Composição química do óleo fixo de Croton cajucara e determinação das suas propriedades fungicidas

Chemical composition of the fixed oil of Croton cajucara and its antifungical properties

ARTIGO

Composição química do óleo fixo de Croton cajucara e determinação das suas propriedades fungicidas

Chemical composition of the fixed oil of Croton cajucara and its antifungical properties

Marco André A. Souza^I, Sonia R. Souza^I, Valdir F. Veiga Jr^II, Janaína K.P.C. Cortez^III, Rosélia de Sousa Leal^III, Tereza N. Castro Dantas^III, Maria Aparecida M. MacielIII,^*

^IDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 23851-970, Seropédica, RJ, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Federal do Amazonas, 60077-000, Manaus, AM, Brasil

^IIIDepartamento de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Campus Universitário, 59072-970, Natal, RN, Brasil

RESUMO

Este trabalho objetivou a obtenção de óleos fixos (OF) das cascas do caule de Croton cajucara via percolação [seguido de fracionamento em coluna cromatográfica (CC)] e fluido supercrítico (FS, gás CO₂), bem como a avaliação das propriedades fungicidas de OF obtido pelo procedimento CC. Os óleos OF-CC e OF-FS apresentaram rendimentos significativamente diferentes; houve maior rendimento (3,14%) de OF obtido no processo convencional (OF-CC), versus 1,2% de OF-FS. A fração F₁ após esterificação, bem como as frações não-esterificadas F₂, F₃ e F₄ (obtidas de OF-CC seguido de outro fracionamento em CC) foram analisadas por CG-FID e CG-EM. A identificação da composição química de OF-CC foi feita por comparação com dados da biblioteca Wiley, bem como pela comparação de índices de kovats. A presença de sesquiterpenos foi comprovada na fração F₁, onde o a-copaeno (20,1%) e cipereno (21,8%) foram os componentes majoritários (70% de percentual sesquiterpênico total). A fração F₂ mostrou sesquiterpenos minoritários mais oxigenados, incluindo o linalol. Na fração F₃ foram observados ácidos graxos, misturas de esteróis e os diterpenos bioativos trans-crotonina, cis-cajucarina B e trans-cajucarina B, onde 40% do total desta fração, foi composta de esteróis e diterpenos; e na fração F₄ foram observados majoritariamente os isômeros cis e trans-cajucarina B. O efeito biológico de OF-CC foi avaliado no desenvolvimento in vitro dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii propagados em meio de cultura Batata-dextrose-agar (BDA). A resposta fisiológica, variou de acordo com o tipo de fungo testado, tendo sido observado que o OF-CC (0,2 mg.mL^-1) apresentou efeito fungistático no controle micelial dos fungos testados, sendo que o gênero de fungo Fusarium oxysporum foi o que sofreu efeito inibitório mais estável.

Unitermos:Croton cajucara, cascas do caule, óleo fixo, constituintes químicos, propriedades fungicidas.

ABSTRACT

This paper focused on the separation of the fixed oil (FO) from the stem bark of Croton cajucara obtained from the conventional approach extraction with organic solvents [followed by chromatography column (CC)] and supercritical fluid extraction (SFE, carried out with CO₂) and also, on the antifungical properties of the FO obtained by CC procedure (FO-CC). The FO contents were 3.14% for FO-CC versus 1.20% in the FO-SFE process. The esterified fraction F₁ and non-esterified fractions F₂, F₃ and F₄ obtained from FO-CC after a new CC procedure were analyzed by HRGC-MS. The identification of the chemical composition of FO-CC was made by comparison with MS literature data, computer matching with the Wiley library and by comparison of their kovats indices with the literature. Fraction F₁ showed 70% of sesquiterpene components, among them a-copaene (20.1%) and ciperene (21.8%) as major compounds. Fraction F₂ was rich in minor oxygenated sesquiterpenes, among them linalool. Meanwhile fraction F₃ showed fat acids, steroids and the bioactive clerodane type-diterpene trans-crotonin, cis-cajucarin B (c-CJC-B) and trans-cajucarin B (t-CJC-B). Fractions F₃ and F₄ showed as major constituents c-CJC-B and t-CJC-B with 40% of the total contents. The biological effect of the FO-CC was evaluated in the in vitro development of the phytopatogen fungi such as Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Sclerotium rolfsii. Significant inhibitory effect of the tested fungi (at 0.2 mg.mL^-1 dosage) were proved.

Keywords:Croton cajucara, stem bark, fixed oil, chemical constituents, antifungical properties.

INTRODUÇÃO

Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), vulgarmente conhecido por “sacaca”, representa um recurso medicinal de grande importância no tratamento e cura de várias doenças, tais como: diabetes, diarréia, malária, febre, problemas estomacais, inflamações do fígado, rins, vesículas e no controle de índices elevados de colesterol (Maciel et al., 2002a,b). O efeito gastroprotetor desta espécie foi correlacionado com os diterpenos do tipo clerodano trans-desidrocrotonina (DCTN) e trans-crotonina (CTN) (Figura 1), bem como com o óleo essencial obtido das cascas do caule deste Croton (Hiruma-Lima et al., 1999a,b, 2000a,b). Adicionalmente, estudos já comprovaram que o óleo essencial apresentou efeitos antinociceptivo e antiinflamatório (Bighetti et al., 1999). Outros tipos de atividades biológicas foram atribuídos aos clerodanos DCTN (Agner et al., 2001; Silva et al., 2001a,b; 2005) e CTN (Maciel et al., 2000; Almeida et al., 2002, 2003).

Em decorrência do Croton cajucara possuir uma grande representatividade na medicina tradicional da região amazônica do Brasil (Maciel et al., 2002a,b) e recentemente seu uso ter se expandido para outras regiões do país (Veiga Jr. et al., 2005), estamos ampliando neste trabalho, o estudo quimio-farmacológico desta espécie. Para tanto, o óleo fixo obtido das cascas do caule foi submetido a análises química e biológica. A caracterização química foi realizada por análises de cromatografia em fase gasosa com o uso de detectores de espectrometria de massas (CG-EM) e de ionização de chama (CG-FID), tendo sido utilizados padrões previamente isolados do Croton cajucara. O efeito dos princípios bioativos deste óleo foi avaliado no desenvolvimento in vitro dos seguintes fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

O material vegetal utilizado foi obtido no mercado Ver-o-peso de Belém/PA. Uma prévia identificação botânica da planta foi feita por Nelson A. Rosa do Museu Paraense Emílio Goeldi, tendo sido depositada uma exsicata no herbário deste Museu, sob código 247. A autenticidade do material vegetal foi confirmada com análises comparativas do extrato metanólico, via cromatografia de camada fina com padrões autênticos previamente isolados (Maciel et al., 1998a,b; 2003).

Extração do óleo fixo

O material vegetal adquirido comercialmente em épocas diferentes, foi seco em estufa a temperatura de 40 ^oC, e moído em moinho de facas do tipo Willey. O pó foi submetido à extração via percolação ou por extração via fluido supercrítico (com altas pressões e temperatura moderada).

Extração via fluido supercrítico

As cascas trituradas (109g) foram peneiradas (peneira com malha de 35 Mesh) obtendo-se um material com granulometria variando entre 28 a 45 Mesh (granulometria necessária para o uso no processo de extração de fluido supercrítico). O pó obtido foi empacotado (em um tubo) e submetido por aproximadamente 4 horas, a um fluxo de gás CO₂, com pressão variando entre 66-70 bar e temperatura de 55 ºC.

Extração via percolação seguido de procedimento cromatográfico

A extração via percolação foi efetuada com metanol, tendo sido utilizados 423 g de material vegetal. O extrato metanólico (EM) obtido após redução do solvente, foi submetido a fracionamento cromatográfico convencional (Maciel et al., 2002a), utilizando-se como adsorvente sílica gel (70-230 Mesh) da Merck, tendo sido obtido 6 frações [F_A,B,C,D,E,F eluídas com hexano/AcOEt (100:0 – 85:15%)], como mostrado no Esquema 1. As frações F_A e F_B [eluídas com hexano/AcOEt (100:0 e 98:2, respectivamente)] foram reunidas e forneceram 13 g (3,14%) de óleo fixo (OF-CC-F_AB). A reunião de frações OF-CC-F_AB sofreu um novo procedimento cromatográfico gerando quatro novas frações (OF-CC-F_1,2,3,4). A fração F₁ foi eluída em hexano/AcOEt (100:0 - 98:2), F₂ em hexano/AcOEt (95:5), F₃ em hexano/AcOEt (90:10) e F₄ em hexano/AcOEt (85:15). Apenas a fração F₁ sofreu esterificação com diazometano.

Análise da composição química

A fração F₁ (esterificada) e as frações F_2-4 (não-esterificadas) foram analisadas por CG-FID e CG-EM, utilizando um cromatográfo de fase gasosa HP modelo 5890 equipado com um detector de ionização de chama a 300 ºC e injetor em modo split (1:20) na temperatura de 270 °C. As análises por CG-EM foram realizadas em um cromatográfo HP modelo 5880 acoplado a um espectrômetro de massas HP modelo 5897A, operado no modo de impacto de elétrons (70eV) com analisador quadrupolo. No espectrômetro de massas a escala de varredura foi de 40 a 600 a.m.u.. Foi utilizado hidrogênio altamente puro como gás carreador em uma velocidade linear de 2 mL min^-1. A temperatura do forno foi programada de 110 °C a 160 °C em 2 °C min^-1 e, em seguida, de 290 °C a 5 °C min^-1 , seguida de isoterma de 5 minutos. Em todas as análises foi utilizada coluna capilar de sílica de 25 m de comprimento, 0,25 mm de i.d. e película de 0,25 mm de SE-54 da fase estacionária (5% de fenil e 1% de vinil em metil silicone). As identificações foram realizadas por comparação dos dados de cromatografia (índices de retenção) e espectrometria de massas obtidos de padrões, da literatura e de espectrotecas (Wiley 275).

Desenvolvimento in vitro de fungos fitopatogênicos

Os fungos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii foram obtidos junto a micoteca do setor de fitopatologia da UFRRJ e propagados em meio de cultura Batata-dextrose-agar (BDA). Para a solubilização do óleo fixo testado (OF-CC proveniente da reunião de frações F_AB) utilizou-se dimetilsulfóxido (DMSO), tendo sido efetuado um ensaio prévio para determinar a concentração de DMSO menos tóxica aos fungos. Para o preparo da solução teste, diluiram-se 20 mg.mL^-1 do OF-CC em DMSO. Em seguida, três frascos contendo o meio de cultura BDA foram fundidos e os tratamentos preparados continham: a) controle positivo (constituído do meio de cultura BDA), b) testemunha padrão [meio de cultura mais 1% (v.v^-1) de DMSO] e c) tratamento teste [meio de cultura mais 1% (v.v^-1) da solução teste (previamente preparada), de modo que a concentração do óleo fixo no meio de cultura foi de 0,2 mg.mL^-1]. Os meios de cultura utilizados foram preparados com antibiótico de largo espectro (Gentamicina^®), tendo sido vertidos nas placas de Petri (4 mm ± 1 mm de diâmetro) e logo após a solidificação, foram repicados fragmentos de BDA no centro destas placas que continham estruturas reprodutivas dos fungos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. As placas de Petri foram lacradas com filme plástico, identificadas e armazenadas em uma câmara de crescimento, com luz do dia e temperatura de 28^oC ± 1^oC, durante cinco dias, após o inicio do ensaio. Os dados foram coletados pela média do diâmetro da colônia nos dois sentidos ortogonais, os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Fisher LSD com 5% de significância (Souza et al., 2003).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os óleos fixos obtidos via cromatografia em coluna (OF-CC) e fluido supercrítico (gás CO₂) apresentaram rendimentos significativamente diferentes. A comparação feita entre as duas extrações [via percolação (seguido de CC) e fluido supercrítico] revelou que houve um maior rendimento de óleo fixo obtido no processo convencional (OF-CC), tendo sido obtido 13 g (3,14%) de óleo fixo (partindo-se de 413 g de cascas), versus 1,2% de óleo fixo extraído no processo via fluido supercrítico (1,34 g; partindo-se de 109 g de cascas). Estes dados poderiam estar correlacionado com questões sazonais [variações que dependem da época e horário de coleta, dentre outros fatores (Maciel et al., 1998b, 2002a)], já que a fonte vegetal utilizada em cada experimento é comercializada no mercado Ver-o-peso (Belém/PA) e foi adquirida em épocas diferentes. A extração com fluido supercrítico minimiza gastos e tempo de trabalho, desta forma, mesmo que forneça rendimentos menores, torna-se uma alternativa viável na extração de óleos em geral. Como exemplo do uso da extração via fluidos supercríticos objetivando redução de custos, podemos citar processos de decafeinização de café e chá praticados na indústria Alemã, Italiana e dos EUA (Zacchi et al., 2006).

Até o presente momento, não há relatos de estudos que tenham efetuado caracterização química de óleo essencial ou fixo obtidos das cascas do caule de Croton cajucara, apenas cita-se que o óleo essencial das cascas não apresenta traços de DCTN e é constituído de sesquiterpenos (sem divulgação da identificação química) considerados como responsáveis pelas atividades antiulcerogênica (Hiruma-Lima, et al., 1999a, 2000a), antiinflamatória e antinociceptiva (Bighetti et al., 1999). Com relação ao óleo essencial de folhas de Croton cajucara, sabe-se que é rico em linalol (Araújo et al., 1971; Lopes et al., 2000) e possui atividades antimicrobiana (Alviano et al., 2005) e antileishmanial (Rosa et al., 2003). O óleo essencial das partes aéreas desta planta, também mostrou-se rico em linalol (Lemos et al., 1999).

Neste trabalho, a fração F₁ esterificada, bem como as frações não-esterificadas F₂, F₃ e F₄ (obtidas via procedimento cromatográfico, Esquema 1) foram analisadas por CG-FID e CG-EM. A identificação dos constituintes químicos destas frações foi efetuada por comparação dos espectros de massas obtidos com os dados da espectroteca Wiley e dos índices de retenção, calculados a partir da injeção de uma série de alcanos lineares (C13 – C18), tendo sido comprovada na fração F₁ a presença de sesquiterpenos (Tabela 1), onde o a-copaeno (20,1%) e cipereno (21,8%) foram os componentes majoritários. Nesta fração também foram observados ésteres metílicos e etílicos. Os sesquiterpenos corresponderam a aproximadamente 70% da constituição química de F₁. A normalização observada na Tabela 1 permite a visualização do percentual relativo entre os sesquiterpenos identificados. A fração F₂ mostrou sesquiterpenos mais oxigenados (Tabela 2), onde se inclui o linalol e outros monoterpenos em pequenas quantidades. A identificação de frações de álcoois, cetonas e substâncias oxigenadas em geral, utilizando dados de comparação com espectroteca e índices de retenção, é de baixa confiabilidade. Desta forma, foram citadas apenas as substâncias que apresentaram altos índices de similaridade entre espectros na comparação com a espectroteca.

A fração F₃ contém ácidos graxos, misturas de esteróis e os diterpenos do tipo clerodano CTN, cis-cajucarina B (c-CJC-B) e trans-cajucarina B (t-CJC-B) (Figura 1) previamente isolados das cascas do caule de Croton cajucara (Maciel et al., 1998a,b, 2003). O somatório de esteróis e diterpenos no cromatograma constituiu cerca de 40% do total de F₃. A fração F₄ contém majoritariamente os clerodanos isoméricos cis e trans-cajucarina B. Os clerodanos CTN, c-CJC-B e t-CJC-B foram identificados nas frações F₃ e F₄, via co-injeção com padrões autênticos (Figura 2) . A Figura 3 apresenta o espectro de massas da CTN e as Figuras 4 e 5 apresentam respectivamente, os espectros de massas dos isômeros c-CJC-B e t-CJC-B detectados no cromatograma da fração F₃. Os Esquemas 2 e 3 mostram fragmentos característicos que foram atribuídos aos clerodanos trans-crotonina (CTN) e cajucarinas B (t-CJC-B e c-CJC-B), respectivamente.

Propriedade antifúngica do óleo fixo obtido das cascas do caule de Croton cajucara

O controle positivo representa em experimentos in vitro uma condição básica para o crescimento de fungos. Neste tratamento o fungo é submetido ao meio de cultura BDA acrescido de antibiótico, para evitar o crescimento de bactérias. O controle negativo, também conhecido como testemunha padrão ou branco, é preparado da mesma forma, entretanto, com uma diferença: a adição de 1% (v.v^-1) de DMSO. A utilização do DMSO foi necessária para solubilizar o óleo fixo de Croton cajucara no meio de cultura, constituído principalmente por água, permitindo, desta maneira, que o óleo seja difundido igualmente no meio de cultura. A utilização do controle negativo permite que os efeitos dos tratamentos sejam subtraídos de um possível efeito do DMSO, sobre o crescimento dos fungos.

A comparação feita entre o controle testemunha padrão (BDA + DMSO) e o controle positivo (BDA) nas placas de Petri, com o fungo Fusarium oxysporum, observou-se que não houve diferenças significativas durante os cinco dias de ensaio. No entanto, os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, apresentaram sensibilidade à presença do DMSO no meio de cultura. Por esta razão, os percentuais de inibição foram trabalhados a partir dos resultados obtidos com a testemunha padrão. Desta forma, o efeito do DMSO sobre o crescimento dos fungos foi subtraído. Uma vez subtraído os efeitos inibitórios do DMSO sobre os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii, os tratamentos com o óleo fixo de Croton cajucara obtido via procedimento cromatográfico (OF-CC proveniente da reunião de frações F_AB) apresentaram efeito inibitório suplementar ao observado na testemunha padrão (Figuras 6 e 7). Resultados semelhantes foram encontrados por Souza et al. (2003) ao verificarem a atividade biológica do óleo de capim limão sobre o desenvolvimento dos mesmos tipos de fungos utilizados neste trabalho.

Após cinco dias de observação, as placas de Petri contendo o fungo Sclerotium rolfsii, apresentaram uma possível alteração fisiológica, já que as estruturas de resistência, denominadas de esclerócios, apresentaram-se rugosas, com manchas variando do marrom-escuro ao marrom-claro e diâmetro quatro vezes superior ao encontrado nas placas do controle positivo. Ao se avaliar os efeitos do OF-CC sobre o crescimento do fungo, verificou-se efeito fungistático em decorrência de redução no crescimento da colônia, tendo sido comprovado inibição do crescimento dos três fungos testados (Figuras 6 e 7). Em contrapartida, a resposta fisiológica dos fungos testados (na presença do OF-CC no meio de cultura) foi diferente, tendo variado de acordo com o tipo de fungo testado. Observou-se que os fungos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii foram resistentes ao óleo testado, de modo que o percentual de inibição diminuiu com o transcorrer dos dias, principalmente para Sclerotium rolfsii. Como pode ser observado na Figura 6, o fungo Fusarium oxysporum foi o que sofreu efeito inibitório mais estável ao longo dos 5 dias de crescimento. Comparativamente, o fungo Sclerotium rolfsii sofreu a maior queda do efeito inibitório, enquanto o fungo Rhizoctonia solani sofreu maior inibição ao crescimento da colônia (Figura 8).

CONCLUSÃO

A presença de sesquiterpenos foi comprovada no óleo fixo obtido das cascas do caule de Croton cajucara Benth, tendo sido evidenciado que o a-copaeno (20,1%) e cipereno (21,8%) são os componentes majoritários (70% de percentual sesquiterpénico total) deste óleo. Dentre os sesquiterpenos minoritários mais oxigenados, destaca-se o linalol. Adicionalmente, foram confirmadas as presenças de ácidos graxos, misturas de esteróis e os diterpenos bioativos trans-crotonina, cis-cajucarina B e trans-cajucarina B.

Com relação aos ensaios in vitro pode-se dizer que o DMSO serviu apenas como veículo nos ensaios in vitro com fungos, como observado por Souza et al (2003), Ferreira et al. (2004) e Jacques et al. (2005), tendo sido necessário um estudo prévio das concentrações ideais para a sua utilização. O óleo fixo testado na concentração de 0,2 mg.mL^-1, apresentou atividade biológica de grande valor agronômico, já que possui sesquiterpenos e clerodanos que podem ser utilizados isoladamente em testes posteriores, bem como disponibilizados em mistura (óleo fixo) para uso comercial na agricultura.

Equívocos com relação ao uso tradicional de Croton cajucara, onde folhas são comercializadas com indicações terapêuticas de cascas, encontram-se documentados (Veiga Jr. et al., 2005). Desta forma, trabalhos que enfoquem a constituição química de óleos provenientes de folhas ou cascas deste Croton, bem como investigações biológicas, devem ser divulgados objetivando esclarecimentos que contribuam com o uso tradicional desta espécie medicinal, com seus estudos etnobotânico, etnofarmacológico, fitoquímico e fitoterápico. Adicionalmente, esta planta representa o Croton mais estudado no mundo, detendo cerca de 60 artigos publicados, sendo, portanto, uma das plantas medicinais nacionais com grande repercussão internacional. O processo de validação científica dos benefícios terapêuticos de Croton cajucara, só está sendo possível, porque estudos multidisciplinares estão sendo desenvolvidos (Maciel et al., 2002a,b, 2000, 2006).

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Programa PRODOC da CAPES.

Recebido em 15/07/06

Aceito em 21/11/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Mar 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Aceito
  21 Nov 2006
• Recebido
  15 Jul 2006