Antiulcerogenic and antioxidant activities of Baccharis trimera (Less) DC (Asteraceae)

rbfar Revista Brasileira de Farmacognosia Rev. bras. farmacogn. 0102-695X 1981-528X Sociedade Brasileira de Farmacognosia Curitiba, PR, Brazil Baccharis trimera (Less) DC (Asteraceae) is a medicinal Brazilian plant well-known by "carqueja". Natural from tropical regions, used as home-made medicine as anti-inflammatory, hypoglycemiant and for the treatment of digestive problems. The evaluation of the antiulcer activity of the extract and the "resin" (portion which during the extracts concentration was settled at the bottom of the recipient, showing a viscous and clammy aspect), was accomplished through the acute induction by acidified ethanol. The lyophilized extract, at a dose of 400 mg/kg, reduced the lesion area at 90%; 200 mg/kg, at 87%; 100 mg/kg, at 66%; and the control (lansoprazol) at 66%. The "resin" administered at the 400 mg/kg dose reduced the lesion area at 82%; 200 mg/kg, at 82%, 100 mg/kg, at 53% and the control (lansoprazol), at 70%. The antioxidant activity of the lyophilized extract, of the "resin" of the powdered drug, of the chloroform, ethyl acetate, ethanol and 50% ethanol fractions was tested following the method which reduces the 2,2-dipheny l-1 -picrylhydrazyl (DPPH) radical, permitting after the reaction balance, to calculate the amount of antioxidant spent to reduce 50% of the DPPH. The result was meaningful, when compared with the vitamin E result. The acute toxicity test performed in mice showed no apparent alteration. ARTIGO Atividades antiúlcera e antioxidante Baccharis trimera (Less) DC (Asteraceae) Antiulcerogenic and antioxidant activities of Baccharis trimera (Less) DC (Asteraceae) Larissa Funabashi de Toledo Dias; Elisângela Severina de Melo; Leandro Santoro Hernandes; Elfriede M. Bacchi* Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, Av. Lineu Prestes, 580, 05508-900 São Paulo-SP, Brasil RESUMO A "carqueja", Baccharis trimera (Less) DC (Asteraceae), é uma espécie vegetal característica de regiões tropicais, muito utilizada na medicina popular como antiinflamatória, hipoglicemiante e em tratamento de problemas digestivos. A avaliação da atividade antiúlcera do extrato bruto liofilizado e do extrato liofilizado da "resina" (porção que durante a concentração dos extratos ficava depositada no fundo do recipiente com aspecto viscoso e pegajoso) foi realizada através de indução aguda por etanol acidificado. O extrato bruto liofilizado, na dose de 400 mg/ kg, reduziu a área de lesão em 90%, 200 mg/kg, 87%, 100 mg/kg, 66% e o fármaco controle (lansoprazol), 66%. O extrato liofilizado da "resina", administrado na dose de 400 mg/kg, reduziu a área de lesão em 82%, 200 mg/kg, 82%, 100 mg/kg, 53% e o fármaco controle (lansoprazol), 70%. A atividade antioxidante foi ensaiada com extrato bruto liofilizado, extrato liofilizado da "resina", pó da droga e frações clorofórmica, acetato de etila, etanol e etanol 50% através do método que reduz o radical 2,2'-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH), permitindo após o equilíbrio da reação, calcular a quantidade de antioxidante gasta para reduzir 50% do DPPH, apresentando resultado evidente, comparado à vitamina E. Não foram verificados sinais de alteração aparente no ensaio de toxicidade na dose única de 5g/kg, em camundongos. Unitermos: Baccharis trimera, carqueja, anti-inflamatório, hipoglicemiante, antiúlcera, problemas digestivos. ABSTRACT Baccharis trimera (Less) DC (Asteraceae) is a medicinal Brazilian plant well-known by "carqueja". Natural from tropical regions, used as home-made medicine as anti-inflammatory, hypoglycemiant and for the treatment of digestive problems. The evaluation of the antiulcer activity of the extract and the "resin" (portion which during the extracts concentration was settled at the bottom of the recipient, showing a viscous and clammy aspect), was accomplished through the acute induction by acidified ethanol. The lyophilized extract, at a dose of 400 mg/kg, reduced the lesion area at 90%; 200 mg/kg, at 87%; 100 mg/kg, at 66%; and the control (lansoprazol) at 66%. The "resin" administered at the 400 mg/kg dose reduced the lesion area at 82%; 200 mg/kg, at 82%, 100 mg/kg, at 53% and the control (lansoprazol), at 70%. The antioxidant activity of the lyophilized extract, of the "resin" of the powdered drug, of the chloroform, ethyl acetate, ethanol and 50% ethanol fractions was tested following the method which reduces the 2,2-dipheny l-1 -picrylhydrazyl (DPPH) radical, permitting after the reaction balance, to calculate the amount of antioxidant spent to reduce 50% of the DPPH. The result was meaningful, when compared with the vitamin E result. The acute toxicity test performed in mice showed no apparent alteration. Keywords: Baccharis trimera, carqueja, anti-inflammatory, hypoglycemiant, antiulcer, digestive problems. INTRODUÇÃO Baccharis trimera (Less) DC., popularmente conhecida como carqueja é usada para o tratamento de várias doenças, atribuindo-lhe propriedades tônicas, estomáquicas, febrífugas e, principalmente, em problemas hepáticos e contra disfunções estomacais e intestinais, além das propriedades antiinflamatórias e digestivas (Biavatti et al., 2007; Agra et al., 2007, 2008). Seu primeiro registro no país informava sobre o tratamento da esterilidade feminina e impotência masculina (Lorenzi, 2002). As espécies do gênero Baccharis são tradicionalmente usadas como uma fonte terapêutica para o tratamento de diversos distúrbios relacionados à saúde do homem (Jakupovic et al., 1990; Ruiz et al., 2008) e apresentam diversas utilidades, dependendo da espécie, sendo usadas em perfumaria, como "terapêutica sem efeitos tóxicos", sendo espécies utilizadas como anti-reumáticas, entre outros usos (Queiroga & Ferracine, 1996). Gamberini et al. (1991) relatam que o extrato aquoso de Baccharis triptera Mart, (Asteraceae), inibiu a secreção e a hiperacidez gástricas e Gené et al. (1992) estudaram em ratos os efeitos antiinflamatórios dos extratos aquosos de três espécies do gênero Baccharis. Os efeitos analgésico e antiinflamatório observados devem-se, principalmente, a um complexo de saponinas que tem como componente majoritário o ácido equinocístico (Gené et al., 1996). Baggio et al. (2003) descrevem o efeito gastroprotetor, a baixa toxicidade, e o aumento da motilidade intestinal em ratos de Baccharis illinita DC (Asteraceae). Simões-Pires et al. (2005) isolaram e identificaram compostos antioxidantes de extratos aquosos de Baccharis trimera, B. crispa, e B. usterii por HPLCUV-MS/MS através do radical DPPH/TLC. Os extratos hidroalcoólico e aquoso de Baccharis trimera (Less) DC foram comparados por Melo & Petrovick (2000) através de métodos físico-químicos e testes sensoriais e realizado o controle de qualidade com diferentes sistemas cromatográficos, usando como substância padrão a quercetina. Silva et al. (2006), descrevem que não foram observadas diferenças no conteúdo de flavonóides em B. trimera (Less) DC nativas e cultivadas e colhidas em estações secas ou úmidas, no período entre de março de 2003 e fevereiro de 2004, no município de Lavras, MG. Os flavonóides eupafolina, quercetina, luteolina, nepelina, apigenina, hispidulina, quercetina, eupatorina, genkwanina, cirsimaritina, rutina, cirsiliol, genkwanina, cirsimaritina, canferol, eupatrina, eriodictiol, 5-OH-6,7,3,4-OMe flavona, 5,6-OH-7,3',4'-OMe flavona e 5,7,3,4-OH-3-O-ramnosil-glicosil flavona foram isolados de B .trimera (Soicke & Leng-Peschlow, 1987; Verdi et al., 2005; Borella et al., 2006). Nakasugi & Komai (1998), descrevem os efeitos antimutagênicos e abaixa toxicidade de Baccharis trimera (Less) DC a partir da fração metanólica purificada. Efeitos vasodilatador e relaxante da musculatura lisa foram descritos para diterpenos de B. trimera (Less) DC (Torres et al., 2000). Extratos e frações de B. trimera apresentaram resultados sugestivos de atividade antidiabética, como foi relatado por Oliveira et al. (2005). Mendes et al. (2007) relatam que B. trimera apresentou uma moderada atividade antioxidante e não foi tão eficiente como antiúlcera em ratos (indução de úlceras por stress). O presente estudo tem por finalidade avaliar a atividade antiúlcera da espécie Baccharis trimera Less (DC), pelo método de úlcera gástrica induzida através do etanol e ácido clorídrico, a atividade antioxidante pela reação com DPPH e a toxicidade aguda através de dose única. MATERIAL E MÉTODOS Vegetal A espécie a ser estudada foi obtida de cultivo do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agronômicas, da UNICAMP. A exsicata recebeu a identificação 1.286. O extrato hidroalcoólico a 70% foi elaborado por percolação de acordo com a Farmacopéia Brasileira (1959). O fracionamento foi feito a partir do extrato bruto liofilizado tendo como extratores o clorofórmio, acetato de etila; etanol e etanol 50%, sendo o solvente retirado para os ensaios. Atividade antiúlcera: modelo de indução aguda por etanol e ácido clorídrico O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo. O teste de atividade antiúlcera aguda foi realizado com 3 grupos de animais, com peso médio de 180 g, em jejum por 24 horas, somente com livre acesso a água. Foram administrados a ratos Wistar fêmeas por via oral água (1 ml/100 g de animal) sendo este o grupo controle negativo, ao grupo teste administrou-se o extrato liofilizado de B. trimera nas doses de 400, 200 e 100 mg/ kg ressuspenso em água, na concentração de 40 mg/ ml, e ao grupo controle positivo foram administrados 30 mg/kg de lansoprazol. Como agente ulcerogênico foi administrado a todos os animais, após trinta minutos, uma solução de acido clorídrico 0,3 M em etanol a 60% (1 ml/100 g de animal). Ao final de 1 hora os animais foram mortos, os estômagos retirados, abertos pela curvatura maior, lavados com solução fisiológica e prensados entre placas de vidro (Mizui & Doteuchi, 1983 e Matsumoto & Yamada, 1991). A área das ulcerações foi medida através do programa Image Pro-Plus, sendo os valores expressos através da área total de lesões ulcerativas, em mm2 (ATL) calculada pela somatória das áreas de lesões individuais e através da área relativa de lesão (ARL), referente à porcentagem de área ulcerativa em relação à área total do estômago. Os resultados foram avaliados através de análise estatística ANOVA seguida de Tukey utilizando o programa GraphPad Instant 2. Atividade antioxidante A atividade antioxidante foi determinada pela reação com DPPH. Descrito inicialmente por Brand-Williams et al. (1995), esse método baseia-se na redução do radical 2,2'-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH), apresentando máxima absorção em 517 nm. Pode-se avaliar através da diminuição da absorbância, a presença de compostos capazes de doar hidrogênios ou seqüestrar o radical permitindo calcular a quantidade de antioxidante necessária para reduzir 50% do DPPH após o equilíbrio da reação. Foi determinada uma curva de calibração da vitamina E, com cinco pontos. O percentual de atividade do DPPH foi calculado como segue (Mensor et al., 2001). Foram calculados por regressão linear dos gráficos, os valores de EC50, onde a abscissa representa a atividade antioxidante (%) das amostras de Baccharis trimera (Less) DC., resultante de três determinações e a ordenada, a concentração do extrato (µg/mL). Toxicidade aguda No ensaio de toxicidade aguda por dose única foram administrados por via oral 5 g/kg do extrato bruto liofilizado de Baccharis trimera (Less) DC e 1 ml/100 g de água (controle negativo) a camundongos machos e fêmeas. Foi observado o comportamento dos animais (agitação, irritabilidade, depressão, resposta ao toque, aperto de cauda, contorção, força de agarrar, tremores, respiração, convulsão, diarréia, constipação, alteração dos pelos, pele e mucosa). Foi verificado o número de mortos. O consumo de água e ração, bem como a massa corpórea dos animais, foram determinados a cada dois dias, por 14 dias. Ao final de 14 dias foi realizada a análise macroscópica dos órgãos (coração/pulmão, fígado e rins) dos camundongos machos e fêmeas, e verificada sua massa (Brito, 1994). Análise estatística Os resultados foram expressos como a média mais ou menos o desvio padrão. Foi usado para comparar mais que duas amostras "One-way" análise de variância (ANOVA) de acordo com Runyon e Haber 1984, com intervalo de confiança de p < 0,05 (Mensor et al., 2001). A significância entre os pares de amostras foi verificada através do teste de Tukey. RESULTADOS Os resultados das avaliações indicam que o extrato bruto liofilizado, administrado na dose de 400 mg/kg, reduziu em 90% a área de lesão, P < 0,001 (***), 200 mg/kg reduziu em 87% a área de lesão, P < 0,001 (***), 100 mg/kg reduziu em 66% a área de lesão, P < 0,05 (*) e o fármaco controle (lansoprazol) reduziu a área de lesão em 66%, P < 0,05 (*). O extrato liofilizado da "resina" (porção que durante a concentração dos extratos ficava depositada no fundo do recipiente apresentando um aspecto viscoso e pegajoso), administrado na dose de 400 mg/kg, reduziu a área de lesão em 82%, P < 0,001 (***), 200 mg/kg reduziu em 82% a área de lesão, P < 0,001 (***), 100 mg/kg reduziu em 53% a área de lesão, P < 0,05 (*) e o fármaco controle (lansoprazol) reduziu a área de lesão em 70%, P < 0,01 (**). (ver Figuras 1 a 4) Atividade antioxidante Os resultados de atividades antioxidante estão apresentados nas Tabelas 1 e 2. Toxicidade aguda Foi observado o comportamento dos animais, o consumo de água e ração, a massa corpórea a cada dois dias, não havendo alteração significativa em relação ao controle. Ao final de 14 dias foi realizada a análise macroscópica dos órgãos (coração/pulmão, fígado e rins) não tendo sido observada nenhuma alteração aparente em relação ao controle. A massa dos órgãos dos animais machos e fêmeas, tanto do grupo tratado como do grupo controle, foi determinada ao final do experimento, não tendo sido observada nenhuma alteração significativa. DISCUSSÃO A úlcera é uma lesão do revestimento da mucosa gástrica (Mizui & Doteuchi, 1983; Falcão et al., 2008a,b). Já a úlcera péptica gastroduodenal é uma doença que resulta da perda circunscrita de tecido da mucosa, podendo ocorrer nas regiões do trato digestivo que entram em contato com a secreção ácida do estômago (Lüllmann et al., 1993). A etiologia da úlcera gástrica ainda não está totalmente elucidada. Fato conhecido é que há um desequilíbrio entre os fatores agressivos (secreção de ácido e pepsina) e os fatores citoprotetores como secreção de bicarbonato, secreção de muco e produção de prostaglandinas (Brunton, 1996). Destacam-se também como fatores agressivos o excesso de álcool, antiinflamatórios não esteroidais, estresse (Rang et al., 2004), síndrome de Zollinger-Ellison, que é um tumor pancreático estimulador da produção de gastrina (Lüllmann et al., 1993). A verificação da atividade antiúlcera do extrato bruto liofilizado de Baccharis trimera (Less) DC foi realizada utilizando modelo de indução aguda por etanol acidificado, que avalia, entre outras, a atividade de substâncias citoprotetoras (Mizui & Doteuchi, 1983; Matsumoto & Yamada, 1991). O etanol produz lesões necróticas na mucosa gástrica, reduzindo a secreção de bicarbonato e a produção de muco, além de modificar sua composição de glicoproteínas (Marhuenda et al., 1993). A indução da lesão gástrica pelo etanol ou pelo etanol acidificado ocorre devido a redução do fluxo sangüíneo na mucosa gástrica, seguida de estase sangüínea, que contribui para o desenvolvimento de hemorragias e necrose de tecidos (Guth, 1984). A presença de ácido clorídrico somente acelera e agrava este processo (Mizui & Doteuchi, 1983). No modelo utilizado, o extrato bruto liofilizado de Baccharis trimera (Less) DC apresentou valores significativos em comparação ao grupo controle reduzindo em aproximadamente 90% a área total de lesão ulcerativa, e o extrato liofilizado da "resina" reduziu em 82%, porém não houve variação significativa entre o extrato liofilizado e a "resina". Observou-se também que nas concentrações de 400 mg/kg e 200 mg/kg do extrato bruto liofilizado as reduções da área total de lesão apresentaram-se muito próximas, assim como do extrato liofilizado da "resina". Estes resultados indicam que relação dose-efeito provavelmente ocorre abaixo de 400 mg/kg, uma vez que não houve diferença aparente acima de 200 mg/kg. Uma substância antioxidante é aquela que inibe o processo de oxidação, e assim protege os sistemas biológicos contra os efeitos danosos de processos ou reações que promovem a oxidação de macromoléculas ou estruturas celulares (Abdala, 1996). Antioxidantes geralmente são compostos fenólicos ou aminas aromáticas, como a-tocoferol, flavonóides e vários antioxidantes sintéticos (Larson, 1988; Abdala, 1996; Shoeb et al., 2007; Vicentino & Menezes, 2007). Em nossos experimentos a atividade antioxidante foi detectada através do reativo 2,2'-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH). A vantagem deste método é a possibilidade do ensaio com grande número de amostras, em curto período de tempo, sendo suficientemente sensível para detectar princípios ativos em baixas concentrações (Yokozawa et al., 1998). Relativo à atividade antioxidante, o pó da droga (D), o extrato bruto liofilizado (EBL), extrato bruto liofilizado da "resina" (EBLR) e frações clorofómica, acetato de etila, etanol absoluto e etanol 50% de Baccharis trimera (Less) DC, apresentaram EC50 22,74 µg/mL, 21,83 µg/mL, 22,6 µg/mL, 24,93 µg/mL, 23,05 µg/mL, 17,18 µg/mL, 18,19 µg/mL, respectivamente, sendo EC50 da vitamina E, 16,71 µg/mL. Comparando os resultados das amostras com os do padrão de vitamina E, podemos sugerir atividade antioxidante bastante evidente. No trabalho de Mendes et al. (2007), o resultado do EC50 de B. trimera foi 7,76 µg/mL e o modelo por eles utilizado foi de lipoperoxidação em cérebro de rato. Nesse mesmo trabalho os autores verificaram reduzida atividade antiúlcera em ratos, induzida por estresse. Não houve sinais de toxicidade aguda no modelo ensaiado, sendo necessários estudos em outros modelos, para comprovação da atividade e da baixa toxicidade. Recebido 2 Outubro 2008; Aceito 20 Janeiro 2009 * E-mail: [e-mail], Tel. [phone] Abdala DSP 1996. Radicais livres e antioxidantes. In: Oga, S. Fundamentos de toxicologia. São Paulo: Atheneu. cap. 1.4, p. 37-58. Fundamentos de toxicologia 1996 37 58 Abdala DSP Oga S. cap. 1.4 Agra MF, França PF, Barbosa-Filho JM 2007. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Rev Bras Farmacogn 17: 114-140. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil Rev Bras Farmacogn 2007 114 140 17 Agra MF França PF Barbosa-Filho JM Agra MF, Silva KN, Basílio IJLD, França PF, Barbosa-Filho JM 2008. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil. Rev Bras Farmacogn 18: 472-508. Survey of medicinal plants used in the region Northeast of Brazil Rev Bras Farmacogn 2008 472 508 18 Agra MF Silva KN Basílio IJLD França PF Barbosa-Filho JM Baggio CH, Freitas CS, Rieck L, Marques MCA 2003. 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