Atividade antimicrobiana de Struthanthus vulgaris (erva-de-passarinho)

Antimicrobial activity of Struthantus vulgaris (erva-de-passarinho)

ARTIGO

Atividade antimicrobiana de Struthanthus vulgaris (erva-de-passarinho)

Antimicrobial activity of Struthantus vulgaris (erva-de-passarinho)

O.M.C. Vieira^*; M.H. Santos; G.A. Silva; A.M. Siqueira

Departamento de Farmácia, Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas, Centro Universitário Federal, Rua Gabriel Monteiro da Silva 714, 37130-000, Alfenas, MG, Brasil

RESUMO

As plantas do gênero Struthanthus são conhecidas como ervas-de-passarinho e parasitam pomares no Brasil, principalmente os de laranjeiras e goiabeiras. Na medicina popular são usadas nas afecções das vias respiratórias. O extrato hidroetanólico a 70% de folhas frescas de Struthanthus vulgaris apresentou atividade antimicrobiana contra amostras bacterianas Gram positiva e Gram negativa. Este extrato não apresentou, nas condições testadas, atividade contra fungos. As amostras bacterianas mais sensíveis ao extrato foram Bacillus cereus (ATCC 11778), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), S. epidermidis (ATCC 12228) e P. aeruginosa (ATCC 27853), usando o método de difusão em agar. As frações obtidas, pela partição líquido-líquido do extrato hidroetanólico a 70%, com solventes de polaridades crescentes (clorofórmio, acetato de etila, n-butanol e água), apresentaram diferentes atividades inibitórias. A fração que apresentou a maior atividade contra bactéria Gram positiva (B. cereus) e Gram negativa (P. aeruginosa) foi aquela obtida com n-butanol. Nessa fração foram detectados flavonóides, taninos condensados (proantocianidinas) e saponinas.

Unitermos:Struthanthus vulgaris, erva-de-passarinho, proantocianidinas, atividade antimicrobiana.

ABSTRACT

Struthantus vulgaris (mistletoe) is one of the most common hemiparasite species in Brazil. It occurs as a parasite of orchards, mainly in orange and guava trees. Some authors mention Struthantus use in traditional medicine for respiratory diseases treatment. Fresh leaves concentrated hydroalcoholic extract showed antimicrobial activity against Gram positive and Gram negative bacterial samples. In tested conditions, these extracts did not show activity against fungi. The more susceptible bacterial samples to fresh leaves hydroalcoholic extract were Bacillus cereus (ATCC 11778), Micrococcus luteus (ATCC 9341), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), S. epidermidis (ATCC 12228) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). The method used for assessment of antimicrobial activity was agar diffusion. Fractions obtained from fresh leaves concentrated alcoholic extracts with increasing polarity solvents (chloroform, ethyl acetate, n-butanol and water) showed different inhibitory activities. n-Butanol fraction showed greater activity against Gram positive bacteria (B. cereus) and Gram negative bacteria (P. aeruginosa). In this fraction, flavonoids, condensed tannins (proanthocyanidins) and saponins, were found.

Keywords: Struhtanthus vulgaris, mistletoe, proanthocyanidins, antimicrobial activity.

INTRODUÇÃO

As plantas pertencentes à família Loranthaceae têm sido, há muito tempo, reconhecidas como portadoras de propriedades terapêuticas. Esta família é composta de 40 gêneros e 1500 espécies, distribuídas em regiões tropicais e subtropicais de ambos os hemisférios, revelando-se pouco freqüentes nas regiões temperadas (Venturelli, 1981). No campo da medicina, em diferentes países, espécies do gênero Struthanthus são usadas para tratamento de várias enfermidades, como por exemplo, na Nicarágua, a S. cassythoide é indicada para dor em geral, febre, desordens respiratórias e pulmonares, erupções e feridas na pele (Coe; Anderson, 1996). Segundo Almeida (1993), a espécie S. flexicaulis, originária do Brasil e America Tropical, possui atividades medicinais como energético e também contra leucorréia, bronquite e tumores diversos.

A espécie S. vulgaris é um dos hemiparasitas mais comuns de árvores ornamentais e plantas frutíferas (Corrêa, 1969). No Brasil, é planta própria das regiões de mata pluvial, apreciando temperaturas amenas, razão pela qual é igualmente muito comum no sul do país e nas serras do leste (Rizzini, 1968). Segundo Salatino et al. (1993), contém relativamente altas concentrações de taninos condensados. Nas folhas, estes taninos são mais comuns em parênquima paliçadico e nervura central das folhas.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta e identificação do material vegetal

As folhas e os caules de S. vulgaris (Mart.) (erva-de-passarinho) foram coletados em março de 2001, na propriedade rural, denominada Fazenda Nossa Senhora Aparecida, no município de Alfenas-MG entre as coordenadas 21° 26' 260''s e 45° 57' 943''W, com altitude de 815 metros. A identificação da espécie foi realizada pela pesquisadora Marie Sugiyama do Instituto de Botânica da Universidade de São Paulo. Uma exsicata encontra-se depositada, com o número 00187, no Herbário Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas (HEFOA), na Escola de Farmácia e Odontologia de Alfenas/Centro Universitário Federal.

Obtenção do extrato hidroetanólico a 70% e das frações F₁ a F₄

O extrato hidroetanólico a 70% de folhas (500 g) foi obtido por maceração (20% p/v) por seis dias. Após este período, o extrato foi filtrado em papel de filtro comum, obtendo-se 2200 mL e concentrado em evaporador rotatório sob pressão reduzida, até que aparentemente todo o álcool fosse eliminado, reduzindo para aproximadamente 600 mL. Em seguida o extrato foi concentrado em liofilizador a -70 °C, obtendo-se o volume de 109 mL. Este passou a ser denominado extrato hidroetanólico concentrado (EHC), que, posteriormente, foi congelado. A metade do volume do extrato concentrado (54,5 mL), após descongelamento, foi centrifugada a 5000 rpm por 5 minutos, para a retirada de uma substância de aspecto viscoso. O sobrenadante do extrato hidro etanólico concentrado (SEHC) foi utilizado para determinação das possíveis atividades antibacteriana e antifúngica.

Uma alíquota de 25 mL do EHC de S. vulgaris, foi também descongelada e submetida à técnica de partição líquido-líquido com clorofórmio (10 extrações consecutivas de 60 mL cada), acetato de etila (5 extrações de 60 mL) e n-butanol (9 extrações de 60 mL). O critério adotado para definir o número de extrações com cada solvente, foi a ausência de coloração no líquido extrator. As frações obtidas foram concentradas em evaporador rotatório sob pressão reduzida, e até a secura em banho-maria (55 °C), e denominadas, F_1, F_2, F_3, respectivamente. A fração restante, denominada F4, após concentração em evaporador rotatório foi liofilizada.

Determinação da atividade antimicrobiana

O sobrenadante do extrato hidroetanólico concentrado (SEHC), foi esterilizado por filtração em membrana esterilizante Millex^®, poro 0,22 mm, e submetido a testes de atividade antimicrobiana frente às bactérias Bacillus cereus (ATCC 11778), B. subtilis (ATCC 6633), Escherichia coli (ATCC 8739), Klebisiella pneumoniae (ATCC 13883) Micrococcus luteus (ATCC 9341), Salmonella typhimurium (ATCC 14028), Staphylococcus aureus (ATCC 6538), S. epidermidis (ATCC 12228), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619), P. aeruginosa (ATCC 27853) e as leveduras Candida albicans (ATCC 10231) e Saccharomyces cerevisiae (ATCC 2601).

As frações F₁, F₂, F₃ e F₄ foram emulsionadas em solução de Tween 80 a 2% e esterilizadas (Millex^®). As mesmas foram submetidas à testes de atividade antimicrobiana frente a duas amostras bacterianas, B. cereus (ATCC 11778), Gram positiva e P. aeruginosa (ATCC 27853), Gram negativa.

Para as provas de avaliação antimicrobiana do SEHC e das frações F₁, F₂, F₃ e F_4, utilizaram-se placas de Petri de 9 cm de diâmetro, contendo 20 mL de ágar Mueller-Hinton (Difco), para bactérias e 20 mL de ágar Sabouraud (Difco) para leveduras.

Com auxílio de um furador de rolhas, estéril, foram feitos orifícios de 7 mm de diâmetro no gel, para receberem os extratos, as frações e as soluções controle.

Na avaliação da atividade antimicrobiana do SEHC, utilizou-se suspensões de cada microrganismo feitas em solução fisiológica correspondendo ao tubo nº 1 da escala MacFarland. Neste ensaio, usou-se 50 mL do extrato e 50 mL de solução controle estéril (solução aquosa).

Na avaliação da atividade antibacteriana das frações F₁ a F₄ utilizou-se suspensões de microrganismo em solução estéril correspondentes a 90% e 95% de transmitância, leitura espectofotométrica em comprimento de onda de 520 nm. As suspensões de cada microrganismo foram inoculadas nas respectivas placas de Petri contendo meio de cultura, através da técnica de sementeira em superfície utilizando "swab" estéril. As placas de Petri, onde foram inoculadas separadamente as suspensões de microrganismo, correspondente a 90% de transmitância para B. cereus e para P. aeruginosa, receberam em cada orifício, alíquotas de 50 mL e 100 mL das amostras esterilizadas, preparadas com as frações F₁, F₂, F₃ e F₄ na proporção de 40 mg/mL em Tween 80 a 2%.. As placas de Petri, onde foram inoculadas as suspensões de microrganismo, correspondentes a 90% de transmitância para B. cereus e para P. aeruginosa, receberam em cada orifício 100 mL das referidas amostras. Nestes ensaios, foram utilizados para controle, 100 mL de uma solução de Tween 80 a 2% e 100 mL de uma solução preparada com 40 mg de n-butanol em 1 mL de Tween a 2%, ambas estéreis. Estas placas receberam também, em um dos orifícios, 100 mL de amostra, preparada com 40 mg do EHC com 1 mL de Tween 80 a 2%. A esterilização de todas as amostras foi feita através de filtração em membranas esterilizantes Millex^® poro 0,22 mm.

As placas foram incubadas em estufa a 37 °C por 24 horas, para bactérias, e à temperatura ambiente por 48 horas, para fungos. Após este período, o diâmetro da zona de inibição foi mensurado com o auxílio de régua milimetrada. Considerou-se, no resultado, a diferença entre o diâmetro total da inibição e o diâmetro do orifício (7 mm).

O teste de difusão em ágar para determinação da atividade antimicrobiana foi realizado com base nas recomendações do NCCLS (1997).

Caracterização fitoquímica

As folhas foram secas em estufa com circulação de ar aquecido à 45 °C, por cerca de 48 horas. Após a secagem, o material foi triturado em moinho manual e, submetido a reações para caracterização de alcalóides, antraquinônicos, livres e combinados, cumarinas e flavonóides (Costa, 1982). Para investigação de óleo essencial utilizou-se cromatografia em camada delgada do destilado de 1 g do material vegetal (Wagne, Bladt, 1984). Para pesquisa de taninos utilizaram-se reações de precipitação com gelatina e cafeína e para investigação de saponinas foi observado a ocorrência de espuma persistente do extrato aquoso (Alice et al., 1995).

No extrato hidroetanólico foram investigadas as presenças de flavonóides, taninos e saponinas, seguindo as mesmas metodologias relatadas anteriormente.

As frações foram submetidas à teste para flavonóides (Costa, 1982), para proantocianidinas (Santos, Mello In: Simões, 2002) e para saponinas (Alice et al., 1995).

Caracterização espectroscópica

As frações do extrato hidroetanólico com os solventes acetato de etila (F₂), n-butanol (F₃) e água (F₄), foram submetidas às técnicas espectroscópicas, no ultravioleta (Espectrofotômetro Shimadzu, UV-visível 1601PC), usando os aditivos cloreto de alumínio/ácido clorídrico, acetato de sódio/ácido bórico e no infravermelho (Espectrômetro Shimadzu IR-408, em pastilhas de KBr).

RESULTADOS

A tabela 1 mostra os resultados, obtidos com a utilização do sobrenadante do extrato hidroetanólico de S. vulgaris, frente a 10 amostras bacterianas e 2 fúngicas. O extrato não recebeu ajuste de pH, que apresentou valores entre 5,3 - 5,5.

A tabela 2 mostra os resultados obtidos com as frações F₁, F₂, F₃ e F₄, obtidas pela partição líquido-líquido do extrato hidroetanólico concentrado (EHC) de S. vulgaris.

Na folha foram identificados os seguintes grupos químicos: flavonóides, taninos e saponinas. No extrato hidroetanólico concentrado (EHC) foram pesquisadas e detectadas as presenças de flavonóides, taninos e saponinas. Nas frações F₂, F₃ e F₄, foram constatadas as presenças de flavonóides, proantocianidina e saponinas, mas em quantidades aparentemente diferentes.

A tabela 3 expressa os resultados obtidos na identificação dos grupos químicos presentes nas frações F₂, F₃ e F₄ de S. vulgaris, com as diferentes intensidades de coloração, em se tratando de flavonóides e proantocianidinas (taninos condensados), e capacidade de promover a formação de espuma persistente, no que se refere a saponinas.

No espectro de absorção no ultravioleta com a fração F₂, usando solução 0,04 mg/mL em metanol foram observados dois máximos de absorção: um ocorrendo em 280 nm e outro em 363 nm.

Com a adição de cloreto de alumínio e nova leitura, ocorreu um deslocamento da curva de absorção que não foi regenerado com a adição subseqüente de ácido clorídrico (10% em metanol). Em uma outra porção da mesma solução em metanol, após a adição de acetato de sódio, foi observado no espectro de absorção um novo deslocamento da curva original que não foi regenerado com a adição subseqüente de ácido bórico.

A fração F₃, dissolvida na mesma proporção (0,04 mg/mL) em metanol, quando submetida à análise espectrôfotométrica no UV-visível, apresentou espectro com um máximo de absorção em 255 nm. Após adição de cloreto de alumínio houve deslocamento da curva, o qual foi regenerada com a adição de ácido clorídrico. Em nova porção desta solução, após adição de acetato de sódio e nova leitura no espectrofotômetro-UV, foi observado deslocamento da curva a qual não foi regenerada com a adição de ácido bórico.

A fração F₄, dissolvida em metanol na mesma proporção já relatada, quando analisada pela espectrofotometria na região UV-visível apresentou máximo de absorção em 265 nm. Após adição de cloreto de alumínio houve deslocamento da curva que foi praticamente regenerada com adição de ácido clorídrico.

Uma nova porção desta solução (F₄), quando adicionada de acetato de sódio, apresentou deslocamento batocrômico da curva no espectro, o qual não foi regenerado com ácido bórico.

O espectro na região do infravermelho da fração, obtida no fracionamento com acetato de etila (F₂), apresentou bandas de absorção em torno de 1620, 1510 e 1430 cm^-1. O espectro na região do infravermelho da fração obtida com n-butanol (F₃), apresentou bandas de absorção em 1610, 1500 e 1440 cm^-1 e o mesmo espectro da fração, obtida da fração aquosa (F₄), apresentou banda de absorção em 1620 cm^-1.

Os espectros, obtidos na região do infravermelho de todas as frações apresentaram também bandas de absorção entre 3500 – 3200 cm^-1.

DISCUSSÃO

Na investigação da possível ação antimicrobiana da espécie S. vulgaris, pode-se evidenciar a inibição do crescimento das amostras bacterianas pelo extrato hidroetanólico. Esse extrato inibiu algumas amostras de bactérias Gram positivas e Gram negativas. O extrato não inibiu, nas condições testadas, o crescimento das leveduras C. albicans e S. cerevisiae. A fração que forneceu maior halo de inibição, tanto para bactéria Gram positiva como para Gram negativa, foi a F₃, na qual foi evidenciada a presença de flavonóides, proantocianidinas e saponinas. Esta fração inibiu a amostra Gram negativa somente quando foi aumentada a concentração da emulsão e diminuída a concentração da suspensão de bactérias.

Foram detectados flavonóides, taninos e saponinas nas folhas e no extrato hidroetanólico concentrado (EHC).

Nas frações F₂, F₃ e F₄, as seguintes bandas de absorção no ultravioleta foram observadas: F₂ = 380-363 nm; F₃ = 255 nm; F₄ =265. Os flavonóides apresentam no ultravioleta 2 máximos de absorção, um entre 240-285 nm e outro entre 300-400 nm (Zuanazzi; Montanha, 1970).

Com o uso de aditivos (AlCl₃, NaOAc e H₃BO₃) foi detectada a presença de hidroxila quelatogênica na fração F₂ e hidroxilas na posição orto nas frações F₂, F₃ e F₄ (Mabry, et al. , 1970).

No espectro no infravermelho de F₂, F₃ e F₄ foram encontradas as seguintes bandas de absorção: F₂ = 1620, 1510 e 1430 cm^-1 ; F₃ = 1610, 1500 e 1440 cm^-1; F₄ =1620 cm^-1. Bandas fortes, características do esqueleto aromático e de heteroaromático, aparecem na região 1600-1300 cm-¹ e bandas de absorção entre 3500-3200 cm-¹ indicam a presença de hidroxila (Silverstein et al., 1994).

A presença de flavonóides e proantocianidinas na família Lorantaceae foi descrita por Fernandez et al. (1988). Segundo Marles et al. (2003), as proantocianidinas têm recebido considerável atenção como agentes de proteção na prevenção de infecções do trato urinário e, devido a sua ação antioxidante, na prevenção de doenças cardiovasculares.

De acordo com Zee Cheng (1997), estudos demonstraram algumas ações farmacológicas de algumas Loranthaceae como atividade antihipertensiva, antibacteriana, antiviral, diurética e antihepatotóxica. Relatou também a presença do flavonóide quercetina na espécie Loranthus parasiticus.

Kontiokari et al. (2001), compararam a atividade do suco dos frutos das espécies de Vaccinium (cranberry-lingonberry) com a bebida Lactobacillus GG na prevenção de infecção no trato urinário em mulheres. Concluíram que, ingerir regularmente este suco, poderia reduzir a recorrência de infecção, causada pela Escherichia coli, o que não correu com a bebida de lactobacilos. Os frutos da espécie Vaccinium contêm proantocianidinas. Alguns destes compostos possuem propriedades antivirais, antibacterianas, antiaderentes ou antioxidantes. As proantocianidinas inibem a atividade das moléculas de adesão. O bloqueio da adesão fimbrial pelo suco dos frutos de Vaccinium previne a E. coli e outras bactérias Gram negativas de colonizar as células uroepteliais. Segundo os autores, a profilaxia e tratamento com antimicrobianos pode resultar no aumento de resistência bacteriana entre bactérias uropatogênicas, e o suco dos frutos de Viccinium seria uma alternativa para a prevenção de infecção no trato urinário, que poderia levar à diminuição no uso de antimicrobianos.

A espécie S. vulgaris, usada em nosso experimento, encontrava-se vegetando sobre Psidium guajava (goiabeira). Gnan e Demello (1999), demonstraram que o extrato de folhas da goiabeira era ativo contra alguns microrganismos, principalmente para Sthaphylococcus aureus e que este extrato poderia ser uma importante fonte de novos compostos antimicrobianos e que poderia ser usado na conservação de alimentos e como antibióticos.

Os flavonóides são grupos químicos que também apresentam atividade antimicrobiana e são encontrados freqüentemente nas frutas, em muitas espécies vegetais (Zuanazzi; Montanha, 2003).

Amaro Luis et al. (1997), isolaram e identificaram compostos flavonoídicos da Stevia trifloraide com propriedades antibacterianas.

Recebido em 03/12/04

Aceito em 20/05/05

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2005

Histórico

• Recebido
  03 Dez 2004
• Aceito
  20 Maio 2005