Avaliação da aplicação exógena de poliaminas no crescimento de calos de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes)

Evaluation of exogenous application of polyamines on callus growth of mangaba tree (Hancornia speciosa Gomes)

COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA

PROPAGAÇÃO

Avaliação da aplicação exógena de poliaminas no crescimento de calos de mangabeira (Hancornia speciosa Gomes)¹

Evaluation of exogenous application of polyamines on callus growth of mangaba tree (Hancornia speciosa Gomes)

Chrystiane Borges Fráguas^I; Fabíola Villa^II; Giuseppina Pace Pereira Lima^III

^IEng. Agro. Doutora em Horticultura - UNESP - Dep. Química e Bioquímica - IB - 18618-000 CP. 510 Botucatu - SP e-mail: [e-mail]. Apoio CNPq

^IIEng. Agro. Doutora em Fitotecnia - UFLA - Dep. Agricultura - Universidade Federal de Lavras - Lavras - MG e-mail: [e-mail]

^IIIProfa. Adjunto Instituto de Biociências - UNESP Dep. Química e Bioquímica - IB - 18618-000 CP. 510 Botucatu - SP e-mail: [e-mail]

RESUMO

Este trabalho teve como objetivo estudar o efeito das poliaminas espermidina e espermina no crescimento de calos Hancornia speciosa Gomes. Calos com 0,5 cm de diâmetro foram inoculados em meio Murashige & Skoog (1962) (MS) a 50% + 100 mg L^-1 de caseína hidrolisada + 200 mg L^-1 de levedura de cerveja, variando os tratamentos:A: 1 mmol de espermina + 2 mg L^-1 de 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) + 0,5 mg L^-1 de NAA (ácido naftalenoacético); B: 1 mmol de espermidina + 2 mg L^-1 de 2,4-D + 0,5 mg L^-1 de NAA; C: 2 mg L^-1 de 2,4-D + 0,5 mg L^-1 de NAA. Não houve influência das poliaminas no crescimento dos calos. observou-se, nos calos tratados com espermidina, maior concentração celular de putrescina (582,37 µg g mf^-1) aos 60 dias, maior teor de espermidina (502,54 µg g mf^-1) e espermina (868,53 µg g mf^-1) aos 40 dias de cultivo, quando se aplicou a própria poliamina. Conclui-se que a aplicação exógena de poliaminas em Hancornia speciosa não proporciona aumento no crescimento de calos. A oxidação promovida por longos períodos de cultivo in vitro induz aumento nos níveis de putrescina.

Termos para indexação: cultura de tecidos, mangabeira, putrescina, espermina, espermidina.

ABSTRACT

The effect of polyamines spermine and spermidine in the calluses growth of Hancornia speciosa Gomes was studied. Calluses with 0.5 cm diameter were inoculated in Murashige & Skoog (1962) (MS) medium 50% + hidrolizated casein 100 mg L^-1 + yeast 200 mg L^-1, according to the treatments: A: spermine 1 mmol + 2.4-D 2 mg L^-1 + NAA 0.5 mg L^-1, B: spermidine 1 mmol + 2.4-D 2 mg L^-1 + NAA 0.5 mg L^-1, C: 2.4-D 2 mg L^-1 + NAA 0.5 mg L^-1. There was not polyamine influence in the calluses growth. It was observed in the treated calluses with spermidine larger cellular putrescine concentration (582.37 µg g mf-1) at 60 days, larger spermidine concentration (502.54 µg g mf-1) and spermine (868.53 µg g mf-1) at 40 days of cultivation, when the own polyamine was applied. It was concluded that the exogenous polyamine application in Hancornia speciosa does not provide an increase in the calluses growth. The oxidation promoted by long periods of in vitro cultivation induces an increase in the putrescine levels.

Index terms: tissue culture, mangaba tree, putrescine, spermine, spermidine.

A mangabeira (Hancornia speciosa Gomes) é uma planta originária do Brasil e apresenta ampla dispersão geográfica, ocorrendo em diversos ecossistemas, como Amazônico, Mata Atlântica e Cerrado (Donadio et al., 2002). Apesar do grande potencial apresentado pela mangabeira como planta frutífera e até mesmo como produtora de borracha, e face à inexistência de plantios racionais e tecnificados, o extrativismo apresenta-se, atualmente, como única forma de exploração, constituindo-se, assim, numa grande barreira ao aproveitamento de todas as suas potencialidades.

A forma convencional de propagação desta planta é através de sementes, uma vez que a propagação por estaquia não fornece bons resultados (Espíndola et al., 1993; Vieira Neto, 1994). A utilização da cultura de tecidos para a propagação dessa espécie vem sendo estudada, porém poucos resultados satisfatórios foram relatados, devido às dificuldades intrínsecas da planta. Estudos visando a aumentar o número de brotações in vitro foram realizados por Ribeiro et al. (1998) e Pereira Netto et al. (2003), porém ainda há necessidade da otimização do protocolo para essa espécie.

As poliaminas representam importante papel no estudo da bioquímica e da fisiologia vegetal. Alguns de seus efeitos fisiológicos podem ser citados, tais como crescimento e divisão celular, embriogênese e calogênese, germinação e emergência de plantas, enraizamento e crescimento de plantas, florescimento, senescência, maturação e amadurecimento de frutos (Sena & Castro, 1996). Diversos trabalhos mostram que as poliaminas podem promover o crescimento de células e tecidos, tal como o trabalho de Rajesh et al. (2003), onde relataram que as poliaminas, quando aplicadas durante a indução de calos de Elaeis guineensis, aumentam a embriogênese somática. Tang et al. (2004) observaram que a aplicação isolada de espermidina incrementou a formação de brotações e de raízes a partir de calos em pinheirinho de natal e que esta poliamina, isolada ou combinada com putrescina, pode promover o crescimento de calos.

Lovaas (1996) relata a importância das poliaminas na proteção celular das plantas contra danos oxidativos, pois são geralmente induzidas em resposta à condições de estresse. Tang & Newton (2004) verificaram que o conteúdo de poliaminas, presente nos calos não oxidados de Pinus virginiana, mantevese ao longo dos 35 dias de cultivo, o que não ocorreu nos calos oxidados, demonstrando que as poliaminas foram efetivas em proteger as células e tecidos da oxidação, como também relatado por Debiasi et al. (2007). As poliaminas atuam como colaboradoras na recuperação da oxidação, além de dar condições para melhorar o crescimento, a formação de brotos e o enraizamento em pínus (Tang et al., 2004). Assim, este trabalho teve como objetivo estudar o efeito das poliaminas espermidina e espermina no crescimento de calos Hancornia speciosa Gomes.

Calos com 0,5 cm de diâmetro foram retirados da base das plântulas (cultivadas em meio de cultura MS + 2 mg L^-1 de 6-benzilaminopurina (BAP) + 0,5 mg L^-1 de ácido naftalenoacético (NAA)) e inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) a 50% + 100 mg L^-1 de caseína hidrolisada + 200 mg L^-1 de levedura de cerveja, variando os seguintes tratamentos:A: 1 mmol de espermina (SPM) + 2 mg L^-1 de 2,4-D + 0,5 mg L^-1 de NAA; B: 1 mmol de espermidina (SPD) + 2 mg L^-1 de 2,4-D + 0,5 mg L^-1 de NAA, e C: 2 mg L^-1 de ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) + 0,5 mg L^-1 de NAA.

O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado, com 5 repetições e 5 calos por repetição. A análise estatística foi realizada pelo programa Sisvar (Ferreira, 2000) através do teste de média Skott-Knott. Foram realizadas três avaliações de crescimento (diâmetro), usando um paquímetro digital, a cada 20 dias e, aos 40 e 60 dias de cultivo, foram quantificadas as poliaminas presentes nos calos (putrescina = PUT, espermina = SPM e espermidina = SPD) de acordo com o método proposto por Flores & Galston (1982), modificado por Lima et al. (2006).

A formação dos calos na base dos explantes, cultivados em meio MS + 2 mg L^-1 de BAP + 0,5 mg L^-1 de NAA, iniciou-se aos 15 dias. Quando esses calos atingiram 0,5 cm de diâmetro (aos 30 dias), foram destacados da base das plântulas e inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) a 50% + 100mgL^-1 decaseína hidrolisada+200mgL^-1 delevedura de cerveja, variando os diferentes tratamentos. Em todos os tratamentos, os calos apresentavam uma parte oxidada (20%) (dados não apresentados).

Para o crescimento dos calos (Tabela 1), notase que não houve diferença estatística nem entre os tratamentos, nem durante o período experimental; entretanto, os melhores resultados foram observados nos tratamentos com espermina. Mesmo não ocorrendo diferença significativa, a maior média para diâmetro dos calos (1,366 cm) foi verificada no tratamento com espermina, e a menor (1,132 cm) quando se utilizou espermidina. A diferença entre a aplicação das poliaminas e 2,4-D foi diminuindo ao longo do tempo, como se observou aos 60 dias, quando essa diferença estava em apenas 0,02 cm. Isso, provavelmente, foi devido à possível interação das poliaminas com o 2,4-D, favorecendo o desenvolvimento celular. Galston & Kaur-Sawhney (1990) citam que as poliaminas têm papel vital na mediação da ação de reguladores e divisão celular, entre outras funções.

Bagni et al. (1980) verificaram que os níveis endógenos de poliaminas, em tubérculos dormentes de Helianthus tuberosus, limitavam o crescimento enquanto a aplicação de 2,4-D ativou a biosíntese de poliaminas, síntese de macromoléculas e o crescimento, demonstrando que as poliaminas exógenas podem ser substituídas pela auxina, para esta resposta. Esse crescimento dos calos, promovido pela presença de poliaminas, mesmo em calos oxidados, pode ser atribuído ao efeito protetor das poliaminas quando adicionadas exogenamente, agindo contra o estresse oxidativo (Tang et al., 2004).

O alto valor encontrado para espermina (Tabela 2), aos 40 dias, pode ter sido provavelmente devido à própria poliamina aplicada exogenamente. Nota-se que a aplicação de auxinas (2,4 D + NAA) induziu a aumento no teor dessa poliamina, aos 60 dias, se comparado com os dados obtidos aos 40 dias. o teor observado aos 40 dias (868,53 µg g mf^-1) no tratamento em que se aplicou espermina, pode ser atribuído ao aumento de células, devido ao próprio crescimento, pois tanto espermina como espermidina são substâncias relacionadas diretamente com a divisão celular por estarem envolvidas com o DNA (Flores & Galston, 1982). A diminuição do teor de espermina aos 60 dias, no tratamento com espermina, pode ser devido à conversão dessa poliamina em espermidina ou espermina, já que alguns trabalhos mostram que essa conversão é possível, principalmente em situações de longos cultivos, o que ocasiona um estresse, promovendo geralmente um aumento de putrescina (Agazio et al., 1995).

Verificou-se maior teor de espermidina nos calos (502,54 µg g mf^-1) aos 40 dias de cultivo, quando se aplicou a própria poliamina, semelhante ao encontrado para espermina, diferenciando-se dos demais tratamentos nessa mesma época. Porém, quando comparado com os teores obtidos aos 60 dias, não se constatou diferença estatística entre os tratamentos com espermidina (495,38 µg g mf^-1) e 2,4 D +NAA (484,97 µg g mf^-1). Martin-Tanguy et al. (1988) relatam que a aplicação de 2,4 D e BA em tecidos de Nicotiana tabacum aceleraram o crescimento e ativaram a biossíntese de poliaminas, fato que ocorreu também neste trabalho com a aplicação de 2,4 D + NAA. As enzimas que participam do metabolismo das poliaminas, tais como espermidina sintetase e espermina sintetase, podem ser reguladas pela aplicação exógena de reguladores, tais como auxinas ou cinetinas (Liu et al., 1997). NAA ou cinetina poderiam regular as enzimas do metabolismo de poliaminas através da ativação de genes que codificam essas enzimas (Mcclure & Guilfoyle, 1989).

Aumentos no conteúdo de poliaminas podem ser correlacionados com o crescimento rápido das células (fase log) (Evans & Malmberg, 1989). Neste trabalho, nota-se, pelo comportamento dos calos, que a aplicação de 2,4 D e NAA induziram maiores aumentos no crescimento, quando comparados com as poliaminasaos 60dias.Assim,pode-secorrelacionar o aumento promovido pelas auxinas ao maior teor de espermidina observado, já que esta poliamina está relacionada diretamente com o crescimento, divisão celular e DNA (Bouchereau et al., 1999).

Maior concentração celular de putrescina (582,37 µg g mf^-1) foi observada aos 60 dias de cultivo in vitro, no tratamento com espermidina (Tabela 2), diferindo significativamente do tratamento aos 40 e 60 dias. Esses calos estavam escurecidos, apresentando sinais de oxidação. Esse efeito observado pode ser devido, possivelmente, à época de análise, pois os calos permaneceram no mesmo meio de cultura por dois meses, sem troca, o que pode ter induzido um estresse, causando dessa forma aumento desta diamina. Esse aumento pode ter ocorrido também como uma proteção da planta contra o estresse oxidativo observado nos calos através do escurecimento das células.

Nota-se uma participação das poliaminas usadas no comportamento in vitro de mangaba, já que essas substâncias parecem atuar nos padrões oxidativos de cultura de células e tecidos (Debiasi et al., 2007). A oxidação dos tecidos é uma característica típica em cultura de calos derivados de explantes maduros, na maioria das plantas lenhosas. Esse processo reduz o crescimento de calos e inibe a formação de brotações adventícias (Laukkanen, 1999 e 2000). De forma semelhante, Tang & Newton (2004) observaram que a oxidação reduziu o crescimento dos calos, a formação de brotações e raízes adventícias em Pinus virginiana. Além disso, a aplicação de espermina e espermidina pode ter alterado a rota ABAL (σ-amino butiraldeído), promovendo aumento nos teores de putrescina, como descrito por Agazio et al. (1995), demonstrando que espermidina pode ser convertida a putrescina, e a espermina também pode entrar na rota de interconversão, e as poliaminas não somente atuariam como colaboradoras na recuperação da oxidação, mas também no crescimento, formação de brotos e enraizamento (Tang et al., 2004; Debiasi et al., 2007).

A conversão de espermidina ou espermina para putrescina não tem sido bem demonstrada em plantas (Caffaro et al., 1993; Bouchereau et al., 1999), porém em células animais, fungos e vermes, esta conversão ocorre via acetilespermidina ou acetilespermina, as quais são degradadas por poliaminas oxidases (PAo), que em plantas parece não mostrar atividade para converter espermina e espermidina e seus acetilderivados em espermidina e putrescina, respectivamente (Kobayashi et al., 1983; Wittich et al., 1987; Seiler, 1988; Tiburcio et al., 1997). Esse processo poderia ser relevante na regulação de poliaminas endógenas e, como consequência, em processos fisiológicos envolvendo poliaminas.

A aplicação exógena de poliaminas em Hancornia speciosa não proporciona aumento no crescimento de calos. A oxidação promovida por longos períodos de cultivo in vitro induz aumento nos níveis de putrescina.

Recebido em: 28-07-2008

Aceito para publicação em: 21-08-2009

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1

(Trabalho 199-08).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Fev 2010
• Data do Fascículo
  Dez 2009

Histórico

• Aceito
  21 Ago 2009
• Recebido
  28 Jul 2008