Explantes de cupuaçuzeiro submetidos a diferentes condições de cultura in vitro

Cupuassu explants under diverse conditions of in vitro culture

Explantes de cupuaçuzeiro submetidos a diferentes condições de cultura in vitro¹

Cupuassu explants under diverse conditions of in vitro culture

Ana da Silva LedoI, ²; Osmar Alves LameiraII, ³; Abdellatif Kemaleddine BenbadisIII, ⁴

^IEng. Agr. D.Sc. Embrapa Acre, caixa postal 321 CEP 69.908-970, Rio Branco, AC

^IIEng. Agr. D.Sc. Embrapa Amazônia Oriental caixa postal 48, CEP 66017-970, Belém, PA

^IIIEng. Agr. PhD ³Universidade Federal do Ceará, Campus do PICI, Departamento de Fitotecnia, CEP 60020-181, Fortaleza, CE

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Este trabalho objetivou avaliar as respostas morfogenéticas de diferentes explantes de cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum.) submetidos a várias condições de cultura in vitro. A utilização de 2,4-D nas concentrações de 4,52; 6,78 e 9,05 µM promoveu a formação de calos friáveis em eixos embrionários e o TDZ nas concentrações de 2,0 e 3,0 µM induziu uma alta frequência de calos friáveis e menor oxidação em segmentos de folhas jovens. O 2,4-D combinado com KIN, promoveu a iniciação de calos friáveis e o ANA combinado com KIN, a rizogênese em segmentos cotiledonares. Na presença de 2,26 µM de 2,4-D e 13,94 µM de KIN, houve a formação de calos friáveis em segmentos caulinares. A adição de água de coco, 2iP e ANA estimulou o rápido crescimento e a progressão de culturas de calo em eixo embrionário, segmentos caulinares e segmentos de folhas jovens clorofiladas.

Termos para indexação-Theobroma grandiflorum, calos, reguladores de crescimento

ABSTRACT

This study aimed to evaluate morphogenetic responses of different cupuassu explants (Theobroma grandiflorum Schum.) under diverse conditions of in vitro culture. 2,4-D (4,52; 6,78 and 9,05 µM) promoted the formation of friable calluses in embryonic axes and TDZ (2,0 and 3,0 µM) induced a high frequency of friable calluses and smaller oxidation in segments of young leaves. 2,4-D combined with KIN promoted the initiation of friable calluses while NAA combined with KIN promoted the rhizogenesis in cotyledon segments. In the presence of 2,26 µM 2,4-D and 13,94 µM KIN it was noticed the growth of friable calluses in stem segments. The addition of coconut water, 2iP and NAA stimulated the fast growth of calluses in embryonic axis, stem segments, and chlorophyllous young leaf segments.

Index Terms:Theobroma grandiflorum, calli, growth regulators

O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum.) é encontrado, espontaneamente, nas matas de terra firme e várzea alta, na parte sul e leste do Pará, abrangendo as áreas do médio Tapajós, rios Xingu e Guamá, alcançando a pré-Amazônia maranhense (Cavalcante, 1991). Atualmente, está disseminado por toda a bacia Amazônica e Norte do Maranhão, sendo cultivado na Bahia, Espírito Santo, São Paulo e em outras regiões do País. O maior potencial de exploração da cultura é a produção de polpa para a fabricação de sorvetes, doces, geléias, néctar, licores, compotas, bolos, biscoitos, iogurtes e sucos. Das sementes, pode-se obter o chocolate e também extrair uma gordura semelhante à manteiga de cacau, de alta digestibilidade (Venturieri, 1993).

Plantios desuniformes associados à falta de material genético melhorado têm sido apontados como os principais fatores que limitam a expansão da cultura do cupuaçuzeiro na Amazônia. Instituições de pesquisas na região, nos últimos anos, têm implementado programas de melhoramento com ênfase na seleção de materiais com características de alta produção de frutos, rendimento de polpa e resistência à vassoura-de-bruxa (Crinipellis perniciosa), principal enfermidade da cultura. Neste contexto, a cultura de tecidos, em especial a micropropagação, torna-se uma técnica auxiliar muito valiosa, para clonagem, a curto prazo, de genótipos superiores e para acelerar diversas etapas de programas de melhoramento.

Informações sobre a micropropagação do cupuaçuzeiro são escassas. Os estudos de no gênero Theobroma têm sido direcionados para a espécie Thebroma cacao L., considerada, até há pouco tempo, como a única espécie do gênero cultivada comercialmente.

Alguns trabalhos têm mostrado a capacidade de diferentes explantes de cupuaçuzeiro em formar calos, bem como a diferenciação de estruturas embriogênicas. Em trabalhos conduzidos por Janick & Whipkey (1988), a embriogênese somática indireta foi induzida em embriões imaturos de Theobroma grandiflorum em meio MS semi-sólido com 1 mg.L^-1 de 2,4-D e 10 % de água de coco, entretanto não foi observada a regeneração de plântulas. Avaliando o efeito de auxinas, Ferreira et al. (2001) observaram que a combinação de ANA e 2,4-D induziu a rizogênese e a formação de calos em segmentos de hipocótilo e a água de coco, em meio sem reguladores de crescimento, favoreceu a rizogênese e a calogênese.

O objetivo do presente trabalho foi o de estudar as respostas morfogenéticas de diferentes explantes de cupuaçuzeiro submetidos a várias condições de cultura in vitro.

Foram utilizados explantes obtidos a partir de plântulas assépticas, com 50 dias de idade, obtidas in vitro (segmento caulinar e de folhas jovens clorofiladas) e de embriões zigóticos maduros (eixo embrionário e cotilédones) oriundos de plantas adultas, com 8 anos de idade, da coleção de cupuaçuzeiro da Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA.

Na primeira etapa, os explantes foram inoculados em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) com 0,6 % de ágar, 3 % de sacarose e suplementado com diferentes reguladores de crescimento. Os meios de cultura tiveram o pH ajustado para 5,8 e, em seguida, submetidos à esterilização em autoclave a 120^ºC durante 15 minutos.

Para os eixos embrionários, testaram-se os seguintes reguladores de crescimento adicionados isoladamente ao meio de cultura: ácido naftalenoacético-ANA (10,74; 21,48; 32,22 e 42,96 mM), ácido 2,4-diclorofenoxiacético-2,4-D (2,26; 4,52; 6,78 e 9,05 mM) e tidiazuron-TDZ (1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 mM). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com 12 tratamentos e quatro repetições. Para os segmentos de folhas jovens: TDZ (0; 1,0; 2,0 e 3,0 mM) combinado com 2,4-D (0; 9,05; 18,10 e 27,15 mM), sendo o delineamento inteiramente casualizado, em esquema fatorial 4 x 4 (quatro concentrações de 2,4-D combinadas com quatro de TDZ) e três repetições. Para segmentos cotiledonares: 6-furfurilaminopurina- KIN (11,61; 13,94; 16,26 e 18,59 mM) combinado com ANA (5,37 mM) ou 2,4-D (2,26 mM); e ANA (10,74; 21,48; 32,22 e 42,96 mM) combinado com TDZ (3,0 e 4,0 mM), no delineamento inteiramente casualizado, com 16 tratamentos e três repetições. Para segmentos caulinares: KIN (11,61; 13,94; 16,26 e 18,59 mM) combinado com ANA (5,37 mM) ou 2,4-D (2,26 mM), no delineamento inteiramente casualizado, com oito tratamentos e três repetições.

Na segunda etapa, foi avaliado o efeito da água de coco em culturas de calos friáveis, iniciadas a partir de eixos embrionários, segmentos foliares e caulinares. As culturas de calos friáveis foram repicadas para meio MS com 0,7 % de ágar , 2 % de glicose e pH ajustado em 5,8. Foram testados os seguintes tratamentos: meio MS; meio MS + água de coco (AC); meio MS + AC + 2,69 mM de ANA + 12,30 mM de isopenteniladenina-2iP; meio MS + AC + 5,37 mM de ANA + 12,30 mM de 2iP; meio MS + AC + 8,06 mM de ANA + 12,30 mM de 2iP e meio MS + AC + 10,74 mM de ANA + 12,30 mM de 2iP. A água de coco foi adicionada aos meios na concentração de 100 ml.L^-1. O experimento foi conduzido utilizando o delineamento inteiramente casualizado, com seis tratamentos e quatro repetições.

Em todos os experimentos a unidade experimental foi constituída de dez frascos, contendo um explante cada e avaliaram-se a o número de explantes com respostas morfogenéticas e as percentagens de explantes com calo friável, não friável e embriogênico.

Nos primeiros 15 dias as culturas foram mantidas em sala de crescimento, com temperatura variando de 26^º ± 2^ºC, umidade relativa do ar média em torno de 70%, sob fotoperíodo de 16 horas de luz branca fria indireta (6 µmol.m^-2.s^-1 de irradiância)/oito horas de escuro. Em seguida, o fotoperíodo foi ajustado para 16 horas de luz branca fria direta (52 µmol.m^-2.s^-1 de irradiância)/oito horas no escuro.

As variáveis foram submetidas à análise de variância pelo teste F e as médias foram comparadas pelo teste de Scott & Knott (Scott & Knott, 1974) em nível de 1 % de probabilidade.

Em meio MS suplementado com ANA, foi verificada, aos 20 dias de cultura, a formação de calo branco-translúcido de aspecto esponjoso e não friável sobre a superfície dos segmentos (Figura 1A). Explantes cultivados em meio com TDZ apresentaram o mesmo padrão de resposta morfogenética. Entretanto, na presença de 2,4-D, após a formação de calo não friável, foi observada a iniciação e o crescimento de calo friável em toda a superfície dos explantes aos 25 dias de cultura.

As maiores frequências de calos friáveis foram verificadas aos 30 dias, em meio suplementado com 4,52; 6,78 e 9,05 µM de 2,4-D (Figura 2). Entretanto, observou-se o rápido escurecimento das culturas (Figura 1B). A iniciação e o crescimento de calos em meio com menor concentração de 2,4-D (2,26 µM) foram mais lentos. Ferreira et al. (2001) também observaram maior indução de calos em segmentos de eixos embrionários cultivados em meio MS líquido com maiores concentrações de 2,4-D (4 e 8 mg.L^-1).

O escurecimento de explantes tem sido relatado como uma dificuldade no estabelecimento de culturas in vitro em algumas espécies lenhosas, como consequência de oxidações, provavelmente em decorrência da liberação de compostos fenólicos pelos tecidos em resposta aos ferimentos, altas concentrações de reguladores de crescimento no meio de cultura e pela oxidação de polifenóis e quininas (Pious & Ravindra, 1997). Blake (1983) relata que o meio líquido pode diluir substâncias responsáveis pela oxidação dos explantes. Entretanto, Ferreira et al. (2001) observaram o escurecimento de culturas de calos de T. grandiflorum em meio líquido na ausência de reguladores de crescimento.

Pré-tratamentos dos explantes com ácido cítrico e ácido ascórbico e a adição de substâncias adsorventes ao meio de cultura, como carvão ativado e polivinilpirrolidona, deverão ser considerados em futuros ensaios.

Foram observadas a formação de calo branco-translúcido de aspecto esponjoso e não friável, aos 15 dias de cultura, com crescimento muito lento, na borda e nas nervuras centrais e secundárias dos segmentos de folhas e ausência de calos friáveis na maioria dos tratamentos testados (Figura 1C). Na presença isolada de 1,0; 2,0 e 3,0 mM de TDZ, após a formação de calo não friável, foram verificados a iniciação e o rápido crescimento de calo friável de coloração clara em toda a superfície abaxial e adaxial dos explantes (Figura 1D). As concentrações de 2 e 3 mM de TDZ induziram as maiores frequências de explantes com calos friáveis (Figura 3).

Provavelmente, a formação de calos friáveis em explantes foliares de cupuaçu possa ser dependente da presença de citocininas. Segundo Lu (1993), o TDZ estimula a divisão celular e, consequentemente, o crescimento de calos dependentes de citocininas em algumas espécies. Algumas evidências indicam que o TDZ possa ter atividade auxínica ou estar envolvido no metabolismo de auxinas, conforme relatado por Lu (1993).

Quando o TDZ foi combinado com o 2,4-D não foi observada a iniciação e progressão de calos friáveis, provavelmente devida a rápida oxidação das culturas. Esta hipótese é reforçada pelo fato de que nos explantes inoculados em meio com 1,0; 2,0 e 3,0 mM de TDZ, a percentagem de oxidação foi de 6,7; 3,33 e 3,33 %, respectivamente (dados não mostrados). Em contrapartida, quando o TDZ foi combinado com o 2,4-D a percentagem de oxidação variou de 14,81 a 90,0 % (dados não mostrados). Altos índices de oxidação e baixa eficiência na formação de calos foram observados em discos foliares de T. grandiflorum em meio suplementado com 4,52 mM (Rodrigues, 2000).

Conforme relatado por Mok et al. (1987), o TDZ é resistente às oxidases, estável e biologicamente ativo em concentrações menores que as citocininas tipo adenina. Resultados semelhantes foram obtidos por Flores (1999), que observou menor oxidação de calos em explantes foliares de Fragaria x ananassa Duch. em meio suplementado com TDZ.

A combinação de ANA e KIN, nas concentrações testadas, foi bastante favorável a indução da rizogênese em segmentos cotiledonares. Pence et al. (1979) observaram o crescimento organizado de raízes em cotilédones de T. cacao, em meio MS suplementado com 20 mg.L^-1 de ANA.

Nos tratamentos constituídos da combinação de ANA com TDZ, as respostas limitaram-se à formação de calo de aspecto esponjoso e não friável (Figura 1E). Entretanto, quando o 2,4-D foi combinado com KIN, após a iniciação de calo não friável, houve a formação e o rápido crescimento de calo friável em toda a superfície dos segmentos cotiledonares e, em menor frequência, a iniciação de raízes. Ndoumou et al. (1997), trabalhando com cotilédones de T. cacao, observaram o rápido crescimento de calos em meio ½ MS suplementado com 2,4-D e KIN.

Os calos friáveis apresentaram um rápido escurecimento, apesar de manterem uma alta taxa de crescimento até o 150° dia de cultura. A oxidação e o crescimento excessivo de calos oriundos de cotilédones de T. cacao, têm sido reportados como os principais problemas no estabelecimento da embriogênese somática (Berthouly & Eskes, 1995).

Não foram detectadas diferenças significativas entre as concentrações de KIN combinadas com 2,26 mM de 2,4-D quanto à percentagem de explantes com calos friáveis (P > 0,05).

A combinação de ANA ou 2,4-D com KIN, nas concentrações testadas, promoveu a indução de calos com coloração branco-translúcida de aspecto esponjoso e não friável (Figura 1F). O tratamento constituído de 2,26 mM de 2,4-D e 13,94 mM de KIN foi o único a induzir a formação de calos friáveis entretanto, com crescimento muito lento e rápido escurecimento.

Resultados semelhantes foram obtidos por Hall & Collin (1974), que observaram apenas a formação de calos sem regeneração de plântulas em segmentos de ramos ortotrópicos de T. cacao. Rodrigues (2000) não verificou a formação de calos em segmentos nodais de T. grandiflorum em meio suplementado com diferentes concentrações de 2,4-D. Segundo Dufour et al. (1985), o desenvolvimento desorganizado de calos em segmentos caulinares de T. cacao, cultivados em meios para a proliferação de brotos, pode ser devido a fatores endógenos ou ao equilíbrio gasoso inadequado.

Aos 10 dias de cultura, verificou-se o rápido crescimento dos calos com aspecto friável e de coloração verde-clara. Não foi observado o crescimento dos calos friáveis em meio MS na ausência de água de coco e de reguladores de crescimento, ocorrendo um rápido escurecimento das culturas. Nos eixos embrionários, na presença de água de coco, houve a progressão dos calos, sendo potencializada em meio suplementado com ANA e 2iP, não sendo detectadas diferenças significativas entre as concentrações de ANA (Tabela 1). Resultados semelhantes foram obtidos por Pence et al. (1979), que observaram o aumento do crescimento de calos de T. cacao L. em meio MS suplementado com 10 % de água de coco. Entretanto, Ferreira et al. (2001) observaram o escurecimento de calos em resposta à combinação de água de coco e 2,4-D.

O efeito estimulatório da água de coco pode ser explicado pelo fato de este aditivo ser rico em glicose e frutose, sais minerais, mioinositol, citocininas, bem como nucleotídeos e outros compostos orgânicos (Ferreira et al., 1998). Alguns trabalhos têm demonstrado a capacidade de indução de embriogênese somática a partir de diversos explantes de T. grandiflorum e T. cacao em meio de cultura suplementado com água de coco (Janick & Whipkey,1988; Li et al., 1998 e Marbach & Teixeira, 1999). A ausência de indução de calos embriogênicos observada nas culturas pode estar relacionada com diversos fatores, como tipo e o estádio de desenvolvimento dos explantes, meio de cultura e tipo e concentração de reguladores de crescimento.

CONCLUSÕES

O 2,4-D promove a formação de calos friáveis em eixos embrionários e o TDZ induz alta frequência de calos friáveis e menor oxidação em segmentos de folhas jovens.

A combinação de 2,4-D e KIN no meio de cultura promove a formação de calos friáveis e de ANA, e KIN induz a rizogênese em segmentos cotiledonares.

A combinação de 2,4-D e KIN promove a formação de calos friáveis em segmentos caulinares.

A adição de água de coco, 2iP e ANA no meio secundário estimula o rápido crescimento de calos friáveis em culturas de eixo embrionário de segmento caulinar e de segmentos de folhas jovens.

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(Trabalho 018/2002). Recebido: 25/02/2002. Aceito para publicação: 06/09/2002

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Eng. Agr. D.Sc. Embrapa Amazônia Oriental caixa postal 48, CEP 66017-970, Belém, PA

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Eng. Agr. PhD

³Universidade Federal do Ceará, Campus do PICI, Departamento de Fitotecnia, CEP 60020-181, Fortaleza, CE

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Abr 2003
• Data do Fascículo
  Dez 2002

Histórico

• Recebido
  25 Fev 2002
• Aceito
  06 Set 2002