Efeitos dos anabolizantes sobre a densidade de neurônios dos núcleos da base

Effects of anabolic agents on the neuron density of the basal nuclei

Efectos de los anabolizantes en la densidad de las neuronas de los núcleos basales

RESUMO

Objetivos:

Pouco se sabe sobre a atuação dos esteroides androgênicos anabolizantes (EAA) no cérebro humano e, por isso, resolvemos estudar a perda neuronal causada pelo uso e abuso de EAA em camundongos.

Métodos:

Utilizamos 60 camundongos da linhagem Swiss, sendo 30 machos e 30 fêmeas, divididos em três grupos: 20 animais foram tratados com Deposteron^® (cipionato de testosterona); outros 20 animais foram tratados com Winstrol Depot^® (stanozolol); os últimos 20 animais foram tratados com solução salina. Todos foram submetidos à natação por 15 minutos. Finalizado o tratamento, os animais foram sacrificados pelo método de inalação de Halotano. Os encéfalos foram retirados e armazenados em solução de formaldeído a 4% por 24 horas. De cada encéfalo foram retiradas amostras homotípicas da região média do cérebro em cortes frontais para que pudéssemos avaliar as áreas estabelecidas para este estudo.

Resultados:

As análises da estimativa dos perfis celulares mostraram que houve uma diminuição do número de perfis no núcleo pálido dos animais machos tratados com Winstrol Depot^®.

Conclusão:

Esses resultados nos permitem inferir que o uso inadequado e sem orientação médica de EAA pode levar a degenerações celulares.

Descritores:
anabolizantes; neurônios; gânglios da base; corpo estriado; globo pálido

ABSTRACT

Objectives:

Little is known about the action of anabolic-androgenic steroids (AAS) on the human brain and, therefore, we decided to study the neuronal loss caused by use and abuse of AAS in mice.

Methods:

We used 60 Swiss mice, 30 males and 30 females, divided into three groups: 20 animals treated with Deposteron^® (testosterone cypionate); another 20 animals were treated with Winstrol Depot^® (stanozolol); the last 20 animals were treated with saline solution. All the animals were submitted to swimming for 15 minutes. After the treatment, the animals were euthanized by halothane inhalation (Halotano) method. The brains were removed and stored in 4% formal-dehyde solution for 24 hours. From each brain, homotypic samples were taken from the middle region of the brain in frontal cuts so that we could evaluate the areas established for this study.

Results:

Analyzes of the estimated cell profiles showed that there was a decrease in the number of profiles in the pallidal nucleus of the male animals treated with Winstrol Depot^®.

Conclusion:

These results allow us to infer that inadequate and non-medical use of AAS can lead to cellular degeneration.

Keywords:
anabolic agents; neurons; basal ganglia; corpus striatum; globus pallidus

RESUMEN

Objetivos:

Poco se sabe acerca del efecto de la acción de los esteroides anabólicos androgénicos (EAA) en el cerebro humano y, por este motivo, decidimos estudiar la pérdida neuronal causada por el uso y abuso de EAA en ratones.

Métodos:

Utilizamos 60 ratones de linaje Swiss, siendo 30 machos y 30 hembras, divididos en tres grupos: 20 animales fueron tratados con Deposteron^® (cipionato de testosterona); otros 20 animales fueron tratados con Winstrol Depot^® (stanozolol); los últimos 20 animales fueron tratados con solución salina. Todos fueron sometidos a natación durante 15 minutos. Terminado el tratamiento, los animales fue-ron sacrificados por el método de inhalación de Halotano. Los cerebros fueron retirados y almacenados en solución de formaldehído al 4% durante 24 horas. De cada cerebro fueron retiradas muestras homotípicas de la región media del cerebro en cortes frontales, así que pudimos evaluar las áreas establecidas para este estudio.

Resultados:

El análisis de la estimación de los perfiles celulares mostró que hubo una disminución en el número de perfiles en el globo pálido de los animales machos tratados con Winstrol Depot^®.

Conclusión:

Estos resultados permiten inferir que el uso inadecuado y sin orientación médica de EAA puede conducir a la degeneración celular.

Descriptores:
anabolizantes; neuronas; ganglios basales; cuerpo estriado; globo pálido

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas essas substâncias vêm sendo utilizadas por atletas de elite, em maior parte, aqueles envolvidos em esportes de força e velocidade, para melhora do desempenho físico nas competições. Entretanto, o abuso dos EAA passou a ser feito por frequentadores de academias, mais interessados nas alterações provocadas na composição corporal, observados com o aumento da massa magra e na redução da gordura subcutânea¹.

Os neurônios do complexo estriado são, em sua maioria, denominados neurônios ou células espinhosas médias, devido ao seu tamanho moderado e ao grande número de espinhas ou espículas dendríticas que, em geral, alcançam apenas a região onde se localiza o corpo celular. Seus axônios formam as únicas fibras eferentes do neostriado e têm como principal neurotransmissor inibidor o Ácido Gama-Amino-Butírico (GABA), mas podem conter outros (também inibidores), em especial neuropeptídeos, como a substância P e a encefalina. Os neurônios do paleostriado ou pallidum (núcleo pálido) são essencialmente GABAér-gicos (inibidores) e disparam espontaneamente, inibindo tonicamente (continuamente) as suas células-alvo. As duas partes do globo pálido estão reciprocamente conectadas (fibras pálido-palidais), mas se prestam a diferentes funções. As principais aferências ao paleostriado são axônios das células espinhosas médias do neostriado (fibras estriado-palidais) de dois tipos: os que se projetam ao pálido-interno (e também à substância negra) e contêm os neurotransmissores GABA e substância P e os que chegam ao pálido-externo e contêm GABA e encefalina².

Na Medicina, os EAA são utilizados geralmente no tratamento de sarcopenias, hipogonadismo, câncer de mama e da osteoporose. Nos esportes, são utilizados para o aumento da força física e da massa muscular; entretanto, os efeitos sobre o desempenho atlético permanecem, ainda, controversos³.

Mello et al.⁴ encontraram em seus estudos que o uso abusivo dos EAA pode acarretar o aparecimento de efeitos colaterais reversíveis e irreversíveis, na maioria dos sistemas do organismo (fígado, sistema cardiovascular e endócrino). Dentre esses efeitos podem ocorrer danos no tecido hepático, atrofia de testículos, hipertrofia de clitóris e, em alguns casos, podem chegar à hipertensão arterial e à hipertrofia ventricular esquerda.

O uso abusivo de EAA é baseado em doses suprafisiológicas que são de 10 a 100 vezes maiores que as doses terapêuticas, e isso tem sido associado a um amplo espectro de efeitos adversos físicos e psíquicos. Pouco se sabe sobre a atuação dos EAA no cérebro humano, havendo relatos de alterações no comportamento agressivo, ansiedade e depressão, segundo relatos de Ambar e Chiavegatto⁵, Pope e Katz⁶ e Schulte et al.⁷

Recentes modelos animais demonstraram que o uso crônico e o abuso de EAA (stanozolol) reduziam os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro e dopamina no hipocampo e córtex pré-frontal. Além da redução na expressão dos receptores de glucocorticóides no hipocampo e no plasma e aumento dos níveis basais matinais de cortisol plasmático. Estas alterações metabólicas têm sido relacionadas a distúrbios do humor, como a depressão^8,9.

Alguns estudos^10,11 investigaram mecanismos moleculares cerebrais relacionados aos efeitos comportamentais de altas doses de EAA em roedores. O uso crônico de EAA em camundongos mostrou-se indutor de mudanças no nível de fator neurotrófico derivados do cérebro, dependentes de dose, sexo e idade na expressão gênica da subunidade do receptor GABA_A em áreas cerebrais anteriores sugerindo o envolvimento do sistema inibitório GABAérgico.

Após conhecer a estrutura e a função dos núcleos da base, a relação desta estrutura com os esteroides anabolizantes, o crescente uso indevido de substâncias anabolizantes, além da escassez de estudos para elucidar os efeitos deletérios do uso de tais substâncias, quando utilizadas sem o devido acompanhamento médico, achamos por bem estudar quais os efeitos de tais substâncias nos corpos celulares de neurônios dos animais usados neste experimento.

MATERIAIS E MÉTODOS

O presente estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CEUA-Unifal-MG) sob registro nº 414/2012. Sessenta camundongos da linhagem Swiss, com idade aproximada de 90 dias (jovens-adultos), peso corpóreo entre 40 e 50 gramas, sendo 30 machos e 30 fêmeas, foram alojados em caixas contendo cinco animais cada, tratados com ração comercial e água “ad libitum” e mantidos em ciclo de 12 horas claro-escuro.

O tratamento consistiu na aplicação, por via intraperitoneal (IP), de dois esteroides anabolizantes: o primeiro, comercializado com o nome de Deposteron^® (Cipionato de Testosterona) e o segundo, comercializado pelo nome de Winstrol Depot^® (stanozolol), nas doses conforme . Os animais foram tratados durante um mês, com aplicações realizadas duas vezes por semana (nas terças e quintas feiras). As doses utilizadas nos animais foram baseadas na quantidade de EAAs utilizada pelos usuários frequentadores de academias da cidade de Alfenas e, para isso, utilizamos o método de Extrapolação Alométrica¹².

Nas quartas e sextas feiras, durante os 30 dias de tratamento, os animais foram submetidos à natação por 15 minutos, realizado em um recipiente medindo 43x34x26cm e contendo no seu interior água, na temperatura de 24-26ºC até a borda.

Quadro 1
Grupo de animais de acordo com EAA e a dosagem utilizada.

Coleta das amostras

Após o tratamento os animais foram eutanasiados através da inalação de Halotano e retirados os encéfalos com o auxílio de um alicate. Estes foram então armazenados em recipientes de vidro contendo formaldeído a 4% pH 7,4 0,1M, permaneceram imersos nesta solução fixadora por 24 horas, seguindo o protocolo utilizado por Rabinowiz et al.¹³. Em cada encéfalo foram retiradas amostras homotípicas da região média do cérebro em cortes frontais¹⁴ para que possamos avaliar as áreas então estabelecidas para este estudo.

Os fragmentos foram processados seguindo-se a sequência padronizada nos procedimentos histológicos convencionais: desidratação em álcool, diafanização em xilol e inclusão em parafina. Cada amostra com as referidas áreas a serem analisadas de acordo com o atlas de Paxinos e Franklin¹⁵, foi emblocada e cortada com espessura de 7µm em micrótomo Lupe^® e coradas com violeta cresil para facilitar a visualização dos Corpúsculos de Nissl dos corpos de neurônios e assim possibilitar marcar fortemente e individualmente cada célula para posterior contagem.

Para a estimativa da densidade por área dos perfis de corpos celulares de neurônios utilizamos a metodologia de contagem aleatória simples^16-20. Neste método adquirimos dois campos microscópicos aleatórios de três cortes semi seriados da área, totalizando assim seis (6) áreas analisadas por animal. Nestas áreas marcamos somente os perfis dos corpos celulares de neurônios que se encontram dispostos dentro da área teste (counting frame). Desta forma, aferimos o número de células por área contada, e não o número total dessas células nos Núcleo Estriado e Núcleo.

Esta análise foi feita com o auxílio de um Sistema Analisador de Imagens Axiovision 4 Module Interactive Mensuerement da marca Carl Zeiss^® acoplado a um microscópio Axio Scope A1 da marca Carl Zeiss^® e um computador.

Análise estatística

O estudo representa um delineamento inteiramente casualizado (DIC), portanto, a análise estatística foi realizada por meio de análise da variância (ANOVA) seguida do teste de comparação das médias de Tukey. Para tal análise utilizou-se o Programa GraphPad Prism 5. Valores de p<0,05 foram considerados como indicativos de significância.

RESULTADOS

De acordo com os resultados obtidos, conforme demonstra a Figura 1, pode-se observar que não houve diferenças significativas do número de perfis neuronais no Núcleo Estriado de machos (Figura 1A), sendo a média do número de perfis dos grupos: Controle (33.7), Deposteron^® (32,5) e Winstrol^® (34,7); no Núcleo Estriado de fêmeas (Figura 1B), com a média do número de perfis dos grupos: Controle (37,5), Deposteron^® (33,3) e Winstrol^® (33,2); e no Núcleo Pálido de fêmeas (Figura 1C), sendo que a média do número obtido de perfis celulares são: Controle (16), Deposteron^® (15,4) e Winstrol^® (13,8); quando comparados os grupos experimentais com o grupo controle.

Entretanto pode-se observar uma diminuição estatisticamente significante no número de perfis neurais no Núcleo Pálido dos animais machos tratados, demonstrado na Figura 2, sendo que as médias do número obtido de perfis celulares são: Controle (23.2), Deposteron^® (21) e Winstrol^® (13).

DISCUSSÃO

Pode-se observar, após análise quantitativa que houve uma diminuição estatisticamente significante no número de perfis neurais no Núcleo Pálido dos animais machos tratados com Wistrol^®, comparados aos animais controle. Esse resultado se assemelha ao encontrado por Damião et al.²¹, que demonstrou uma diminuição significativa na quantidade de corpos celulares de neurônios no córtex cerebral de camundongos tratados com esteroides anabolizantes, quando comparados com o grupo controle; e Kalinine²² cujos estudos demonstram que os esteroides anabolizantes podem ter atividade deletéria sobre o SNC de humanos, se manifestando por alterações morfológicas, funcionais e comportamentais.

Cinco conceitos são fundamentais para a compreensão anatômica e funcional dos Núcleos da Base: a) suas lesões não resultam em paralisias, mas sim em disfunção dos movimentos e também podem causar déficits significativos cognitivos e de percepção; b) anatômica e funcionalmente, são agrupados em circuitos que processam diferentes tipos de informação; c) eles funcionam primariamente através de desinibições; d) suas patologias podem resultar de disfunções das interações neuroquímicas entre os seus componentes e dependem não apenas de neurotransmissores, mas também de receptores, da localização das sinapses e de outros fatores que atuam nos seus neurônios; e) eles integram circuitos paralelos que seguem o trajeto Córtex Cerebral - Núcleos da Base - Tálamo - Córtex Cerebral².

Acompanhando o terceiro conceito citado a cima por Haines², outros autores^8,9 demonstraram que recentes modelos animais tratados com uso crônico e abusivo de esteroide anabolizante (stanozolol) reduziram os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). O BDNF é uma proteína endógena responsável por regular a sobrevivência neuronal e a plasticidade sináptica do sistema nervoso periférico e central, sendo que a redução dos níveis dessa substância levaria à morte neuronal e consequente diminuição do número de perfis neuronais, como relatado no presente estudo.

Alguns estudos^10,11 também investigaram mecanismos moleculares cerebrais relacionados aos efeitos comportamentais de altas doses de

Figura 1
Gráficos comparativos da estimativa do número de perfis neurais no núcleo estriado nos animais machos e fêmeas e pálido nos animais fêmeas.

Figura 2
Gráfico comparativo da estimativa do número de perfis neurais no núcleo pálido.

esteroides anabolizantes em roedores. O uso crônico de EAA em camundongos mostrou-se indutor de mudanças na expressão gênica da subunidade do receptor GABA_A em áreas cerebrais anteriores, sugerindo o envolvimento do sistema inibitório GABAérgico. Essas mudanças na expressão gênica da subunidade do receptor poderia gerar a morte dos neurônios do Núcleo Pálido dos animais tratados, já que as células desse núcleo são essencialmente GABAérgicos².

Ballard e Wood²³ afirmam que existem três tipos principais de modificações da molécula de testosterona tais como: a hidroxilação na posição C-10 para aumentar a potência relativa (p.ex., nandrolona); esterificação para diminuir a taxa de inserção em circulação (por exemplo, cipionato de testosterona²⁴; e alquilação na posição C-17 para reduzir a primeira passagem do metabolismo no fígado, permitindo assim a administração oral, por exemplo, estanozolol^25-27. Através disso podemos inferir que a ação do Winstrol^® foi maior que a do Deposteron^® devido ao processamento pelo qual o Winstrol^® (Stanozolol) passou (alquilação na posição C-17), que permitiu a utilização desse por via oral. Porém, a administração do Winstrol^® nesse experimento foi feita por meio IP, podendo ter sido mais eficaz pelo fato de não passar através do processo de digestão no estômago e, assim, ter sido maior e mais rápida a sua absorção pelo organismo.

As mais conhecidas funções dos Núcleos da Base estão associadas aos sistemas motores somático (circuito motor) e visual (circuito oculomotor). No entanto, ainda não está bem esclarecido o papel dos circuitos pré-frontal dorsolateral, órbito-frontal lateral e límbico nos distúrbios cognitivos e associativos. Portanto, a perda neuronal encontrada nesse estudo pode gerar alterações hipocinéticas ou hipocinesias, com redução dos movimentos, ou alterações hipercinéticas ou hipercinesias, com aumento dos movimentos.

CONCLUSÃO

Os resultados apresentados nesse estudo nos permitem concluir que houve uma diminuição significativa de perfis neuronais no Núcleo Pálido (43%) dos animais machos tratados com Winstrol Depot^®.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a agência de fomento Fapemig pelo financiamento na publicação deste artigo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  May-Jun 2017

Histórico

• Recebido
  06 Jul 2015
• Aceito
  08 Dez 2016