Atividade antimicrobiana de óleos essenciais produzidos por Baccharis dracunculifolia D.C. e Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae)

Antimicrobial activity of essential oils produced by Baccharis dracunculifolia D.C. and Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae)

ARTIGO

Atividade antimicrobiana de óleos essenciais produzidos por Baccharis dracunculifolia D.C. e Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae)

Antimicrobial activity of essential oils produced by Baccharis dracunculifolia D.C. and Baccharis uncinella D.C. (Asteraceae)

Regina Ferronatto^I; Eli Danieli Marchesan^I; Emanueli Pezenti^I; Franciela Bednarski^I; Sideney Becker OnofreI, II, ^*

^IDepartamento de Biologia, Universidade Paranaense, UNIPAR, Caixa Postal 255, Bairro Industrial, 85601-000, Francisco Beltrão, PR, Brasil

^IIUnião de Ensino do Sudoeste do Paraná, UNISEP, Avenida Presidente Kennedy, 2601, Bairro Nossa Senhora Aparecida, 85660-000, Dois Vizinhos, PR, Brasil

RESUMO

Os óleos essenciais obtidos de plantas nativas de Baccharis dracunculifolia e Baccharis uncinella, também conhecido como óleo-de-vassoura, é utilizado na indústria de perfumaria, proporcionando um aroma exótico a diversos perfumes, além de muitos estudos sobre atividades biológicas dessas espécies destacam os efeitos alelopáticos, antioxidante, antimicrobianos, citotóxicos e antiinflamatórios. A vassoura é uma planta arbustiva de ocorrência espontânea no Brasil, assim como nos demais países do Mercosul. A composição do óleo depende da região geográfica e do processo de extração utilizado e a importância comercial está diretamente relacionada com a concentração de compostos oxigenados, destacando o nerolidol e o espatulenol. Óleos essenciais obtidos dessas duas espécies pelo processo de hidrodestilação, foram avaliados pelo método de difusão em disco de papel, em placas de Petri contendo meio de Müeller-Hinton, semeadas com suspensões bacterianas previamente ajustadas ao tubo 0,5 da escala de Mac Farland de quatro cepas provenientes da American Type Culture Colection: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Discos contendo diferentes volumes dos óleos essenciais sem qualquer diluição (1, 3, 5 e 10 µL/disco) foram adicionadas às placas e incubadas a 36 ºC por 24 a 48 horas. Discos de cloranfenicol (CLO) e amoxicilina (AMO) com volumes de 50 e 10 µg/disco respectivamente, foram utilizados como controle. Os resultados apresentados revelam que ambos os óleos avaliados apresentam atividade antimicrobiana sobre S. aureus, E. coli e P. aeruginosa.

Unitermos:Baccharis, Asteraceae, atividade antimicrobiana, óleo essencial.

ABSTRACT

Essential oils obtained from the native plants Baccharis dracunculifolia and Baccharis uncinella, known also as "óleo de vassoura", are used in the perfumery industry, providing diverse perfumes with exotic aromas. Besides several studies about the biological activities of these species highlight the allelopathic, antioxidant, antimicrobial, cytotoxic and antiinflammatory effects. The broom is a bushy plant which occurs spontaneously in Brazil as well as in the other countries from Mercosul. The oil composition depends on the geographical region and on the concentration of oxygenated blends, highlighting the nerolidol and the sphatulenol. Essential oils obtained from these two species by the hydrodistillation process were assessed by the diffusion method in paper disc, in Petri plaques containing Müeller-Hinton agar, with bacteria suspensions, previously adjusted to the tube 0,5 of Mac Farland scale of four strains which came from the American Type Culture Collection: Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Discs containing different volumes of the essential oils (1, 3, 5 and 10 (µL/disc) were added to plaques and incubated at 36 ºC for 24 - 48 hours. Chloranfenicol (CLO) and Amoxicillin (AMO) with concentrations of 30 and 10 µg/disc were respectively used as control. The presented results reveal that both assessed oils present antimicrobial activity against S. aureus, E. coli and P. aeruginosa.

Keywords:Baccharis, Asteraceae, antimicrobial activity, essential oil.

INTRODUÇÃO

Um dos maiores problemas de Saúde Pública, enfrentados nas últimas décadas foi o agravamento da resistência a antimicrobianos em populações bacterianas, principalmente de origem hospitalar (Fidler, 1998; Huovinen; Cars, 1998; Okeke et al., 1999; Oliveira et al., 2006a,b). Atualmente, registra-se um aumento significativo na freqüência do isolamento de bactérias que eram reconhecidamente sensíveis às drogas de rotina usadas na clínica, mas que se apresentam agora resistentes a todos ou quase todos os fármacos disponíveis no mercado, como ocorre com várias bactérias multirresistentes (Huycke et al., 1998; Rattan et al., 1998; Piddock et al., 1998; Pittet, 2002; Shiomori et al., 2002; Sakagami; Kajamura, 2006).

Muitas linhagens multirresistentes de Staphylococcus aureus - MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus), por exemplo, reconhecido patógeno associado à infecção hospitalar ou adquirida na comunidade, já eram sensíveis apenas ao tratamento com vancomicina, mostrando-se resistentes aos aminoglicosídeos, b-lactâmicos, macrolídeos, tetraciclinas, quinolonas e outros quimioterápicos (Salyers; Amábile-Cuevas, 1997, Chartone-Souza, 1998). Recentemente, entretanto, foi isolado tanto em laboratório (Di Sálvio, 1998) como em clínica (Domin, 1998) linhagens mutantes com sensibilidade reduzida à vancomicina. Obteve-se, inclusive, a transferência em laboratório de plasmídio R, com determinante de resistência à vancomicina, para S. aureus, no qual felizmente o plasmídio não se estabilizou. Esses dados antecipam os gravíssimos problemas que poderão trazer essas linhagens multirresistentes, caso não surjam novos antimicrobianos ou terapias alternativas para combatê-los (Domin, 1998).

Atualmente, o problema da resistência tornou-se mais grave devido às dificuldades para a descoberta e o lançamento de novos antimicrobianos no mercado com o uso da metodologia tradicional de triagens, a partir de fungos e bactérias, o que vem tornando esses produtos cada vez mais escassos e mais caros (Phelps, 1989).

Estima-se que são necessários mais de 10 anos, a um custo superior a 200 milhões de dólares, para que um antimicrobiano esteja à disposição da medicina (Dickson; Redwood, 1998).

Uma das alternativas usadas pelas indústrias farmacêuticas tem sido a modificação química da estrutura dos antimicrobianos já existentes, na tentativa de torná-los mais eficientes ou de recuperar a atividade prejudicada pelos mecanismos bacterianos de resistência (Chartone-Souza, 1998). A mudança de paradigma pode ser uma das saídas futuras para o impasse, ao pesquisar em primeiro lugar o alvo e só depois preparar o princípio ativo contra ele, por técnicas de biologia molecular. Entretanto, as alternativas ecológicas, que enfatizam o respeito pelo meio ambiente, devem ser mais efetivas e de menor custo, uma vez que se baseiam no uso mais cuidadoso, e apenas quando necessário, levando à queda de pressão dos antimicrobianos de alguns ambientes, com a diminuição nos níveis atuais do seu uso. Por outro lado, torna-se relevante a pesquisa da ação inibitória do crescimento bacteriano ou do fluxo gênico de genes de resistência ou mesmo de reversão dessa resistência com o uso de produtos de origem natural (Linden; Paladino, 1998; Brown, 1999).

Na busca de novos antimicrobianos devemos enfatizar aqueles de origem vegetal, uma vez que o Brasil apresenta a maior biodiversidade do planeta e que muitas plantas já vêm sendo vastamente usadas e testadas há centenas de anos com as mais diversas finalidades por populações do mundo inteiro. A maior parte da população brasileira (80%) consome apenas 37% dos medicamentos disponíveis, dependendo quase que exclusivamente de medicamentos de origem natural (Stangarlin et al., 1999; Funari; Ferro 2005). Para isso, antes da determinação das frações ativas por métodos bioquímicos sofisticados, agora disponíveis, torna-se necessário e útil o uso preliminar de métodos de triagem de domínio popular ou das farmácias homeopáticas como macerados, chás, extratos aquosos, alcoólicos e outros. Deve-se lembrar que os princípios ativos podem estar presentes em diferentes frações de um composto ou mesmo que um princípio ativo seja liberado só após a ação metabólica do animal (Carvalho, 2003).

Com o objetivo de conhecer as características químicas do gênero Baccharis, é que pesquisadores realizaram estudos com o gênero Baccharis para conhecê-las quimicamente e entre as estudadas, cerca de 30 apresentam estudos de atividade biológica.

A vassoura, Baccharis dracunculifolia (Asteraceae) é uma planta arbustiva que ocorre no Brasil, de Minas Gerais ao Rio Grande do Sul, nos países do Mercosul (Barroso, 1976) e nos vales elevados da Bolívia onde a planta é utilizada na medicina popular (Loayza et al., 1995). A composição do óleo tem sido estudada por vários autores Queiroga et al., 1990; (Loayza et al., 1993; 1995; Ferracini et al., 1995; Weyersthal et al., 1996).

Entre as espécies mais pesquisadas quanto à composição química e/ou atividade biológica, encontram-se B. megapotamica, B. incarum, B. trimera, B. trinervis, B. salicifolia, B. uncinella B. crispa, B. coridifolia, B. dracunculifolia, B. grisebachii, B. genistelloides e B. tricuneata (Macari et al., 2002; Budel et al., 2004; Verdi et al., 2005; Budel et al., 2005; Sousa et al., 2007).

De um modo geral, os compostos que mais se destacaram nesses estudos, foram os flavonóides, clerodanos e labdanos, embora também se tenha observado com certa freqüência a presença de sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, saponinas, glicolipídios, flavonóides, ácidos cumáricos e fenilpropanóides (Queiroga et al., 1990; Borella et al., 2002; Zaroni et al., 2004; Borella et al., 2006; Mendes et al., 2006). Nos estudos de atividades biológicas evidenciam-se os efeitos alelopáticos, antimicrobianos, citotóxicos, hipoglicemiantes e antiinflamatórios (Loayza, et al., 1993, 1995; Duarte et al., 2004; Barbosa-Filho et al., 2005). Nesse sentido é que este trabalho buscou avaliar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais produzidos por B. uncinella e B. dracunculifolia coletados na região Sudoeste do Paraná.

MATERIAL E MÉTODOS

Os óleos utilizados neste trabalho foram obtidos pelo processo de hidrodestilação utilizando para isso um extrator do tipo Clevenger. As espécies de Baccharis utilizadas para a obtenção dos óleos essenciais foram a B. dracunculifolia D.C. e B. uncinella D.C. (Asteraceae), coletadas na região Sudoeste do Estado do Paraná no período de janeiro a junho de 2005.

Os óleos obtidos foram avaliados utilizando o método de Kirby e Bauer (Vandepitte et. al., 1994) e o meio de cultivo foi o Müller e Hinton suplementado com 2% de glicose. Uma suspensão bacteriana foi preparada em solução fisiológica estéril e ajustada ao tubo 0,5 da escala de McFarland, o que corresponde aproximadamente a 1,5 x 10⁶ UFC/mL das cepas de Escherichia coli ATCC 25922 (beta-lactamase negativa) e Staphylococcus aureus ATCC 25923 (suscetível à oxacilina e penicilina), e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, de propriedade do Laboratório de Microbiologia da Universidade Paranaense, Campus de Francisco Beltrão.

Alíquotas de 100 µL de cada suspensão bacteriana foram semeadas por superfície em placas de Petri contendo cerca de 15 mL do meio Mueller-Hinton, com uma espessura de aproximadamente 4 mm (Shadomy; Spnel-Ingrof, 1980).

Discos de papel-filtro de seis milímetros de diâmetro, esterilizados contendo volumes de 1, 3, 5 e 10 µL de óleo puro, sem qualquer diluição, de cada espécie avaliada foram colocados sobre as suspensões bacterianas nas placas de Petri. O teste-controle foi realizado com discos dos antibióticos cloranfenicol (CLO) e amoxilina (AMO) contendo 50 µg e 10 µg por disco, respectivamente, disponíveis comercialmente^â.

A incubação foi feita em estufa a 36 ºC durante 24 a 48 horas. Os testes foram realizados em triplicata e os resultados expressos em mm pela média aritmética do diâmetro dos halos de inibição formado ao redor dos discos nas 3 repetições.

Os diâmetros dos halos de inibição foram interpretados de acordo com os critérios de interpretação preconizados pelo NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1997, 2000a e 2000b).

As análises de variância foram realizadas segundo normas da ANOVA. As diferenças significativas entre as médias foram determinadas pelo teste de Tukey.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Estudos indicam que óleos essenciais têm efeito bactericida contra muitas bactérias (Nenof et al., 1996; Kalpoutzakis et al., 2001). Segundo Ohno et al., 2003, há diferenças na atividade bactericida entre os óleos essenciais, embora a razão exata ainda não tenha sido esclarecida. Os resultados encontrados no presente estudo estão em concordância com os desses pesquisadores. Conforme relata Koyama et al. 1997, muitos componentes dos óleos essenciais, os quais são diferentes em cada óleo, possuem uma habilidade específica para romper ou penetrar na estrutura bacteriana. Para se conhecer o modo de ação dos óleos seria necessário examinar separadamente cada componente do óleo essencial, e a combinação para averiguar se eles têm ação bactericida sozinhos ou sincronizados.

Os resultados obtidos neste trabalho estão sumarizados nas Tabelas 1 e 2 e na Figura 1. Em análise dos resultados obtidos verificamos que ambos os óleos mostraram alguma atividade inibitória sobre o crescimento microbiano das cepas testadas.

Quando foi analisado os resultados obtidos com o óleo de B. uncinella (Tabela 1), foi verificado que este óleo inibiu o crescimento de E. coli nos volumes de 1, 3, 5 e 10 µL do óleo puro por disco, induzindo a formação de halos inibição, respectivamente, de 8,22 mm, 8,31 mm, 9,12 mm, e 13,05 mm. Para S. aureus, os halos formados, para os mesmos volumes do óleo por disco, foram de 9,46 mm, 10,83 mm, 12,40 mm e 14,68 mm; para P. aeruginosa, este óleo mostrou atividade apenas com 10 µL do óleo puro de B. uncinella, apresentando um halo de inibição de 7,32 mm, mostrando com isso uma alta resistência desse microrganismo a ação dos componentes presentes no óleo.

Comparando os resultados obtidos pelo óleo de B. uncinella em relação aos discos de antibióticos controle, AMO e CLO, foi possível verificar resultados significativos tendo em vista que com o volume de 10 µL do óleo puro, foram obtidos 68,25 %, 79,73 % e 76,97 % de inibição, em relação aos discos de CLO 30 µg/disco e de 80,40 %, 51,83 % e 77,75 % quando comparados com discos de AMO 10 µg/disco respectivamente, sobre E. coli, S. aureus e P. aeruginosa.

O óleo obtido de B. dracunculifolia apresentou resultados semelhantes (Tabela 2) aqueles obtidos com o óleo de B. uncinella. Esses dados analisados mostram halos de inibição do crescimento de E. coli mostrou variações entre 9,25 mm para 1 µL a 13,62 mm para 10 µL do óleo puro adicionado aos discos. Para S. aureus essa variação foi de 8,35 mm para 1mL a 14,63 mm para 10 mL. Este óleo apresentou uma baixa atividade inibitória sobre P. aeruginosa, verificando que para os volumes de 1, 3 e 5 µL a mesma se mostrou resistente. Apenas para 10 µL foi verificado uma pequena sensibilidade com formação de um halo de inibição de 8,32 mm.

A comparação dos resultados obtidos pelo óleo de B. dracunculifolia em relação aos discos de antibióticos controle, AMO e CLO, mostrou resultados significativos onde com o volume de 10 µL do óleo puro, obteve-se 93,61%, 84,03%, e 81,48% de inibição, em relação aos discos de CLO 30 µg/disco e de 24,22%, 53,39% e 58,46% quando comparados com discos de AMO 10 µg/disco, respectivamente, sobre E. coli, S. aureus e P. aeruginosa. Nesta comparação foi possível verificar que neste trabalho, nas condições utilizadas e por métodos aqui descritos, seguindo a metodologia oficial (Vandepitte et. al., 1994), com o volume de 10 µL/disco do óleo puro de B. dracunculifolia, um comportamento 24% superior ao disco de AMO 10 µg/disco.

A partir dos resultados obtidos, verificou-se que o comportamento desses dois óleos quando avaliados pela metodologia adotada, se mostraram semelhantes, o que sugere que o modo de ação, os componentes químicos e as respectivas concentrações, também são semelhantes.

Os resultados obtidos neste trabalho são inéditos para B. dracunculifolia e complementam os de B. uncinella descritos na literatura especializada referente a essas duas espécies (Agostini et al., 2005). Outros trabalhos com outras espécies de Baccharis mostram atividade antimicrobiana. Em Baccharis trimera, Avancini et al. (2000), confirmaram a atividade antimicrobiana sobre S. aureus e E. coli. Em estudos realizados por Rangel et al. (2001), avaliando a atividade antimicrobiana de Baccharis nitida, os autores observaram atividade antimicrobiana sobre as bactérias S. aureus e P. aeruginosa, sendo bactérias Gram-positiva e Gram-negativa respectivamente, coincidindo com os resultados obtidos nesse trabalho.

Segundo Verdi et al., 2005, o uso de plantas para curar doenças, incluindo as infecciosas, tem sido extensivamente aplicada pelas pessoas, informações da literatura e os seus resultados revelam um grande potencial das plantas para tratamentos terapêuticos, apesar do fato que elas não tenham sido completamente estudadas, mais estudos precisam ser conduzidos para pesquisar sobre novos componentes. Segundo Verdi et al. 2005, a atividade antimicrobiana tem sido encontrada com alguns terpenos originados de plantas. Uma vez extraídos, e antes de serem usados como tratamento terapêutico, eles devem ter a toxicidade testada in vivo, testes têm demonstrado a toxicidade de extratos de diferentes plantas.

O estudo das plantas medicinais, como ficaram conhecidas no mundo todo pelos pesquisadores, está sendo desenvolvido, comprovando as enormes qualidades medicinais das mesmas, sejam de outros países, ou das milhares de espécies espalhadas pelos quatro cantos do país e em outras partes do mundo que, ao mesmo tempo em que vêm ganhando respeito e maior espaço nas prateleiras de farmácias e casas especializadas, também vêm apresentando propriedades nunca antes exploradas (Amoroso; Gely, 1988; Brandão et al., 2001; Funari; Ferro 2005; Ribeiro et al., 2005; Silva et al., 2006). Além disso, a grande incidência de infecções, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, aumenta a importância da procura e descoberta de compostos terapêuticos alternativos (Carriconde et al., 1996).

CONCLUSÃO

De acordo com os resultados obtidos, utilizando a metodologia oficial, podemos concluir que os óleos essenciais obtidos de B. uncinella e B. dracunculifolia, quando avaliados sobre as bactérias patogênicas Escherichia coli (ATCC 25922-beta-lactamase negativa), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Staphylococcus aureus (ATCC 25923-suscetível a oxacilina e penicilina), mostraram-se eficientes em inibir o crescimento dos microrganismos testados. Com os resultados obtidos, podemos sugerir que estudos posteriores sejam realizados buscando caracterizar quimicamente os óleos estudados e posteriormente identificar os componentes desses óleos e quais grupamentos químicos apresentam essa atividade sobre as bactérias testadas.

Recebido em 01/11/06. Aceito em 19/03/07

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Jul 2007
• Data do Fascículo
  Jun 2007

Histórico

• Recebido
  01 Nov 2006
• Aceito
  19 Mar 2007