amostras foram incubadas em CO₂ a 5% e a 37 °C por 60 minutos; e a solução de tratamento foi aspirada e o meio de cultura fresco foi adicionado. As amostras foram devolvidas ao incubador e a viabilidade dos condrócitos foi medida 24 horas mais tarde. Em experiências separadas, logo após a exposição à anestesia, as células foram incubadas em meio fresco suplementado com vitamina C (125 ou 250 ou 500 µM) por 24 horas e, em seguida, as células foram avaliadas para a viabilidade.

Análise de apoptose

Os condrócitos expostos aos anestésicos e/ou vitamina C foram lavados com PBS e usados para a análise de viabilidade celular. Para medir a apoptose, o ensaio para a viabilidade celular Vivo/Morto (kit de viabilidade celular Live/Dead, Invitrogen) foi feito. O ensaio detecta a atividade da esterase intracelular e a integridade da membrana plasmática para avaliar a viabilidade das células. Os condrócitos, células tratadas ou não tratadas com anestesia e/ou vitamina C, foram corados com 5 µmol/L de homodímero de etídio e 5 µmol/L de calceína-AM e incubados a 37 °C por 30 minutos. As células foram então analisadas sob um microscópio de fluorescência, Nikon Labophot-2. Os condrócitos vivos retêm a calceína-AM, um corante polianiônico não fluorescente, e produzem uma fluorescência verde por meio da conversão (esterase) enzimática. Subsequentemente, o homodímero de etídio entra nas membranas danificadas das células mortas, liga-se aos ácidos nucleicos e dá origem a uma fluorescência vermelha.

A apoptose também foi detectada por mensuração da perda de assimetria da membrana ao se avaliarem as propriedades de ligação da anexina V. A propriedade de ligação da anexina V foi avaliada com o uso do kit de coloração de anexina V (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Os anticorpos antianexina V foram conjugados com um corante de fluoresceína isotiocianato (FITC). Resumidamente, 1 × 10⁶ células foram expostas à bupivacaína ou ropivacaína ou lidocaína por uma hora após o tratamento com vitamina C, ou apenas aqueles expostos aos anestésicos foram submetidos à coloração com anexina V. As células foram lavadas em PBS, suspensas novamente em tampão de ligação de 100 µL, com anticorpo antianexina V conjugado com FITC, e depois analisadas com citometria de fluxo (FACS Calibur, BD Biosciences).

Western blot

Para saber se a ativação da caspase estava envolvida na iniciação da apoptose após a exposição aos anestésicos locais, uma análise adicional com o método Western blot foi feita para determinar a expressão das caspases 3 e 9, com o uso dos respectivos anticorpos (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA). Para o isolamento das proteínas celulares totais, as células foram lisadas em tampão de lise celular (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA) e processadas de acordo com as instruções do fabricante. As proteínas foram então fracionadas por SDS-PAGE, eletrotransferidas para membranas de nitrocelulose, marcadas com seus respectivos anticorpos e detectadas por quimioluminescência avançada (GE Healthcare). Os sinais da faixa de outras proteínas foram normalizados para os de ß-actina com o uso de anti-ß-actina em diluição de 1:2000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EUA).

Determinação de espécies reativas de oxigênio (ERO)

A geração de ERO intracelular foi medida por citometria de fluxo, com o uso de coloração com 2',7'-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA). DCFH-DA é um composto não fluorescente que pode ser enzimaticamente convertido em DCF, um composto altamente fluorescente na presença de ERO. Após a exposição ao anestésico e/ou vitamina C, as células foram adicionalmente incubadas com DCFH-DA (10 µM) por 30 minutos a 37 °C no escuro. Subsequentemente, as células foram lavadas duas vezes com PBS e a intensidade da fluorescência foi medida por citometria de fluxo.³¹

Análise estatística

Os resultados são representados como média ± DP. Os valores de p < 0,05 foram considerados significativos, conforme determinado por uma análise de variância (Anova). As análises foram feitas com a versão 17.0 do programa estatístico SPPSS.

Resultados

A vitamina C melhora a viabilidade dos condrócitos após a exposição a anestésicos

A viabilidade dos condrócitos em resposta à exposição a anestésico foi analisada com o uso do ensaio Vivo/Morto. Após a exposição das culturas de condrócitos aos anestésicos locais por 24 horas, a condrotoxicidade observada com lidocaína a 1% foi quase duas vezes maior do que a de ropivacaína a 0,75% (Fig. 1). Houve uma diminuição acentuada na percentagem de viabilidade das células após a exposição à lidocaína, ropivacaína ou bupivacaína. Comparando as concentrações equipotentes de ropivacaína (0,75%) e bupivacaína (0,5%), as taxas de viabilidade celular foram significativamente mais elevadas 24 horas após o tratamento com ropivacaína a 0,75% do que com bupivacaína a 0,5%. A condrotoxicidade foi mais pronunciada na exposição à lidocaína seguida por bupivacaína. A exposição à vitamina C após a anestesia resultou em uma melhoria significativa (p < 0,05) na percentagem de viabilidade celular. As contagens viáveis de condrócitos subiram com o aumento das concentrações de vitamina C. A concentração de 500 µM causou um aumento acentuado da viabilidade dos condrócitos, em comparação com doses mais baixas (125 e 250 µM).

Figura 1
Influência de vitamina C sobre a viabilidade celular de condrócitos. Os valores são expressos como média ± DP; n = 6. *Representa p < 0,05, comparado com controles, conforme determinado pela análise de variância simples, Anova.

A apoptose dos condrócitos após a exposição à anestesia também foi detectada por meio da mensuração da perda de assimetria da membrana por coloração com anexina V. A contagem de células em apoptose foi acentuadamente maior (p < 0,05) após a exposição à anestesia. Ropivacaína a 0,75% causou apoptose consideravelmente mais baixa, em comparação com lidocaína a 1% e bupivacaína a 0,5%. A incubação com vitamina C resultou em aumento da percentagem de viabilidade, com contagens diminuídas de células em apoptose. Vitamina C em concentração de 500 µM foi mais potente para reduzir a apoptose após a exposição aos anestésicos locais do que em doses mais baixas (Fig. 2).

Figura 2
Condrotoxicidade induzida por exposição a anestésicos: (a) bupivacaína a 0,5%; (e) lidocaína a 1%; (i) ropivacaína a 0,75%. Vitamina C sobre os efeitos dos anestésicos: (b) bupivacaína a 0,5% + 125 µM de vitamina C; (c) bupivacaína a 0,5% + 250 µM de vitamina C; (d) bupivacaína a 0,5% + 500 µM de vitamina C; (f) lidocaína a 1% + 125 µM de vitamina C; (g) lidocaína a 1% + 250 µM de vitamina C; (h) lidocaína a 1% + 500 µM de vitamina C; (j) ropivacaína a 0,75% + 125 µM de vitamina C; (k) ropivacaína a 0,75% + 250 µM de vitamina C; (l) ropivacaína a 0,75% + 500 µM de vitamina C. Contagens de células em apoptose. Valores apresentados como média ± DP; n = 6. *Representa p < 0,05, comparado com controles, conforme determinado pela análise de variância simples, Anova.

A vitamina C suprime a apoptose por subregulação da expressão das caspases 3 e 9

Para avaliar o possível envolvimento da ativação de caspases em condrotoxicidade induzida por anestesia, a expressão da caspases 3 e 9 foi determinada 24 horas após a exposição à anestesia. Uma hora de exposição aos anestésicos causou sobrerregulação da caspase-3 e da caspase-9 da seguinte forma: lidocaína > bupivacaína > ropivacaína (Fig. 3). Embora ropivacaína a 0,75% tenha causado o aumento da expressão das caspases, verificou-se que esse aumento não foi significativo em relação aos condrócitos controles não expostos aos anestésicos. No entanto, lidocaína a 1% resultou em melhoria acentuada do nível de expressão, o que indica a ativação da cascata de caspases na apoptose. A incubação com vitamina C para 24 horas reduziu acentuadamente a expressão das caspase s de forma dependente da dose, o que está de acordo com os resultados do ensaio Vivo/Morto e da coloração com anexina V. A vitamina C a 250 e 500 µM foi mais eficaz em subregular as expressões das caspases 3 e 9.

Figura 3
Efeito da vitamina C nas expressões da caspase-3 (a e b) e caspase-9 (c e d) em condrócitos após exposição a anestésicos. L1, controle; L2, anestésico isolado; L3, anestesia + 125 µM de vitamina C; L4, anestesia + 250 µM de vitamina C; L5, anestesia + 500 µM de vitamina C. (b e d) Valores apresentados como média ± DP; n = 6 (b e d). *Representa p < 0,05, comparado com controles, conforme determinado pela análise de variância simples, Anova.

Influência da vitamina C na geração de ERO

Determinamos os níveis de ERO por citometria de fluxo com o uso de coloração com 2',7'-diclorofluoresceína diacetate (DCFH-DA). Lidocaína, bupivacaína e ropivacaína causaram um aumento acentuado na produção de ERO. Lidocaína causou uma produção em dobro de ERO, em comparação com ropivacaína, e quase 10% a mais do que bupivacaína. Esse aumento, entretanto, foi suprimido em condrócitos incubados com vitamina C, em comparação com células sem vitamina C. O tratamento com vitamina C reduziu significativamente a produção de ERO, na seguinte ordem: 125 < 250 < 500 µM (Fig. 4). A capacidade antioxidante da vitamina C pode ter sido responsável pela supressão acentuada de ERO.

Figura 4
Influência da vitamina C na geração de ERO por citometria de fluxo. Os valores são apresentados como média ± DP; n = 6. *Representa p < 0,05, comparado com controles, conforme determinado pela análise de variância simples, Anova.

Discussão

Injeções intra-articulares de anestésicos locais são administradas com frequência em ambientes perioperatórios e ambulatoriais.³² As injeções intra-articulares de anestésicos locais melhoram a analgesia no período pós-operatório.^1,2and33 Lidocaína, bupivacaína e ropivacaína são anestésicos locais do tipo amida. Publicações recentes sugeriram potenciais efeitos adversos desses três anestésicos locais sobre condrócitos articulares in vitro. ^1and11

Vários estudos descreveram efeitos prejudiciais de anestésicos locais sobre a viabilidade dos condrócitos. Chu et al.³⁴ demonstraram grave toxicidade de bupivacaína. O estudo evidenciou a exposição à bupivacaína a 0,5% e > 99% dos condrócitos bovinos foram encontrados mortos em todas as culturas expostas. Gomoll et al.³⁵ relataram acentuadas alterações histopatológicas e metabólicas em articulações de coelhos com infusão contínua de bupivacaína a 0,25%, com e sem epinefrina. Relatou-se que doses de lidocaína a 1% e 2% apresentaram toxicidade em condrócitos.¹¹ Além disso, toxicidade em condrócitos foi relatada por Piper e Kim¹ após a exposição de explantes de cartilagem humana e condrócitos aos anestésicos locais bupivacaína e ropivacaína. Corroborando relatos anteriores, em nosso estudo, bupivacaína a 0,5%, ropivacaína a 0,75% e lidocaína a 1% induziram apoptose e reduziram a viabilidade dos condrócitos. Observamos que lidocaína foi potencialmente mais tóxica do que bupivacaína e ropivacaína. Semelhantemente a estudos anteriores, descobriu-se que ropivacaína foi menos condrotóxica do que bupivacaína em condrócitos humanos.^1and36 A vitamina C melhorou de forma significativa a viabilidade celular dos condrócitos. Estudos demonstraram o efeito positivo da vitamina C na saúde dos ossos.²⁹

A apoptose pode ser induzida por meio de vias intrínsecas e extrínsecas, ambas envolvem a ativação de caspases celulares. Caspases são enzimas importantes envolvidas na regulação da clivagem proteolítica altamente específica de proteínas celulares que levam à morte celular. Evidências sugerem que a caspase-3 também pode estar envolvida na fragmentação do DNA.²¹ No nosso estudo, observamos que os anestésicos locais - lidocaína, bupivacaína e ropivacaína - induziram níveis de expressão de caspase que são indicativos de indução de apoptose em condrócitos por meio da ativação de caspases. Perez-Castro et al.¹⁶ demonstraram ativação das caspases 3 e 7 em células do neuroblastoma humano após incubação com lidocaína, ropivacaína e bupivacaína. No entanto, a vitamina C suprimiu a expressão das caspases 3 e 9, o que sugere de forma marcante a sua eficácia antiapoptótica.

Os mecanismos que levam à condrotoxicidade dos anestésicos locais não são totalmente compreendidos. Para analisar o envolvimento da apoptose mediada por ERO, a geração de ERO nos condrócitos foi avaliada. O aumento acentuado na geração de ERO após a exposição aos anestésicos foi reduzido para níveis quase normais nas incubações de condrócitos com várias concentrações de vitamina C. Isso pode ser devido à potente propriedade antioxidante da vitamina C. A vitamina C teria efetivamente impedido a geração de ERO e ou neutralizado as ERO. No entanto, observamos uma correlação surpreendente entre a viabilidade celular, a expressão de caspases e os níveis da produção de ERO. Park et al.³⁷ mostraram um aumento da concentração de ERO em correlação com a morte celular das células de Schwann após incubação com bupivacaína. Em nosso estudo, as concentrações de ERO aumentaram após a exposição à lidocaína e bupivacaína, mas níveis não significativos foram observados após a exposição à ropivacaína. Aumento semelhante na geração de ERO após a exposição a anestésicos locais foi relatado por Grishko et al.³⁸

Para resumir, mostramos que ropivacaína a 0,75%, embora tóxica para as células de condrócitos humanos, após 60 minutos de exposição, está na faixa consideravelmente menor de toxicidade em comparação com bupivacaína a 0,5% e lidocaína a 1%. Entre os anestésicos estudados, lidocaína em concentração de 1% apresentou a maior condrotoxicidade. O aumento da produção de ERO evidenciado em nosso estudo sugere que a condrotoxicidade pode ser devida à apoptose mediada por ERO. Contudo, a incubação com vitamina C ofereceu uma proteção significativa aos condrócitos, que poderia ser atribuída a sua capacidade antioxidante.

Conclusão

A vitamina C forneceu proteção acentuada aos condrócitos contra os efeitos tóxicos dos anestésicos locais: ropivacaína, bupivacaína e lidocaína.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Feb 2016

Histórico

• Recebido
  16 Jan 2015
• Aceito
  26 Jan 2015