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ÓXIDO NÍTRICO E DINÂMICA DE CA2+ EM CARDIOMIÓCITOS: INFLUÊNCIA DA CAPACIDADE DE EXERCÍCIO

NITRIC OXIDE AND CA2+ DYNAMICS IN CARDIOMYOCYTES: INFLUENCE OF EXERCISE CAPACITY

ÓXIDO NÍTRICO Y DINAMICA DE CA2+ EN CARDIOMIOCITOS: INFLUENCIA DE LA CAPACIDAD DE EJERCÍCIO

RESUMO

Introdução:

A capacidade intrínseca para o exercício aeróbico está relacionada com o inotropismo cardíaco. Por outro lado, a participação do óxido nítrico (NO) como mensageiro intracelular sobre a dinâmica do Ca2+ ainda permanece desconhecida em ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

Objetivo:

Avaliar se o NO modula diferentemente o transiente intracelular de Ca2+ e liberações espontâneas de Ca2+(sparks) em cardiomiócitos de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

Métodos:

Ratos machos Wistar foram selecionados como desempenho padrão (DP) e alto desempenho (AD), de acordo com a capacidade de exercício até a fadiga, mensurada através de teste de esforço progressivo em esteira. Os cardiomiócitos dos ratos foram utilizados para determinar o transiente intracelular de Ca2+ e Ca2+sparks em microscópio confocal. Para estimar a contribuição do NO foi utilizado o inibidor das sínteses do NO (L-NAME, 100 µM). Os dados foram analisados através de ANOVA two-way seguido do pós-teste de Tukey e apresentados como médias ± EPM.

Resultados:

Os cardiomiócitos de ratos AD exibiram aumentos na amplitude do transiente de Ca2+ em comparação aos DP. Entretanto, o L-NAME aumentou a amplitude do transiente de Ca2+ somente em ratos DP. Não foram encontradas diferenças na constante de tempo de decaimento do transiente de Ca2+ (t) em cardiomiócitos de ratos com DP e AP, contudo, a administração do L-NAME diminuiu o t em cardiomiócitos em ambos os grupos. cardiomiócitos de ratos AD apresentaram menor amplitude e frequência de Ca2+sparks em comparação ao grupo DP. A administração de L-NAME aumentou a amplitude de Ca2+sparks em cardiomiócitos do grupo AD.

Conclusão:

O NO modula o transiente de Ca2+ e as sparks de Ca2+ em cardiomiócitos de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

Descritores:
NG-Nitroarginina metil éster; aptidão física; miócitos cardíacos; cálcio

ABSTRACT

Introduction:

The intrinsic capacity to aerobic exercise is associated with cardiac inotropism. On the other hand, the contribution of nitric oxide (NO) as an intracellular messenger on Ca2+ dynamics remains unknown in rats with different intrinsic capacities to exercise.

Objective:

To evaluate whether NO modulates differently Ca2+ intracellular transient and spontaneous Ca2+ releases (sparks) in cardiomyocytes of rats with different intrinsic capacities to exercise.

Methods:

Male Wistar rats were selected as standard-performance (SP) and high-performance (HP), according to the exercise capacity until fatigue, assessed through a treadmill progressive stress test. Cardiomyocytes of rats were used to determine Ca2+ intracellular transient and Ca2+ sparks evaluated using confocal microscope. To estimate NO contribution, a NO synthase inhibitor (L-NAME, 100 µM) was used. Data were analyzed through two-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test and expressed as means ± SEM.

Results:

Cardiomyocytes of HP rats exhibited higher Ca2+ transient amplitude compared to SP. However, L-NAME increased Ca2+ transient amplitude only in SP rats. No differences were found in Ca2+ transient decay time constant ( t) in cardiomyocytes of SP and HP rats. However, administration of L-NAME caused reduction of tin cardiomyocytes of both groups. Lower amplitude and frequency of Ca2+ sparks were found in cardiomyocytes of HS rats compared to SP group. Administration of L-NAME increased the amplitude of Ca2+ sparks in cardiomyocytes of the HP group.

Conclusion:

NO modulates Ca2+ transient and Ca2+ sparks in cardiomyocytes of rats with different intrinsic exercise capacities.

Keywords:
NG-Nitroarginine methyl ester; physical fitness; myocytes, cardiac; calcium

RESUMEN

Introducción:

La capacidad intrínseca para el ejercicio aeróbico está relacionada con el inotropismo cardiaco. Por otro lado, todavía se desconoce la contribución del óxido nítrico (ON) como mensajero intracelular sobre la dinámica del Ca2+ en ratones con diferentes capacidades intrínsecas para el ejercicio.

Objetivo:

Evaluar si el ON modula diferencialmente la variación transitoria intracelular de Ca2+ y las liberaciones espontaneas de Ca2+ (sparks) en cardiomiocitos de ratones con diferentes capacidades intrínsecas para el ejercicio.

Métodos:

Ratones machos Wistar fueron seleccionados como desempeño estándar (DE) y alto desempeño (AD), de acuerdo con la capacidad de ejercicio hasta la fatiga, medida a través del test de fuerza progresiva en la caminadora o cinta eléctrica. Los cardiomiocitos de los ratones fueron utilizados para determinar el tránsito intracelular y sparks de Ca2+ evaluados en microscopio confocal. Para estimar la contribución del ON fue utilizado un inhibidor de síntesis del ON (L-NAME, 100 µM). Los datos fueron analizados a través de un ANOVA two-way seguido de un post-test Tukey y presentados como promedios ± EPM.

Resultados:

Los cardiomiocitos de ratones AD mostraron aumento en la amplitud de la variación transitoria de Ca2+ en comparación con los DE. Así mismo, el L-NAME incremento la amplitud transitoria de Ca2+ solamente en ratones DE. No se encontraron diferencias en la constante del tiempo de decaimiento de la variación transitoria ( t ) de Ca2+ en cardiomiocitos de ratones DE e AD. Todavía, la administración de L-NAME mostro una reducción en el t en cardiomiocitos de ambos los grupos. Cardiomiocitos de ratones AD presentaron menor amplitud y frecuencia de sparks de Ca2+ en comparación al grupo DE. La administración de L-NAME incrementó la amplitud de sparks de Ca2+ en cardiomiocitos del grupo AD.

Conclusión:

El ON modula la variación de Ca2+ y sparks de Ca2+ en cardiomiocitos de ratones con diferentes capacidades intrínsecas para el ejercicio.

Descriptores:
NG-Nitroarginina metil éster; aptitud física; miocitos cardíacos; calcio

INTRODUÇÃO

O óxido nítrico (NO) modula a função cardíaca, em grande parte, influenciando canais para Ca2+ envolvidos no acoplamento excitação-contração11. Hare JM, Stamler JS. NOS: modulator, not mediator of cardiac performance. Nat Med. 1999;5(3):273-4.. Os mecanismos propostos pelos quais o NO modula negativamente o acoplamento excitação-contração-relaxamento envolvem a redução do influxo de Ca2+através de canais do tipo L e inibição da cAMP-PKA22. Massion PB, Feron O, Dessy C, Balligand JL. Nitric oxide and cardiac function: ten years after, and continuing. Circ Res. 2003;93(5):388-98.,33. Seddon M, Shah AM, Casadei B. Cardiomyocytes as effectors of nitric oxide signalling. Cardiovasc Res. 2007;75(2):315-26.. Entretanto, a literatura aponta resultados conflitantes, e ainda não é possível determinar se os efeitos do NO sobre essas vias ocorrem por mecanismos diretos ou indiretos.

As ações do NO sobre a contratilidade de cardiomiócitos isolados já foram demonstradas44. Petroff MG, Kim SH, Pepe S, Dessy C, Marbán E, Balligand JL, et al. Endogenous nitric oxide mechanisms mediate the stretch dependence of Ca2+ release in cardiomyocytes. Nat Cell Biol. 2001;3(10):867-73.

5. Lunz W, Natali AJ, Carneiro MA, Dos Santos Aggum Capettini L, Baldo MP, et al. Short-term in vivo inhibition of nitric oxide synthase with L-NAME influences the contractile function of single left ventricular myocytes in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2011;89(4):305-10.
-66. Høydal MA, Wisløff U, Kemi OJ, Britton SL, Koch LG, Smith GL, et al. Nitric oxide synthase type-1 modulates cardiomyocyte contractility and calcium handling: association with low intrinsic aerobic capacity. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil. 2007;14(2):319-25.. A inibição, in vitro, das sínteses do NO em cardiomócitos ventriculares através do L-NAME aumenta a taxa de encurtamento e relaxamento celular, aprimorando a função sistólica e diastólica da célula55. Lunz W, Natali AJ, Carneiro MA, Dos Santos Aggum Capettini L, Baldo MP, et al. Short-term in vivo inhibition of nitric oxide synthase with L-NAME influences the contractile function of single left ventricular myocytes in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2011;89(4):305-10.. Por outro lado, Hoydal et al.66. Høydal MA, Wisløff U, Kemi OJ, Britton SL, Koch LG, Smith GL, et al. Nitric oxide synthase type-1 modulates cardiomyocyte contractility and calcium handling: association with low intrinsic aerobic capacity. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil. 2007;14(2):319-25. demonstraram que o NO produzido pela NOS-1 (isoforma neuronal) alterou o desempenho contrátil de cardiomiócitos, aumentando o Ca2+ sistólico.

As sparks de Ca2+ foram primeiramente descritas por Cheng et al.77. Cheng H, Lederer WJ, Cannell MB. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 1993;262(5134):740-4. As sparks são liberações espontâneas de Ca2+através da abertura dos receptores de rianodina (RyR2) em células não estimuladas88. Cheng H, Lederer WJ. Calcium sparks. Physiol Rev. 2008;88(4):1491-545.. O aumento na frequência das sparks de Ca2+, gerado pelo aumento do [Ca2+] no retículo sarcoplasmático (RS), está associado ao surgimento de ondas de Ca2+. Desta forma, a sobrecarga de Ca2+ no RS e as sparks de Ca2+ estão associadas com doenças cardíacas, como as arritmias77. Cheng H, Lederer WJ, Cannell MB. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 1993;262(5134):740-4.,99. Cheng H, Lederer MR, Lederer WJ, Cannell MB. Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes. Am J Physiol. 1996;270(Pt 1):C148-59.. Petroff et al.44. Petroff MG, Kim SH, Pepe S, Dessy C, Marbán E, Balligand JL, et al. Endogenous nitric oxide mechanisms mediate the stretch dependence of Ca2+ release in cardiomyocytes. Nat Cell Biol. 2001;3(10):867-73. demonstraram que em cardiomiócitos isolados, o aumento da liberação de NO em reposta ao estiramento mecânico contribui para o aumento na frequência dassparks de Ca2+.

A contratilidade de miócitos ventriculares e a dinâmica de Ca2+intracelular estão correlacionadas à capacidade intrínseca para o exercício1010. Prímola-Gomes TN, Campos LA, Lauton-Santos S, Balthazar CH, Guatimosim S, Capettini LS, et al. Exercise capacity is related to calcium transients in ventricular cardiomyocytes. J Appl Physiol (1985). 2009;107(2):593-8.. Foi demonstrado que a inibição específica da NOS-1, e, consequentemente, a redução da biodisponibilidade do NO, modularia a dinâmica de Ca2+ em ratos com baixa e alta capacidades aeróbicas66. Høydal MA, Wisløff U, Kemi OJ, Britton SL, Koch LG, Smith GL, et al. Nitric oxide synthase type-1 modulates cardiomyocyte contractility and calcium handling: association with low intrinsic aerobic capacity. Eur J Cardiovasc Prev Rehabil. 2007;14(2):319-25.. Contudo, ainda são desconhecidos os efeitos da inibição simultânea das NOS constitutivas (NOS-1 e NOS-3) sobre a dinâmica do Ca2+.

Assim, o presente estudo objetivou avaliar se o NO modula a dinâmica do Ca2+ em cardiomiócitos ventriculares de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício aeróbico. No presente estudo, a inibição das sintases do NO pelo L-NAME foi usada para estimar a sua contribuição na dinâmica do Ca2+ em cardiomiócitos.

MATERIAIS E MÉTODOS

Ratos Wistar machos, pesando 250 ± 3 g no início do período experimental, foram mantidos em gaiolas coletivas sob um ciclo claro-escuro (14:10-h) e tiveram livre acesso a água e ração. Todos os experimentos foram executados de acordo com o Comitê de Ética para utilização e cuidados de animais de laboratório da Universidade Federal de Minas Gerias, Belo Horizonte, MG, Brasil (protocolo nº. 015/08).

Para determinar o desempenho físico dos animais foi utilizado um protocolo de exercício em esteira. O protocolo foi originalmente proposto por Koch e Britton1111. Koch LG, Britton SL. Artificial selection for intrinsic aerobic endurance running capacity in rats. Physiol Genomics. 2001;5(1):45-52. e adaptado para medir o tempo total de exercício até a fadiga (TTF)1212. Lacerda AC, Marubayashi U, Balthazar CH, Leite LH, Coimbra CC. Central nitric oxide inhibition modifies metabolic adjustments induced by exercise in rats. Neurosci Lett. 2006;410(2):152-6.. Resumidamente, uma semana antes dos testes de exercício até a fadiga, os ratos foram familiarizados em esteira motorizada (Letica Scientific Instruments, Barcelona, Espanha), durante cinco dias consecutivos (5 min/dia; 5% de inclinação) e com aumentos diários da velocidade da esteira (10, 10, 11, 13, 15 m/min). O estímulo elétrico da esteira foi ajustado para 0,28 mA. A intensidade e duração do exercício estavam abaixo dos níveis necessários para produzir adaptações ao treinamento1313. Baldwin KM, Cooke DA, Cheadle WG. Time course adaptations in cardiac and skeletal muscle to different running programs. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 1977;42(2):267-72.. Animais que não foram capazes de se adaptar à esteira rolante foram excluídos do estudo (menos de 10%). Após a semana de adaptação, cada animal realizou, em três dias alternados, três testes de exercício progressivo até a fadiga (velocidade inicial de 10 m/min; 5% de inclinação). Durante os testes, a velocidade da esteira foi aumentada em 1 m/min a cada 3 min. A fadiga foi definida e o teste foi interrompido, quando o rato não era capaz de manter o ritmo de velocidade da esteira1414. Rodrigues AG, Lima NR, Coimbra CC, Marubayashi U. Intracerebroventricular physostigmine facilitates heat loss mechanisms in running rats. J Appl Physiol (1985). 2004;97(1):333-8..

A estratégia de seleção dos animais usada no presente estudo foi baseada no tempo de exercício até a fadiga de cada animal, de acordo com o dia de melhor desempenho físico1515. Britton SL, Koch LG. Animal genetic models for complex traits of physical capacity. Exerc Sport Sci Rev. 2001;29(1):7-14.. Foram formados dois grupos experimentais: desempenho padrão (DP) e alto desempenho (AD). De acordo com o critério metodológico adotado, animais com TTF entre 16,33 e 46,57 min foram incluídos no grupo DP, ou seja, que tivesse um TTF que não fosse maior e nem menor que um desvio padrão da média da população. Os animais que obtiveram um TTF > 46,57 foram incluídos no grupo AD1111. Koch LG, Britton SL. Artificial selection for intrinsic aerobic endurance running capacity in rats. Physiol Genomics. 2001;5(1):45-52.,1616. Wisløff U, Najjar SM, Ellingsen O, Haram PM, Swoap S, Al-Share Q, et al. Cardiovascular risk factors emerge after artificial selection for low aerobic capacity. Science. 2005;307(5708):418-20..

Dois dias após o teste de fadiga, os ratos foram pesados, em seguida foi realizada a eutanásia e os corações rapidamente removidos. Cardiomiócitos ventriculares dos grupos DP e AD foram enzimaticamente isolados como previamente descrito1717. Oliveira FA, Guatimosim S, Castro CH, Galan DT, Lauton-Santos S, Ribeiro AM, et al. Abolition of reperfusion-induced arrhythmias in hearts from thiamine-deficient rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007;293(1):H394-401.. Resumidamente, os corações foram montados em sistema de Langendorff e perfundidos durante ~5 min com solução livre de Ca2+ contendo (em mM): 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl2, 0,33 NaH2PO4, 1 lactato, 3 piruvato, 22 glicose, and 25 HEPES (pH 7,4). Após esta etapa, os corações foram perfundidos durante 10-15 min com solução contendo 1 mg/mL de colagenase tipo II (Worthington) e 0,17 mg/mL de protease tipo IX (Sigma, St. Louis, MO). Em seguida, os corações foram cortados em pequenos fragmentos e as células isoladas por agitação mecânica e então estocadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab, Campinas, Brasil). Somente miócitos tolerantes ao Ca2+, em repouso e com morfologia típica foram estudados. Os miócitos cardíacos isolados foram utilizados até 2-3 h após isolamento.

Medida para liberação de Ca 2+ (transiente intracelular de Ca 2+) e liberação espontânea de Ca 2+ (sparks de Ca 2+)

Cardiomiócitos isolados dos grupos DP e AD obtidos na condição de repouso foram carregados com 5 µM fluo-4 AM (Molecular Probes, Eugene, OR), durante 20 min em temperatura ambiente e então, lavadas com solução extracelular contendo 1,8 mM Ca2+ para remover o excesso da sonda1818. Lauton-Santos S, Guatimosim S, Castro CH, Oliveira FA, Almeida AP, Dias-Peixoto MF, et al. Kinin B1 receptor participates in the control of cardiac function in mice. Life Sci. 2007;81(10):814-22.. A reação da sonda ao Ca2+ quando excitada em comprimento de onda de 488 nm, emite um sinal fluorescente que é capturado em 510 nm. Alterações na intensidade de fluorescência foram expressas como a razão F/F0. Na medida de transiente de Ca2+, F0representa a média de fluorescência mínima medida na fase diastólica cardíaca. Transientes de Ca2+ foram evocados com estimulação elétrica de campo através de um par de eletrodos de platina com pulsos retangulares. As células foram estimuladas à 1 Hz para produzir a condição de steady-state.As imagens fluorescentes (transiente e sparks de Ca2+) foram obtidas em microscópio confocal Zeiss LSM 510 Meta (Zeiss GmbH, Jena, Alemanha) utilizando sistema Meta LSM 510 com objetiva de imersão à óleo x63 (Zeiss, Jena, Germany). Para armazenamento das imagens, os miócitos foram escaneados com feixe posicionado randomicamente ao longo da célula, evitando cruzar o núcleo. Transientes foram registrados a cada 1,54 ms e, sequencialmente armazenados para criação de imagens com duas dimensões contendo o tempo no eixo x. As sparks de Ca2+ foram mensuradas nas células em condições de repouso e as imagens foram analisadas por meio da interface SparkMaster, no software ImageJ1919. Picht E, Zima AV, Blatter LA, Bers DM. SparkMaster: automated calcium spark analysis with ImageJ. Am J Physiol Cell Physiol. 2007;293(3):C1073-81.. O processamento das imagens dos transientes foi realizado em uma plataforma caseira desenvolvida no programa MatLab(r).

Para avaliar o envolvimento do NO sobre o transiente de Ca2+ e assparks de Ca2+, os experimentos foram executados em miócitos ventriculares pré-incubados durante 20 min com 100 µM do inibidor não seletivo das enzimas sintetizadoras do NO, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, Sigma, St. Louis, MO).

Análise Estatística

Os dados estão apresentados com média ± EPM. Diferenças entre os grupos nas medidas de peso corporal, peso do coração, relação peso coração/peso corporal e TTF foram calculadas utilizando teste t deStudent não pareado. ANOVA Two-way seguido do post hoc de Tukey foi utilizada para calcular diferenças na amplitude do transiente de Ca2+, constante de tempo para o decaimento do transiente de Ca2+, frequência e amplitude dassparks de Ca2+. O nível de significância adotado foi de 5%.

RESULTADOS

A tabela 1 resume as características desempenho físico e as características morfométricas dos grupos DP e AD. O TTF foi significativamente maior no grupo AD quando comparado ao DP. Não formam observadas diferenças na massa corporal, massa do coração ou razão massa do coração/massa corporal.

Tabela 1
TTF, peso corporal, peso do coração ou razão peso coração/peso corporal em ratos DP e AD.

Na Figura 1A estão apresentadas imagens representativas do transiente intracelular de Ca2+em cardiomiócitos de ratos DP e AD carregados com o indicador fluorescente fluo-4 AM. Como demonstrado naFigura 1B, cardiomiócitos de ratos AD exibiram maior amplitude do transiente de [Ca2+]i comparado ao grupo DP (7,43 ± 0,97 vs. 5,03 ± 0,71 F/F0; P < 0,05). De forma interessante, a inibição das sintases de NO com L-NAME em cardiomiócitos de ratos DP aumentou amplitude do transiente de Ca2+ (8,68 ± 0,64 F/F0; P < 0,05), mas não alterou este parâmetro no grupo AD (8,80 ± 0,75 F/F0; P > 0,05). Não foram encontradas diferenças no tempo da recaptação do Ca2+ citosólico (figura 1C) entre os grupos DP e AD, mas a administração do L-NAME diminuiu o tempo para recaptação do Ca2+ em ambos os grupos DP (312,93 ± 33,09 para 177,20 ± 31,35 ms; P < 0,05) e AD (352,88 ± 41,74 para 215,48 ± 35,16 ms; P < 0,05).

Figura 1
Transientes de Ca2+ em Cardiomiócitos. (A) Imagens representativas de cardiomiócitos carregados com o marcador para Ca2+ fluo 4-AM. (B) Amplitude do transiente (F/F0) de Ca2+. (c) constante de tempo do decaimento do transiente. DP= desempenho padrão (n= 79 células de 10 ratos). AD= alto desempenho (n= 53 células de cinco ratos). L-NAME= células incubadas com L-NAME (20 min, 100 µM). *, diferente do grupo sem L-NAME (P < 0,05). #, diferente do grupo DP sem L-NAME (P < 0,05).

Imagens representativas das sparks de Ca2+ estão ilustradas na Figura 2A. Como demonstrado naFigura 2B, cardiomiócitos do grupo AD exibiram menor frequência das sparks de Ca2+ em comparação ao grupo DP (6,07 ± 0,77 vs. 9,49 ± 0,71 em 100 µm/s; P < 0,05), entretanto, o tratamento com L-NAME não alterou a frequência dassparks de Ca2+ em ambos os grupos (P > 0,05). Como apresentados na Figura 2C, cardiomiócitos de ratos AD apresentaram menor amplitude das sparks de Ca2+ quando comparado ao grupo DP (0,60 ± 0,03 vs.0,81 ± 0,02 ΔF/F0; P < 0,05), mas, o tratamento com L-NAME aumentou a amplitude das sparks de Ca2+ somente no grupo AD (0,90 ± 0,03 ΔF/F0; P < 0,05).

Figura 2
Sparks de Ca2+. (A) Imagens representativas das sparks espontâneas de Ca2+. (B) Frequência das sparks de Ca2+. (C) Amplitude das sparks de Ca2+. DP= desempenho padrão (n= 79 células de 10 ratos). AD= alto desempenho (n= 53 células de cinco ratos). L-NAME= células incubadas com L-NAME (20 min, 100 µM). *, diferente do grupo sem L-NAME (P < 0,05). #, diferente do grupo DP sem L-NAME (P < 0,05).

DISCUSSÃO

Avaliamos no presente estudo os efeitos do NO sobre o transiente intracelular de Ca2+ e as sparks de Ca2+ em cardiomiócitos de ratos com desempenho padrão e alto desempenho para o exercício. Confirmando nossa hipótese, ratos dos grupos DP e AD apresentaram diferenças intrínsecas no transiente de Ca2+ intracelular e nassparks de Ca2+. Foi observado que a capacidade intrínseca para desempenho físico modulou a dinâmica de Ca2+ por mecanismos que envolvem a síntese do NO. Juntos, esses resultados ajudam a explicar algumas diferenças intrínsecas observadas na capacidade para exercício aeróbico entre ratos DP e AD.

Os resultados do presente trabalho mostraram que cardiomiócitos ventriculares de ratos AD apresentaram maior amplitude do transiente intracelular de Ca2+em comparação aos ratos DP. Esta reposta pode estar diretamente relacionada à maior liberação do conteúdo de Ca2+ pelo RS através dos RyR2, sendo esta estrutura a responsável pelo controle da liberação deste íon nos cardiomiócitos2020. Fabiato A. Time and calcium dependence of activation and inactivation of calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of a skinned canine cardiac Purkinje cell. J Gen Physiol. 1985;85(2):247-89.,2121. Nayler WG, Daile P, Chipperfield D, Gan K. Effect of ryanodine on calcium in cardiac muscle. Am J Physiol. 1970;219(6):1620-6.. Estudos anteriores do nosso grupo demonstraram níveis aumentados de expressão da RyR2 em corações de ratos AD1010. Prímola-Gomes TN, Campos LA, Lauton-Santos S, Balthazar CH, Guatimosim S, Capettini LS, et al. Exercise capacity is related to calcium transients in ventricular cardiomyocytes. J Appl Physiol (1985). 2009;107(2):593-8..

Além disso, cardiomiócitos de ratos AD apresentaram menor amplitude e frequência dassparks de Ca2+. Já foi demonstrado que animais AD exibem expressão aumentada da bomba de Ca2+ ATPase do RS (SERCA2a)1010. Prímola-Gomes TN, Campos LA, Lauton-Santos S, Balthazar CH, Guatimosim S, Capettini LS, et al. Exercise capacity is related to calcium transients in ventricular cardiomyocytes. J Appl Physiol (1985). 2009;107(2):593-8., assim, estes cardiomiócitos podem apresentar maior capacidade para a recaptação do Ca2+ para o RS e, consequentemente, uma sobrecarga de Ca2+ no RS. Essa situação poderia explicar aumentos na frequência e na amplitude das sparks de Ca2+. Entretanto, os dados deste trabalho não apoiam esta hipótese e para tentar explicar o fato, sugerimos então que ratos AD possuem funcionamento aprimorado do complexo RyR2/FKBP12.6. A proteína FKBP12.6 está ancorada à quatro monómeros de RyR2, estabilizando o canal. A deficiência nesta proteína está relacionada ao vazamento de Ca2+ a partir da RyR2, sendo este, um mecanismo fundamental para o surgimento das arritmias cardíacas77. Cheng H, Lederer WJ, Cannell MB. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 1993;262(5134):740-4.,99. Cheng H, Lederer MR, Lederer WJ, Cannell MB. Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes. Am J Physiol. 1996;270(Pt 1):C148-59.,2222. Lehnart SE, Terrenoire C, Reiken S, Wehrens XH, Song LS, Tillman EJ, et al. Stabilization of cardiac ryanodine receptor prevents intracellular calcium leak and arrhythmias. Proc Natl Acad Sci USA. 2006;103(20):7906-10.. Deste modo, é sugestivo propor que animais com alta capacidade intrínseca para o exercício poderiam apresentar maior proteção miocárdica contra eventos arrítmicos.

Tem sido demonstrado que o NO inibe o influxo de Ca2+ através dos canais do tipo L33. Seddon M, Shah AM, Casadei B. Cardiomyocytes as effectors of nitric oxide signalling. Cardiovasc Res. 2007;75(2):315-26.,2323. Gallo MP, Ghigo D, Bosia A, Alloatti G, Costamagna C, Penna C, et al. Modulation of guinea-pig cardiac L-type calcium current by nitric oxide synthase inhibitors. J Physiol. 1998;506( Pt 3):639-51., deste modo, a inibição da síntese do NO causaria aumento do influxo de Ca2+ para o sarcoplasma. Os resultados mostraram aumento na amplitude do transiente de Ca2+ no grupo DP com a inibição das sintases de NO o que poderia causar um efeito inotrópico positivo em cardiomiócitos, como já demonstrado pelo nosso grupo55. Lunz W, Natali AJ, Carneiro MA, Dos Santos Aggum Capettini L, Baldo MP, et al. Short-term in vivo inhibition of nitric oxide synthase with L-NAME influences the contractile function of single left ventricular myocytes in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2011;89(4):305-10.. Neste estudo prévio, a inibição da síntese do NO com L-NAME aumentou a taxa de encurtamento máximo dos cardiomiócitos55. Lunz W, Natali AJ, Carneiro MA, Dos Santos Aggum Capettini L, Baldo MP, et al. Short-term in vivo inhibition of nitric oxide synthase with L-NAME influences the contractile function of single left ventricular myocytes in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2011;89(4):305-10.. Lunz et al.55. Lunz W, Natali AJ, Carneiro MA, Dos Santos Aggum Capettini L, Baldo MP, et al. Short-term in vivo inhibition of nitric oxide synthase with L-NAME influences the contractile function of single left ventricular myocytes in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2011;89(4):305-10. também demonstraram que a redução da biodisponibilidade do NO aumentou a taxa máxima para o relaxamento. No presente trabalho, a administração de L-NAME aumentou a Tau, o que pode ser atribuído à um aumento da expressão e/ou função da SERCA2. Isso sugere que o aumento na velocidade de recaptação de Ca2+para o RS foi o responsável pelo aumento na taxa máxima de relaxamento encontrado por Lunz et al.55. Lunz W, Natali AJ, Carneiro MA, Dos Santos Aggum Capettini L, Baldo MP, et al. Short-term in vivo inhibition of nitric oxide synthase with L-NAME influences the contractile function of single left ventricular myocytes in rats. Can J Physiol Pharmacol. 2011;89(4):305-10.. Em nossos resultados, a inibição das sistases de NO provocou mudanças na amplitude das sparks de Ca2+ apenas no grupo AD. Animais transgênicos com ausência das NOS-1 e NOS-3 apresentam comportamento alterado da RyR2, com redução de S-nitrosilação e aumento da oxidação desse canal, com consequentemente vazamento de Ca2+ diastólico, causando um impacto negativo na estabilidade elétrica e contrátil cardíaca2424. Gonzalez DR, Beigi F, Treuer AV, Hare JM. Deficient ryanodine receptor S-nitrosylation increases sarcoplasmic reticulum calcium leak and arrhythmogenesis in cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(51):20612-7..

CONCLUSÃO

O presente trabalho demonstrou que o NO modula o transiente de Ca2+ e assparks de Ca2+ em cardiomiócitos de ratos com diferentes capacidades intrínsecas para o exercício.

AGRADECIMENTOS

Este estudo recebeu suporte financeiro do Fundo de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Jan-Feb 2016

Histórico

  • Recebido
    12 Dez 2014
  • Aceito
    21 Out 2015
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