Composição química e avaliação da atividade antibacteriana e toxicidade do óleo essencial de Croton zehntneri (variedade estragol)

Chemical composition and evaluation of the antibacterial activity and toxicity of the essential oil of Croton zehntneri (variety estragol)

José G. M. da Costa Fabíola F. G. Rodrigues Elissandra C. Angélico Carla K. B. Pereira Erlânio O. de Souza Germana F. R. Caldas Monalisa R. Silva Nara K. A. Santos Magaly L. Mota Paula F. dos Santos Sobre os autores

Resumos

Tendo em vista que bactérias resistentes a antimicrobianos representam um desafio no tratamento de infecções, é notória a necessidade de encontrar novas substâncias com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a esses microrganismos. Este trabalho relata a avaliação da atividade antibacteriana, toxicidade e identificação dos componentes químicos do óleo essencial de Croton zehntneri (variedade estragol), planta utilizada na medicina popular como calmante e estimulante do apetite. A atividade antimicrobiana e a concentração inibitória mínima (CIM) foram determinadas pelo método de difusão em discos. A avaliação da toxicidade foi realizada frente à Artemia salina com resultado considerado ativo (CL50 < 100 µg/mL). O óleo essencial das folhas apresentou atividade antibacteriana frente a todas as bactérias testadas exceto contra Salmonella typhimurium, sendo o melhor resultado frente a Shigella flexneri com CIM de 50 µg/mL. A análise da composição química foi obtida por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG/EM) e permitiu identificar um total de 97,4% dos componentes, com presença majoritária de estragol (76,8%). A presença de tal constituinte nos impulsiona a realização de estudos com outras bactérias, já que o estragol foi anteriormente relatado como sendo responsável por atividades antibacterianas.

Croton zehntneri; Euphorbiaceae; Estragol; Óleo essencial; Atividade antibacteriana; Toxicidade; CIM


Observing that bacteria resistant to antimicrobials represent a challenge in the treatment of infections, it is notorious the need of finding new substances with antimicrobial features to be used in the fight against these microorganisms. This work relates the evaluation of the antibacterial activity, toxicity and identification of the chemical components of the essential oil of Croton zehntneri (variety estragol), plant used in the popular medicine as tranquilizer and appetite stimulant. The antimicrobial activity and minimum inhibitory concentration (MIC) were determined by the method of diffusion in discs. The evaluation of the toxicity was held through brine shrimp test with results considered active (LC50 < 100 µg/mL). The essential oil of leaves presented antibacterial activity with all the bacteria tested except with Salmonlla typhimurium, being the best result with the Shigella flexneri with MIC of 50 µg/mL. The analysis of the chemical composition was obtained by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS) and permitted to identify a total of 97.4 % of the components, with major presence of estragol (76.8%). The presence of the latter drives us to studies with other bacteria, as the estragol was previously reported as being responsible for antibacterial activities.

Croton zehntneri; Euphorbiaceae; Estragol; Essential oil; Antibacterial activity; Toxicity; MIC


ARTIGO

Composição química e avaliação da atividade antibacteriana e toxicidade do óleo essencial de Croton zehntneri (variedade estragol)

Chemical composition and evaluation of the antibacterial activity and toxicity of the essential oil of Croton zehntneri (variety estragol)

José G. M. da Costa* * E-mail: galberto@urca.br, Tel. +55-88-31021212- ramal: 2771, Fax +55-88-31021271 ; Fabíola F. G. Rodrigues; Elissandra C. Angélico; Carla K. B. Pereira; Erlânio O. de Souza; Germana F. R. Caldas; Monalisa R. Silva; Nara K. A. Santos; Magaly L. Mota; Paula F. dos Santos

Departamento de Química Biológica, Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais, Universidade Regional do Cariri, Rua Cel. Antônio Luiz 1161, Pimenta, 63105-000 Crato-CE, Brasil

RESUMO

Tendo em vista que bactérias resistentes a antimicrobianos representam um desafio no tratamento de infecções, é notória a necessidade de encontrar novas substâncias com propriedades antimicrobianas para serem utilizadas no combate a esses microrganismos. Este trabalho relata a avaliação da atividade antibacteriana, toxicidade e identificação dos componentes químicos do óleo essencial de Croton zehntneri (variedade estragol), planta utilizada na medicina popular como calmante e estimulante do apetite. A atividade antimicrobiana e a concentração inibitória mínima (CIM) foram determinadas pelo método de difusão em discos. A avaliação da toxicidade foi realizada frente à Artemia salina com resultado considerado ativo (CL50 < 100 µg/mL). O óleo essencial das folhas apresentou atividade antibacteriana frente a todas as bactérias testadas exceto contra Salmonella typhimurium, sendo o melhor resultado frente a Shigella flexneri com CIM de 50 µg/mL. A análise da composição química foi obtida por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG/EM) e permitiu identificar um total de 97,4% dos componentes, com presença majoritária de estragol (76,8%). A presença de tal constituinte nos impulsiona a realização de estudos com outras bactérias, já que o estragol foi anteriormente relatado como sendo responsável por atividades antibacterianas.

Unitermos: Croton zehntneri, Euphorbiaceae, Estragol, Óleo essencial, Atividade antibacteriana, Toxicidade, CIM.

ABSTRACT

Observing that bacteria resistant to antimicrobials represent a challenge in the treatment of infections, it is notorious the need of finding new substances with antimicrobial features to be used in the fight against these microorganisms. This work relates the evaluation of the antibacterial activity, toxicity and identification of the chemical components of the essential oil of Croton zehntneri (variety estragol), plant used in the popular medicine as tranquilizer and appetite stimulant. The antimicrobial activity and minimum inhibitory concentration (MIC) were determined by the method of diffusion in discs. The evaluation of the toxicity was held through brine shrimp test with results considered active (LC50 < 100 µg/mL). The essential oil of leaves presented antibacterial activity with all the bacteria tested except with Salmonlla typhimurium, being the best result with the Shigella flexneri with MIC of 50 µg/mL. The analysis of the chemical composition was obtained by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC/MS) and permitted to identify a total of 97.4 % of the components, with major presence of estragol (76.8%). The presence of the latter drives us to studies with other bacteria, as the estragol was previously reported as being responsible for antibacterial activities.

Keywords: Croton zehntneri, Euphorbiaceae, Estragol, Essential oil, Antibacterial activity, Toxicity, MIC.

INTRODUÇÃO

O desenvolvimento de resistência aos antimicrobianos por diversos patógenos vem aumentando a cada dia, tornando-se de grande importância a pesquisa de novos agentes para o combate de infecções. Novas fontes de substâncias obtidas de espécies nativas do Brasil, que apresentem atividade antimicrobiana e baixa toxicidade, podem vir a ser uma alternativa viável, de baixo custo e de fácil acesso pelas comunidades carentes, da região onde tais espécies são encontradas. As plantas produzem substâncias para sua própria defesa em resposta a um ataque patogênico, muitas sintetizam e emitem inúmeros compostos voláteis com a finalidade de defesa e atrair seus polinizadores (Costa et al., 2005).

A família Euphorbiaceae compreende cerca de 300 gêneros e 7600 espécies (Farnsworth et al., 1969; Cronquist, 1981), possuindo hábito heterogêneo, onde se incluem árvores, arbustos, ervas e trepadeiras (Leme, 1994). O gênero Croton destaca-se por seu expressivo número de espécies (750 a 800), de distribuição neotropical (Judd et al., 1999; Heluani et al., 2000), com poucos representantes paleotropicais (Webster, 1994) tendo importância econômica. Várias espécies de Croton apresentam óleos essenciais e constituintes ativos como terpenóides, flavonóides e alcalóides, sendo com freqüência utilizada na medicina popular. Algumas espécies possuem propriedades terapêuticas já comprovadas (Santos et al., 2005; Palmeira Júnior et al., 2006; Souza et al., 2006; Perazzo et al., 2007; Torrico et al., 2007; Rocha et al., 2008).

Croton zehntneri Pax et Hoffm., conhecida popularmente como "canela de cunhã", "canelinha" ou "canela-brava", é uma planta subarbustiva e caducifólia do Nordeste brasileiro, cujas folhas e talos são dotadas de um aroma que lembra uma mistura de erva-doce e cravo-da-Índia. Entretanto, este aroma mostra-se variável entre exemplares desta planta coletados em diferentes localidades do Nordeste. Isto se deve à variação na concentração dos constituintes químicos mais abundantes nos seus óleos essenciais (Craveiro et al., 1978). Assim, distinguem-se para esta espécie quatro tipos químicos como: anetol - para os exemplares coletados em Fortaleza (CE) e Viçosa (CE); eugenol - para os coletados em Areia Branca (RN) e Quixadá (CE); metil-eugenol - para os coletados em Ipu (CE) e Oeiras (PI); estragol - para os exemplares coletados em Tianguá (CE) e Granja (CE) (Morais et al., 2006).

C. zehntneri é usado na medicina popular principalmente como sedativo, como estimulante de apetite e para aliviar distúrbios intestinais (Matos, 2000; Agra et al., 2007 & 2008), sendo comprovados os efeitos antioxidante (Morais et al., 2006), atividade antinoceptiva (Oliveira et al., 2001) e efeitos depressivos sobre o sistema nervoso central em ratos e camundongos (Batatinha et al., 1995) do óleo essencial de suas folhas.

Considerando-se que não há estudos sobre o potencial microbiológico de

C.

zehntneri (variedade estragol) e que estudos sobre a atividade antimicrobiana de plantas medicinais apresentam um grande desafio para a descoberta e identificação de novas substâncias ativas, este trabalho teve por objetivo avaliar preliminarmente o potencial da atividade antibacteriana e a toxicidade do óleo essencial dessa espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal e obtenção do óleo essencial

Folhas de C. zehntneri foram coletadas no mês de março/2006 no Morro do Chapéu, em Salitre (Ce). Uma amostra representativa foi classificada e depositada no Herbário Caririense Dárdaro de Andrade Lima da Universidade Regional do Cariri, sob o número 1619.

O óleo essencial das folhas secas (425 g) foi obtido por hidrodestilação, utilizando aparelho tipo Clevenger, por um período de duas horas. Em seguida seco com sulfato de sódio anidro obtendo rendimento de 1,56% e mantido em refrigerador até a análise.

Análise da composição química

A identificação dos componentes majoritários do óleo essencial das folhas de C. zehntneri foi obtida através de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG/EM), em um espectrômetro Hewlett-Packard modelo 5971, operando com energia de ionização de 70 eV. Utilizou-se coluna capilar de sílica fundida DB-5 (30 m x 0,25 mm d.i., 0,25 µm de espessura do filme) e carreador de gás hélio com fluxo de 1 mL/min com split. As temperaturas do injetor e detector foram programadas de 250 ºC e 200 ºC, respectivamente. A temperatura da coluna foi determinada de 35 ºC a 180ºC a 4ºC/min e, em seguida de 180ºC a 280ºC a 10ºC/min. Os espectros de massa foram obtidos de 30 a 450 m/z. Componentes individuais foram identificados por correspondências de seus espectros de massa com os da base de dados, bem como através de comparação visual da fragmentação padrão com aqueles relatados na literatura (Adams, 2001).

Avaliação da toxicidade

A toxicidade foi avaliada frente a Artemia salina Leach, através do método proposto por Meyer et al. (1982). O teste foi feito em triplicata com diferentes concentrações (250, 125, 100, 75 µg/mL), acompanhado de um controle positivo preparado com água marinha e dicromato de potássio (K2Cr2O7), e de um controle negativo com água marinha e Tween 80. A contagem do número de larvas mortas foi realizada após 24 horas e esse número foi usado para o calculo da CL50 pelo método de regressão linear, sendo considerado ativo quando apresentam valores de CL50 < 1000 µg/mL (Meyer et al, 1982).

Avaliação da atividade antibacteriana e concentração inibitória mínima (CIM)

Na realização da atividade antibacteriana foram utilizadas cinco culturas padrões cedidas pela Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, sendo três gramnegativas Shigella flexneri (ATCC 12022), Salmonella typhimurium (BM/PANAMA - TY2) e Escherichia coli (ATCC 25922) e duas gram-positivas Sthaphylococcus aureus (ATCC 10390) e Streptococus β-haemolyticus (ATCC 6314), reavivadas em meio Brain Heart Infusion (BHI ) e incubadas por 24 horas a 37 ºC.

A ação antimicrobiana e a concentração inibitória mínima foram determinadas pelo método de difusão em Agar (Bauer et al., 1966) adaptado por Romeiro (2001) e Koneman et al. (1993). As bactérias foram replicadas, com auxílio de um swab estéril, em placas de petri previamente preparadas com ágar Muller-Hilton onde discos de papel estéreis (6 mm de diâmetro) foram impregnados com 20 µL da solução do óleo, em concentrações de 1000, 500, 100, 50 e 25 µg/mL. O ensaio foi realizado em triplicata utilizando como controles positivos ampicilina (100 µg/mL) e cloranfenicol (100 µg/mL) e como controle negativo Tween 80 e água destilada. As placas foram encubadas em estufa a 37 ºC e os resultados foram lidos após 24 horas. O CIM foi considerado a menor concentração do óleo que inibiu completamente o crescimento bacteriano.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O cromatograma do óleo essencial de C. zehntneri mostrou que doze picos foram detectados. Foram identificados 97,4% dos constituintes químicos (Tabela 1) dentre mono- e sesquiterpenos, sendo reconhecido como componente majoritário o estragol, representando 76,8% do teor do óleo essencial.

Os índices de mortalidade das larvas no bioensaio de toxicidade do óleo essencial sobre Artemia salina variaram entre 0 e 100 %. A dose necessária para matar 50% das larvas (CL50) foi calculada em 100 µg/mL, indicando que esse óleo possui atividade considerada significativa por apresentar CL50 menor que 1000 µg/mL (Meyer et al., 1982).

No teste de susceptibilidade para a avaliação da atividade antibacteriana, o óleo essencial das folhas apresentou atividade frente a todas as bactérias testadas exceto contra Salmonella typhimurium, sendo o melhor resultado frente à Shigella flexneri com maior halo de inibição de 15 mm. Com as linhagens Sthaphylococcus aureus, Escherichia coli e Streptococus β-haemolyticus foram observados discretos halos de 6 mm (Tabela 2). Pela análise estatística (ANOVA), foi verificado que quando comparados os halos de inibição obtidos para Sthaphylococcus aureus, Escherichia coli e Streptococus β-haemolyticus, não houve diferença significativa.

Em relação à avaliação da concentração inibitória mínima, o óleo essencial apresentou atividade significativa apenas contra a linhagem de Shigella flexneri demonstrando sensibilidade nas concentrações de 1000, 500, 100 e 50 µg/mL, com CIM de 50 µg /mL (Tabela 3).

O óleo essencial das folhas de Croton zehntneri é constituido principalmente de monoterpenóides e sesquiterpenóides, dentre seus constituintes, demonstrouse a presença majoritária de estragol (76,8%).

Diante dos resultados dos bioensaios preliminares o óleo essencial demonstrou potencial biológico contra bactérias patogênicas e toxicidade ativa, incentivando assim novas pesquisas com substâncias isoladas dessa espécie, na busca de alternativas terapêuticas que possam servir de subsídio para novas fontes racionais a partir de produtos naturais brasileiros.

AGRADECIMENTOS

A FUNCAP e ao CNPq pelo apoio financeiro e a Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), pela concessão das bactérias padrões.

Received 25 August 2008; Accepted 2 October 2008

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    * E-mail: galberto@urca.br, Tel. +55-88-31021212- ramal: 2771, Fax +55-88-31021271

    Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      18 Fev 2009
    • Data do Fascículo
      Dez 2008

    Histórico

    • Recebido
      25 Ago 2008
    • Aceito
      02 Out 2008
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