Variabilidade genética de genótipos de bananeira (Musa spp) submetidos ao estresse salino

Genetic variability of banana (Musa spp) genotypes subjected to saline stress

MANEJO DE ÁGUA E SOLO

Variabilidade genética de genótipos de bananeira (Musa spp) submetidos ao estresse salino

Genetic variability of banana (Musa spp) genotypes subjected to saline stress

Eline W. F. Gomes^I; Lilia Willadino^II; Luiza S. S. Martins^II; Sebastião de O. e Silva^IV; Terezinha R. Câmara^III

^IUFRPE. Bolsista DCR - CNPq (Programa de Pós-graduação em Botânica-PPGB). CEP 52171-900 Recife, PE. Fone: (81) 33021366. E-mail: [e-mail]

^IIUFRPE. Departamento de Biologia – Fisiologia Vegetal/Genética. CEP 52171-900 Recife, PE, Brasil. Fone: (81) 3302-1366. E-mail: [e-mail]; [e-mail]

^IIIUFRPE. Departamento de Química – Química Vegetal. CEP 52171-900. Recife, PE. Fone: (81) 3302-1366. E-mail: [e-mail]

^IVEMBRAPA, Mandioca e Fruticultura - CNPMF, CP 007. CEP 44380-000 Cruz das Almas, BA. Fone: (75) 6212149. E-mail: [e-mail]

RESUMO

O Brasil é o segundo maior produtor mundial de bananas, sendo Pernambuco o estado que apresenta maior expansão da cultura na região do perímetro irrigado do Vale do São Francisco em cujas áreas, porém, são freqüentes os problemas de salinização do solo o que se pode tornar um fator limitante para a cultura. A utilização de cultivares tolerantes à salinidade apresenta-se como uma alternativa bastante viável; assim, identificar genótipos que se adaptem a solos salinos da Região Nordeste, é de fundamental importância para os programas de melhoramento. Este trabalho teve por finalidade utilizar marcadores moleculares, obtidos por amplificação de DNA via Reação em Cadeia polimerase (PCR) com iniciadores (primers) de RAPD, para determinar a variabilidade genética entre dez genótipos de banana (Musa spp): Pacovan, Nanicão, Caipira, FHIA18, Calcuttá, SN/2, Borneo, M-53, Microcarpa e Lidi, correlacionando-os com a tolerância ao estresse salino. Foram testados 25 primers. O iniciador D0142A07 gerou o maior número de loci polimórficos, enquanto o D0142B05 originou o menor. Em geral, o polimorfismo gerado com os marcadores de DNA mostrou que, apesar da base genética estreita, no caso das que são formadas pelo mesmo grupo genômico, os genótipos de bananeira apresentam variabilidade genética relativamente alta. As variedades que apresentaram maior tolerância ao estresse salino, como a Pacovan e SN/2, mostraram-se distantes geneticamente, quando comparadas com as mais sensíveis ao sal, como Calcuttá e Lidi.

Palavras-chave: salinidade, RAPD, banana

ABSTRACT

Brazil is the second lagest banana producer. The State of Pernambuco has presented the greatest expansion of banana cultivation in the irrigated perimeters of the São Francisco Valley. In these areas, however, there are frequent problems with high salt content in the soil, which could turn out to be a major limiting factor to its cultivation. The utilization of cultivars tolerant to saline conditions is a rather viable alternative. Thus, identifying genotypes that adapt to the saline soil in the northeast region is fundamental for the genetic improvement. The objective of this study was to utilize molecular markers, obtained by the amplification of DNA via PCR with RAPD primers, in order to assess the genetic variability among ten banana genotypes (Musa spp): Pacovan, Nanicão, Caipira, FHIA18, Calcuttá, SN/2, Borneo, M-53, Microcarpa and Lidi, correlating their tolerance to saline stress. Twenty five primers were tested. The D0142A07 primer generated the greatest number of polymorphic loci, while the D0142B05 generated the lowest. In general, polymorphism generated with the DNA markers showed that, despite the narrow genetic base of those formed by the same genomic group, the banana genotypes exhibited a relatively high genetic variability. The varieties of higher tolerance to saline stress, such as Pacovan and SN/2, proved to be genetically distant when compared to the most salt sensitive, such as Calcuttá and Lidi.

Key words: salinity, RAPD, banana

INTRODUÇÃO

A cultura da bananeira (Musa spp) é de grande importância na economia mundial, razão por que é cultivada em mais de 100 países, apresentando produção anual superior a 64 milhões de toneladas. O Brasil é o segundo maior produtor de bananas, produzindo 6,4 milhões de toneladas de frutos numa área colhida de 624 mil hectares (FAO, 2002) e, entre as frutas tropicais, é a que apresenta o mais alto índice de consumo per capita. Na Europa, o consumo é de 9,0 kg por habitante ano enquanto no Brasil é de 20,0, sendo considerada a fruta de maior consumo entre os brasileiros (Souza & Torres Filho, 1999; Rosa Júnior, 2000).

A bananeira é cultivada em todos os Estados brasileiros, sobressaindo-se o Pará como maior produtor, com 771.500 t de frutos, seguido por São Paulo (640.000 t) e Bahia (517.270 t). Pernambuco ocupa a sexta posição, com 360.000 t de bananas produzidas (IBGE, 2002).

Em Pernambuco, a região do perímetro irrigado do Vale do São Francisco apresenta maior expansão da cultura, com 5.500 ha cultivados e uma estimativa, para o ano 2005, de 9.000 ha (França, 1998); no entanto, essas áreas são propícias à salinidade devido ao manejo deficiente do conjunto água–solo, assim como à qualidade da água e, ainda, às condições de alta evaporação e baixa pluviosidade características da região. A salinidade dos solos é um dos fatores limitantes da cultura da bananeira em virtude da diminuição do potencial osmótico da solução do solo e/ou dos efeitos tóxicos de alguns constituintes iônicos sobre os diversos processos fisiológicos das plantas (Marschner, 1990). A utilização de cultivares tolerantes a tais condições tem-se mostrado uma alternativa viável para a utilização de áreas salinizadas, por se tratar de uma opção de baixo custo e retorno imediato ao agricultor.

O programa de melhoramento genético do Centro Nacional de Pesquisa de Mandioca e Fruticultura Tropical da EMBRAPA, objetiva desenvolver genótipos produtivos, resistentes a pragas e doenças, e com ciclo precoce, mediante cruzamentos entre genótipos diplóides (AA), que contribuem com genes de resistência às diversas doenças e com características agronômicas favoráveis, além de genótipos triplóides (AAB) atualmente cultivados no Brasil (Silva et al., 1999). Segundo Silva (2000) os avanços em programas de melhoramento de bananeira por hibridação, seja para obtenção de híbridos comerciais triplóides ou tetraplóides, dependem basicamente da qualidade dos parentais diplóides, em virtude de seu papel fundamental na incorporação de valores agronômicos. Desta forma, identificar genótipos tolerantes à salinidade é de fundamental importância para cruzamentos que visem à obtenção de variedades adaptadas aos solos salinos da Região Nordeste.

A tolerância à salinidade é uma característica controlada por grande número de genes (herança poligênica) que interagem e contribuem, individualmente, com pequeno efeito no fenótipo (Hurkman, 1992; Jain, 1993; Zhu, 2000). Nestas condições, a identificação de marcadores ligados a esta característica, torna-se tarefa difícil, levando-se em conta que a bananeira apresenta um genoma de 537 a 615 Mpb (Lysák, 1999); entretanto, pesquisas em que se utilizaram marcadores moleculares de DNA na caracterização genética de variedades, possibilitam identificação de germoplasma, seleção de progenitores, predição de heterose, mapeamento de caracteres quantitativos e exploração de loci homólogos em outras espécies, através do mapeamento comparativo, o que permitirá, em trabalhos futuros, mapear os genes ligados à tolerância a salinidade em bananeira.

Nos últimos dez anos, técnicas que possibilitam fazer-se distinção diretamente a nível de DNA, têm permitido, também, que se identifique a variabilidade genética dentro do estoque gênico de espécies cultivadas e avaliar a diversidade disponível em bancos de germoplasma. A técnica que se baseia na detecção de polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD), usando-se oligonucleotídeos decâmeros (dez bases), desenvolvida por Williams et al. (1990), Welsh & Mc Clelland (1990) e Caetano-Anollés et al. (1991), tem-se mostrado eficiente na identificação da variabilidade genética em diversos grupos de plantas, motivo pelo qual vem sendo usada como ferramenta auxiliar em programas de melhoramento. Esta técnica é também aplicada para obtenção de mapas genéticos (Carrel, 1999; Lagoda, 1999) e identificação de marcadores moleculares úteis na seleção (Milach, 1998). As vantagens do uso desta tecnologia residem no fato de existir um número praticamente ilimitado desses marcadores, os quais não estão sujeitos a efeitos pleiotrópicos, epistáticos ou ambientais apresentando, assim, vantagens em relação a outros marcadores, como os isoenzimáticos ou morfológicos e podem ser determinados em qualquer tipo de tecido ou estádio de desenvolvimento da planta.

A caracterização molecular da diversidade genética pode fornecer dados úteis ao melhorista para a seleção de indivíduos em programas de melhoramento, possibilitando cruzamentos de materiais divergentes, objetivando-se a maximização da distância genética com a finalidade de recombinar genes, ou complexos gênicos, reunindo-os em novas combinações gênicas favoráveis. Marcadores RAPD foram usados por Gawel & Jarret (1991), Bhat & Jarret (1995), Carneiro (1997) e Paz (2000), dentre outros autores, com vistas a se detectar variabilidade genética entre grupos genômicos de Musa spp.

Howell et al. (1994) investigando a aplicabilidade de marcadores moleculares RAPD na caracterização de nove genótipos de Musa com genomas AA, AAA, AAB, ABB e BB, verificaram alto grau de polimorfismo e constataram que apenas um dos primers usados seria suficiente para caracterizá-los demonstrando, assim, que nem sempre é necessário se utilizar grande número de iniciadores para avaliar a diversidade genética em germoplasma de bananeira.

Com o presente estudo, objetivou-se utilizar marcadores moleculares obtidos por amplificação de DNA via PCR, com iniciadores (primers) de RAPD, para identificar a variabilidade genética entre dez genótipos de banana (Musa spp) correlacionando-os com tolerância ao estresse salino.

MATERIAL E MÉTODOS

Condições de plantio e genótipos avaliados

Implantaram-se dois experimentos para se avaliar o efeito fisiológico-químico de três níveis de NaCl (0, 50 e 100 mM) em genótipos de bananeira, em casa-de-vegetação da Universidade Federal Rural de Pernambuco. O primeiro, envolvendo os genótipos: Calcuttá (diplóide selvagem do grupo genômico AA, muito utilizado em programas de melhoramento); as variedades comerciais Pacovan (triplóide do grupo genômico AAB e pertence ao subgrupo Prata) e Nanicão (triplóide AAA, pertencente ao subgrupo Cavendish); Caipira (triplóide AAA) e FHIA 18 (tetraplóide AAAB) que são cultivares indicadas pela EMBRAPA em virtude das suas características agronômicas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado. No segundo experimento foram avaliados os genótipos diplóides (AA) Calcuttá, Borneo, Lidi, SN/2, Microcarpa e M-53 (Tabela 1) e o delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado.

As mudas, provenientes de cultura de tecido e adquiridas do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) de banana do Centro Nacional de Mandioca e Fruticultura Tropical, da EMBRAPA, foram plantadas em sacos de polietileno contendo 10 kg de areia lavada. A condutividade elétrica da solução nutritiva dos três tratamentos foi monitorada e mantida na faixa de aproximadamente 1,3-1,7; 6,5-6,8 e 11,3-11,7 dS m^-1, correspondendo às concentrações de 0, 50 e 100 mM de NaCl. Utilizou-se irrigação por gotejamento (0,6 L por planta dia) com solução nutritiva composta de 742 mg L^-1 de fertilizante solúvel (marca Kristalon com 3% N, 11% P₂O₅, 38% K₂O, 4% MgO, 11% S e micronutrientes) e Nitrato de Cálcio (marca Barco Viking com 15,5% N e 19% Ca) na dose de 840 mg L^-1 do produto. Após 21 dias de tratamento avaliaram-se os seguintes parâmetros: área foliar e teores de Na⁺ e Cl^- no limbo foliar, pseudocaule e raízes+rizoma.

Análises de RAPD

Extração de DNA: A coleta das terceiras folhas das plantas foi feita aos 21 dias após a diferenciação dos tratamentos. Cerca de 300 mg do limbo foliar foram congelados a -80 ºC e macerados em almofariz de porcelana, em nitrogênio líquido, segundo metodologia adaptada de Doyle & Doyle (1990). Ao material macerado adicionaram-se 800 µL de tampão de extração (contendo CTAB 5%; NaCl 5M; EDTA 0,5M; Tris-HCl 1,0M, pH 8,0; PVP 1%; b-mercaptoetanol e H₂O). As amostras foram aquecidas a 65 ºC, em banho-maria, durante 40 min efetuando-se, em seguida, duas lavagens com clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) para remoção de proteínas, em centrífuga, durante 5 min, a 14.000 rpm; posteriormente, recuperou-se a fase aquosa e se adicionou álcool isopropílico na proporção de 2/3 do volume inicial, para precipitação dos ácidos nucléicos. Após 2 h de repouso a solução foi centrifugada durante 10 min, a 14.000 rpm, cujo precipitado seco foi ressuspendido em 300 µL de tampão TE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM ajustado a pH 8,0) contendo RNAse (40 µg mL^-1), a 37 ºC, por 30 min. O DNA foi então reprecipitado, adicionando-se-lhe NaCl 5M na proporção 1:10 (NaCl : DNA ressuspenso) e 2/3 do volume de isopropanol, incubado a –20 ºC, durante 3 h para, em seguida, ser centrifugado durante 10 min, a 14.000 rpm. O precipitado de DNA seco foi outra vez ressuspenso em tampão TE. A qualidade e a quantidade do DNA extraído foram avaliadas pela eletroforese de 10 µL de solução de cada amostra, em um minigel de agarose a 0,8%, e a 80 V, pelo tempo de 30 min, corado com Brometo de etídio e visualizado em ultravioleta.

Reações de amplificação: Na rotina das análises utilizaram-se volumes finais de 25 µL, que continham os seguintes componentes: DNA (2,5 ng µL^-1); cada um dos desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (0,1 mM); MgCl₂ (2,0 mM); Tris-HCl (10 mM), pH 8,3; um oligonucleotídeo iniciador (0,4 mM) (Gibco BRL) e uma unidade e meia de Taq polimerase (Williams et al.,1990, com modificações). Foram empregados 25 oligonucleotídeos iniciadores, conforme a Tabela 2.

As reações de amplificação foram efetuadas em termociclador M.J. Research, Inc. (USA) PCR, modelo PTC-100, utilizando-se um programa composto por 40 ciclos de uma etapa de desnaturação a 94 ºC, durante 15 s, uma etapa de anelamento do iniciador ao DNA molde a 35 ºC, por 30 s, e uma etapa de extensão a 72 ºC, pelo tempo de um minuto; por fim, utilizou-se um ciclo final de 72 ºC, por 7 min. Os produtos das amplificações foram separados por eletroforese, a 100 V por 4 h, em gel de agarose 1,2%, contendo 10 µg mL^-1 de brometo de etídio, imerso em tampão TBE (Tris-Borato 90 mM; EDTA 1 mM, pH 8,0). As bandas de DNA foram visualizadas sob luz ultravioleta e fotografadas com câmera Polaroid.

Os produtos de amplificação (bandas de DNA) foram tabulados conforme a presença (1) ou ausência (0). As similaridades genéticas entre os genótipos foram estimadas através do coeficiente de Dice (equivalente ao índice de Nei & Li, 1979), no programa NTSYS – pc (Numerical Taxonomy and Multivariater Analysis System, versão 1,70, Exeter software, N.Y., USA). O dendrograma foi construído no programa NTSYS – pc usando-se a opção UPGMA ("Unweighted Pair – Group Method, Aritmetic Average").

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dos vinte e cinco primers testados, vinte e três forneceram produtos nítidos de amplificação (D0142A01, D0142A02, D0142A03, D0142A04, D0142A05, D0142A06, D0142A07, D0142A08, D0142A09, D0142A10, D0142B01, D0142B02, D0142B03, D0142B04, D0142B05, D0142B06, D0142B07, D0142B08, D0142B09, D0142B10, D0238C02, D0238C03, D0238C04) e foram considerados neste trabalho para o cálculo de similaridade genética entre os genótipos. O padrão eletroforético obtido com primers de RAPD é ilustrado na Figura 1.

Primeiro experimento: Caracterização dos genótipos Calcuttá, Pacovan, Nanicão, Caipira e FHIA 18

Foram amplificadas 354 regiões de bandas das quais 7 (1,9%) loci monomórficos e 347 (98,1%) polimórficos obtendo-se, em média, 15,4 loci por primer. O iniciador D0142A07 originou o maior número de loci polimórficos, no total de 22, enquanto o iniciador D0142B05 gerou apenas 7 loci polimórficos.

De acordo com os dados gerados entre os genótipos testados, tomados 2 a 2 (Tabela 3), o par mais próximo geneticamente foi o tetraplóide FHIA 18 e o triplóide Nanicão, com grau de similaridade 0,764 (76,4%), enquanto os mais distantes foram o diplóide Calcuttá e o triplóide Pacovan, com grau de similaridade 0,467 (46,7%).

O dendrograma construído permitiu a identificação de dois grupos, um formado pelo genótipo Calcuttá e o outro composto pelos três subgrupos: Pacovan; Nanicão e FHIA 18; Caipira (Figura 2).

Correlacionando-se os dados do efeito do NaCl nas variedades estudadas (Tabelas 4 e 5) constata-se que a análise de agrupamento separou os genótipos Pacovan, Nanicão, FHIA 18 e Caipira, do genótipo Calcuttá, mais sensível à salinidade e que apresentou elevada redução da área foliar (49,64%) e o maior teor de sódio e cloro nas folhas, no tratamento com 100 mM. Esta variedade apresentou, também, teor de sódio nas folhas, oito vezes superior ao controle, demonstrando ausência de habilidade em regular a concentração de sódio neste órgão.

Com relação ao cloro, ocorreu aumento da concentração deste íon em todos os genótipos, em função do incremento da salinidade, com destaque para o diplóide Calcuttá que apresentou a mais alta concentração de cloro quando submetido ao tratamento com 100 mM. As variedades Pacovan, Caipira e FHIA 18 mantiveram os mais baixos níveis deste ânion nas folhas, no mesmo tratamento. Em função da transpiração, tende a ocorrer acúmulo de íons nas folhas, sobretudo quando o genótipo não possui mecanismos de exclusão dos íons tóxicos. O mecanismo geralmente envolve a compartimentalização dos íons a nível de órgão (raiz) ou a nível celular (vacúolo). Quando a acumulação de íons excede a capacidade de tolerância da planta, ocorrem danos, como cloroses e necroses. Esses sintomas foram observados principalmente na Calcuttá, que sofreu os maiores danos nas folhas e as maiores concentrações de Na⁺ e Cl^- no limbo foliar. No que se refere aos teores de sódio e cloro nas raízes+rizoma e no pseudocaule, praticamente não houve diferença significativa entre os genótipos quando considerado o mais alto nível de NaCl (100 mM).

Segundo experimento: Caracterização dos genótipos Diplóides Calcuttá, Borneo, Lidi, SN/2, Microcarpa e M-53

Os primers utilizados amplificaram 393 loci gênicos, sendo 37 (9,4%) monomórficos e 356 (90,6%) polimórficos. Os iniciadores D0142A04 e D0238C03 geraram maior número de loci polimórficos, no total de 9 loci.

A análise da matriz de similaridade genética e do dendrograma (Tabela 6 e Figura 3) permitiu que se identificassem dois grupos entre os seis acessos avaliados. Grupo I, formado pelos genótipos SN/2, Borneo, Microcarpa e M-53, e grupo II, composto por Calcuttá e Lidi. O grupo II associa os acessos que se apresentaram menos tolerantes ao NaCl, enquanto o grupo I reúne acessos mais tolerantes ao estresse salino. O maior e o menor grau de similaridade genética foram observados entre os acessos Borneo e SN/2 (72,6%) e entre Calcuttá e M-53 (51,2%), respectivamente. Os genótipos Calcuttá e Borneo, ambos originários da Jamaica (Tabela 1), mostraram baixa similaridade genética (54,5%), cujo resultado sugere que os acessos se originam de diferentes locais de coleta.

Cada um dos dois grupos formados pela análise de agrupamento, contém genótipos que compartilham características químicas e fisiológicas. Quanto ao efeito da salinidade sobre o crescimento (Tabela 7), constata-se que o grupo I associou os acessos mais tolerantes ao estresse salino e, conseqüentemente, os que apresentaram no tratamento com 50 mM, menores reduções de área foliar (Borneo e SN/2); o grupo II é formado pelos genótipos mais sensíveis à presença do NaCl que apresentaram as maiores reduções de área foliar.

Quanto ao acúmulo de íons (Tabela 8) constatou-se, no tratamento com 100 mM, que no grupo II se associaram os genótipos (Calcuttá e Lidi) que acumularam mais sódio e cloro no limbo foliar e, ainda, apresentaram sintomatologia de clorose e queima nas folhas. No pseudocaule essas duas variedades apresentaram novamente os maiores teores de sódio, quando submetidas a 100 mM de NaCl.

O alto grau de polimorfismo, detectado com os marcadores de RAPD, está de acordo com os observados por Shepherd et al. (1986), Gawel & Jarret (1991), Howell et al. (1994), Carneiro (1997) e Paz (2000), dentre outros. Bhat & Jarret (1995) afirmaram que a ampla variabilidade entre diplóides selvagens do grupo AA pode ser atribuída ao efeito de repetidas seleções ou mutações nos clones cultivados, que têm resultado em genoma de Musa acuminata, significativamente diferente daquele encontrado em seus ancestrais diplóides. Jarret & Gawell (1995), usando a técnica de RAPD na caracterização de clones de plátanos e na avaliação da diversidade genética entre diplóides de M. acuminata, concluíram que esta técnica pode disponibilizar informações sobre vários aspectos da diversidade genética em germoplasma de bananeira.

Considerando-se o nível de ploidia dos genótipos estudados no primeiro experimento (Figura 1), vê-se que o dendrograma separou o diplóide AA dos demais com nível de ploidia maior. Dos três acessos triplóides, Nanicão (AAA) e Caipira (AAA) se agruparam, apresentando similaridade genética em torno de 66,7% atribuída, provavelmente, à presença do mesmo grupo genômico acuminata (A) presente nos materiais. Quando se comparam os triplóides Pacovan (AAB) com Caipira (AAA) ou Nanicão (AAA), observa-se diminuição no grau de similaridade, indicando que o grupo genômico balbisiana (B), presente na Pacovan, diferencia os genomas das mesmas. A formação de grupos distintos na análise de agrupamento dos genótipos diplóides AA do segundo experimento é função, provavelmente, de mutações existentes nesses genomas, fixadas pelo processo de seleção natural ou resultante de processos de melhoramento genético.

CONCLUSÕES

1. Em geral, o polimorfismo gerado com os marcadores de DNA mostrou que, apesar da base genética estreita, no caso das que são formadas pelo mesmo grupo genômico, os genótipos de bananeira apresentam variabilidade genética relativamente alta.

2. As variedades que apresentaram maior tolerância ao estresse salino, quando comparadas com as mais sensíveis ao sal, mostraram-se distantes geneticamente.

LITERATURA CITADA

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Protocolo 58 - 2/4/2003 - Aprovado em 29/10/2004

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Set 2005
• Data do Fascículo
  Jun 2005

Histórico

• Recebido
  02 Abr 2003
• Aceito
  29 Out 2004