Fitoconstituintes isolados da fração em diclorometano das folhas de Vernonia tweediana Baker

Phytoconstituents isolated from dichloromethane fraction of Vernonia tweediana Baker leaves

ARTIGO

Fitoconstituintes isolados da fração em diclorometano das folhas de Vernonia tweediana Baker

Phytoconstituents isolated from dichloromethane fraction of Vernonia tweediana Baker leaves

Ricardo Basso Zanon^I; Danielle Fontana Pereira^I; Ticiane Krapf Boschetti^I; Mariane dos Santos^I; Margareth Linde Athayde^{*, II}

^ILaboratório de Fitoquímica, Departamento de Farmácia Industrial, Universidade Federal de Santa Maria, Campus Camobi, 97119-900 Santa Maria-RS, Brasil

^IIDepartamento de Farmácia Industrial, Universidade Federal de Santa Maria, Campus Camobi, 97119-900 Santa Maria-RS, Brasil

RESUMO

Fracionamento cromatográfico da fração em diclorometano obtida do extrato etanólico das folhas de Vernonia tweediana Baker (Asteraceae) conduziu ao isolamento de α-amirina, β-amirina, lupeol, β-sitosterol, estigmasterol e espinasterol. As estruturas foram identificadas através de técnicas espectroscópicas usuais, além da comparação com dados relatados na literatura. Os compostos isolados são relatados pela primeira vez para a espécie V. tweediana.

Unitermos:Vernonia tweediana, Asteraceae, triterpenos, esteróides.

ABSTRACT

Fractionation of the dichloromethane -soluble fraction from the ethanol extract of the leaves of Vernonia tweediana (Asteraceae) led to the isolation of α-amyrin, β-amyrin, lupeol, β-sitosterol, stigmasterol and spinasterol. The structures of the isolates were elucidated by spectroscopic analysis and comparison with literature data. The isolated compounds are reported for the first time to the species V. tweediana.

Keywords:Vernonia tweediana, Asteraceae, triterpenes, steroids.

INTRODUÇÃO

O gênero Vernonia (Asteraceae) abrange uma grande diversidade de espécies, com representantes no mundo inteiro. As espécies deste gênero são utilizadas em várias partes do mundo para o tratamento de diversas enfermidades, salientando-se o uso para o tratamento da malária, em doenças respiratórias e distúrbios gastrintestinais. Os principais constituintes relatados para o gênero são lactonas sesquiterpênicas, flavonóides, triterpenos, esteróides, lignóides e carotenóides, além de alcalóides e taninos (Awe et al., 1998; Carvalho et al., 1999; Barbosa-Filho et al., 2008).

No Brasil, várias espécies de Vernonia são utilizadas empiricamente pela população, destacando-se o macerado de folhas de V. condensata Baker, usado como analgésico, anti-ulcerogênico e para a prevenção de distúrbios no estômago e fígado (Frutuoso et al., 1994) e os extratos alcoólicos de V. scorpioides (Lam.) Pers., utilizados no tratamento dos mais variados ferimentos cutâneos (Dalazen et al., 2005).

A espécie Vernonia tweediana Baker, conhecida como "assa-peixe", é um arbusto e representa uma das principais plantas invasoras de pastagens artificiais implantadas ao longo da costa atlântica (Cabrera & Klein, 1980). Característica da região sul do Brasil, Paraguai e Argentina, a planta é popularmente utilizada para o tratamento de doenças respiratórias, constituindo-se de uma alternativa de tratamento em gripes, bronquites e tosses. A ausência de estudos sobre a espécie e a importância do registro químico de espécies endêmicas dos biomas brasileiros, principalmente as que são utilizadas para fins terapêuticos, motivaram o presente trabalho, que descreve os primeiros resultados obtidos no estudo fitoquímico da fração em diclorometano das folhas de V. tweediana.

MATERIAL E MÉTODOS

Instrumentação e procedimentos gerais

Os espectros de absorção na região do infravermelho (IV) foram registrados em espectrômetro Nicolet Magna 550, utilizando-se pastilhas de KBr. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear, RMN de ¹H (400 MHz) e de ¹³C (100 MHz), foram realizados em espectrômetro Brucker DPX, utilizando-se CDCl₃ como solvente e TMS como padrão de referência interna.As análises de Cromatografia Gasosa acoplada ao Espectrômetro de Massas (CG-EM) foram realizadas em cromatógrafo Hewlett-Packard 6890 Series Plus +, equipado com injetor automático split-splitless modelo HP 6890 Series GC Auto Sampler Controller e detector seletivo de massas modelo HP 5973 MSD, utilizando-se coluna capilar cromatográfica de sílica fundida HP-5 MS (30 m x 0,32 mm diâmetro interno e espessura do filme 0,25 µM) com 5% fenil e 95% de metilsiloxano.O gás de arraste foi hélio (fluxo de 2 mL/min). Temperatura do injetor de 250 ºC com programação de taxa de aquecimento de 12 ºC/min até 280 ºC. Energia de ionização 70 eV. Para as cromatografias em coluna, utilizou-se gel de sílica 60 da Merck, com tamanho de partícula 0,063-0,200 mm (70-230 mesh-ASTM). Para cromatografia de camada delgada (CCD) utilizou-se cromatofolhas de gel de sílica GF₂₅₄ (Merck) e gel de sílica impregnado com solução de nitrato de prata a 10% (Stahl, 1969). Para a detecção das substâncias, utilizou-se anisaldeído-sulfúrico seguido de aquecimento.

Material vegetal

Folhas de V. tweediana foram coletadas em abril de 2004 em Ijuí-RS e identificadas pelo Dr. Geraldo Ceni Coelho do Departamento de Biologia e Química (DeBQ/UNIJUÍ). A exsicata foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM, catalogada sob o número SMDB 9536.

Extração e isolamento dos constituintes

As folhas foram secas a temperatura ambiente e moídas, resultando em uma massa de 1,9 Kg de material vegetal, que foi submetido à maceração em EtOH 65% em água (v/v), na proporção de 15 g/100 mL de solvente, durante sete dias, com agitação diária. O extrato obtido foi filtrado e o EtOH removido sob pressão reduzida em evaporador rotatório. O extrato aquoso remanescente foi fracionado com solventes de polaridade crescente (CH₂Cl₂, AcOEt e n-BuOH e 3 x 200 mL para cada solvente). A fração em CH₂Cl₂ (10,0 g) foi submetida à cromatografia em coluna "flash" sobre gel de sílica 60 (225 g) usando-se inicialmente como fase móvel apenas CH₂Cl₂ (1 L) e posteriormente as misturas de CH₂Cl₂:EtOH 9:1 v/v (1L) e 8,5:1,5 v/v (1L). Foram coletadas 30 frações de ±100 mL, que, após monitoramento por cromatografia em camada delgada (CCD), foram agrupadas com base na semelhança de perfil cromatográfico. O agrupamento de frações conduziu à obtenção de duas principais sub-frações, codificadas como I (2,082 g) e II (131 mg). Parte da sub- fração I (600 mg) foi cromatografada em coluna de gel de sílica 60 (58 g) e eluída com CH₂Cl₂:éter de petróleo (9:1, v/v), obtendo-se outra sub-fração (230 mg) que foi novamente submetida à cromatografia em coluna de SiO₂-AgNO₃ (22 g), originando o composto 1 (43,6 mg) e a mistura 2 + 3 (50 mg).A sub-fração II (131 mg) foi submetida a cromatografia em gel de sílica 60 (40 g), tendo como eluente CH₂Cl₂:éter de petróleo (7:3, v/v). Após monitoramento por cromatografia em camada delgada, as frações foram agrupadas com base na semelhança de perfil cromatográfico. Frações reunidas (61 mg) foram novamente cromatografadas em coluna de SiO₂-AgNO₃ (12 g). As frações obtidas foram analisadas por CCD (SiO₂/AgNO₃) verificando-se a separação da substância 4 (7mg) e a da mistura composta por 5 + 6 (27 mg).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Sucessivos fracionamentos cromatográficos da fração em CH₂Cl₂ obtida a partir do extrato hidro-etanólico (65%) conduziram ao isolamento de três triterpenos e três fitoesteróides (Figura 1), cujas estruturas foram identificadas com base na análise de dados de IV, EM e RMN, bem como pela comparação com dados descritos na literatura (Ogunkoya, 1981; Chaturvedula et al., 2004; Olea & Roque 1990; De-Eknankul & Potduang, 2003; Forgo & Kövér, 2004; Villaseñor et al.,1996; Cortez et al., 2006).

O espectro de RMN de ¹³C de 1, indicou a presença de trinta átomos de carbono. Desses sinais, dois referentes a carbono sp², são característicos de ligação dupla em compostos com esqueleto lupeno (δ_C 109,3 e 150,9 ppm), que conjuntamente com o grupo metil em δ_C 19,3, são indicativos de grupo isopropenil (C-29, C-20 e C-30, respectivamente). No espectro de RMN de ¹H, dois dubletos em δ_H 4,56 e 4,68 correspondem aos dois hidrogênios geminais olefínicos (H-29a e H-29b). Estes sinais, somados ao δ_H do sinal de metila em 1,67 ppm, corroboram com a indicação da presença de isopropenil, comprovando assim que 1 trata-se de um triterpeno pentacíclico do tipo lupeno (Chaturvedula et al., 2004; Aguiar et al., 2005). Na análise por CG da substância 1 foi possível observar um único pico com tempo de retenção de 26,08 min. O EM (IE) mostrou pico em m/z 426, que corresponde ao pico do íon molecular de 1. Outros picos oriundos da fragmentação do tipo Retro-Diels-Alder do anel C, são típicos de triterpenos pentacíclicos, principalmente os de maior intensidade como os m/z 218; 207; 203 e 189. Destes, os mais intensos foram m/z 189 e 207, que são característicos de fragmentações de compostos do tipo lupeno (Ogunkoya, 1981), permitindo a identificação do composto 1 como lupeol.

A elucidação da mistura 2 + 3 (α e β-amirina, respectivamente), foi efetuada com base nos assinalamentos de RMN de ¹³C e RMN de ¹H descritos na literatura (Ogunkoya, 1981; Olea & Roque 1990; Baykal et al.,1998; Bandeira et al., 2007). O espectro de RMN de ¹³C, indicou a presença de 56 átomos de carbonos, sugerindo uma mistura binária de triterpenos. Observaram-se sinais que caracterizam as séries urseno (139,2 e 124,4 ppm) e oleaneno (121,7 e 145,2 ppm). No cromatograma obtido por CG-EM foi possível observar dois picos em tempos de retenção de 25,28 (β-amirina) e 26,07 (α-amirina) min., sendo as proporções entre eles 1:1 (verificadas pelas áreas dos picos). Os espectros de massas foram muito semelhantes, diferindo apenas na intensidade de alguns picos, principalmente o pico em m/z 203 (m/z 218-CH₃, mais intenso β-amirina). Ambos mostraram picos em m/z 426, correspondentes aos íons moleculares dos dois isômeros. Picos oriundos da fragmentação do tipo Retro-Diels-Alder do anel C, típicos de olean-12-enos e ursan-12-enos, foram observados em m/z 218; 203 e 189 (Ogunkoya, 1981; Morita et al., 2000).

O espectro de RMN de ¹³C de 5 + 6 indicou a presença de 43 átomos de carbonos, sugerindo uma mistura binária. Quatro sinais na região de carbonos sp² (121,7, 129,3, 138,3 e 140,8 ppm) indicam duas ligações duplas. Os sinais em δc 121,7 e 140,8 são característicos de esteróides com uma ligação dupla entre C-5 e C-6 (Forgo & Kövér, 2004;De-Eknankul & Potduang, 2003; Tomaz et al., 2008) e os sinais em δc 129,3 e 138,3 são característicos de uma ligação dupla entre C-22 e C-23 (Forgo; Kövér, 2004). O β-sitosterol (24α-etil-colestan-5-eno-3β-ol) e o estigmasterol (24α-etil-colestan-5,22-dieno-3β-ol) possuem uma mesma insaturação (Δ⁵), portanto, os sinais nos espectros de RMN de ¹³C irão coincidir e assim C-5 e C-6 estarão mais intensos quando comparados com os outros dois sinais referentes a insaturação em Δ²², presente somente em estigmasterol (De-Eknankul & Potduang, 2003; Ayres et al., 2008). No espectro de RMN de ¹H destacam-se o singlete largo em δ_H 5,36 (H-6), comum em ambos os compostos e os duplo-dubletes em δ_H 5,02 (J = 8 e 16 Hz, H-23) e 5,16 (J = 8 e 15 Hz, H-22), que caracterizam os demais hidrogênios olefínicos do estigmasterol (De-Eknankul & Potduang, 2003; Forgo & Kövér, 2004). O cromatograma resultante do CG-EM mostrou os dois picos referentes ao estigmasterol (TR = 23,83 min.) e ao β-sitosterol (TR = 24,70 min.). As concentrações percentuais, com base nas áreas dos picos, foram de 91:9 estigmasterol (6)/β-sitosterol (5).

O espectro de RMN de ¹³C de 4 registrou a presença de 29 átomos de carbono. Desses sinais, quatro característicos de carbonos sp² (δ_C 117,5, 129,5, 138,1 e 140,8 ppm) sugerem a presença de duas ligações duplas. Estes sinais são característicos de compostos com esqueletos esteroidais ramificados, quando uma das insaturações está localizada entre C-7 e C-8 (δ_C 117,5 e 138,1) e a outra entre C-22 e C-23 (δ_C 129,5 e 140,8) (Villaseñor et al.,1996; Gomes & Alegrio, 1998). O EM mostrou pico em m/z 412, indicando a formula molecular C₂₉H₅₀O. O pico base a m/z 271 caracteriza a presença de ligação dupla na posição 7 em moléculas esteroidais (Villaseñor et al.,1996).O espectro de IV apresenta um sinal em 970 cm^-1, indicativo da posição trans em HC=CH (C22 e C23) (Villaseñor et al.,1996). O singleto largo em δ_H 5,09 foi atribuído ao hidrogênio olefínico H-7 e os sinais em δ_H 4,96 (1H, dd, J = 8 e 15 Hz, H-22 ou H-23) e δ_H 5,12 (1H, dd, J = 8 e 15 Hz, H-22 ou H-23) aos dois hidrogênios olefínicos restantes. A comparação dos deslocamentos químicos de RMN de ¹³C e RMN de ¹H da substância 4, com os registrados na literatura (Garg & Nes, 1984a,b; Villaseñor et al., 1996; Gomes & Alegrio, 1998; Paulo et al., 2005) permitiu propor a estrutura do espinasterol.

Todos os compostos isolados foram descritos previamente para o gênero (Bohlmann & Zdero, 1982; Misra et al., 1984). Estas informações sobre a espécie Vernonia tweediana Baker, conhecida como pertencente a um grupo de plantas de ocorrência marcante na América do Sul, apresentam os primeiros resultados do estudo fitoquímico da fração em diclorometano das folhas da planta. No entanto, o potencial químico merece ser ampliado e a eficácia biológica avaliada.

AGRADECIMENTOS

À CAPES pela concessão da bolsa de Mestrado (R.B.Z.), ao CNPq (BIC de T. K. B.), ao FIEX/UFSM (Bolsa de Extensão de M.S.), ao Departamento de Química da UFSM, pela confecção dos espectros de RMN e ao Dr. Geraldo Ceni Coelho (UNIJUÍ) pela identificação do material botânico.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Ago 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2008