Perfil biométrico, histomorfométrico e bioquímico no tratamento com atorvastatina cálcica de ratas com osteoporose induzida com dexametasona^☆

RESUMO

Objetivo:

Avaliar os efeitos da atorvastatina cálcica no tratamento da osteoporose induzida com dexametasona.

Métodos:

A indução da osteoporose consistiu na administração de dexametasona na dose de 7,5 mg/kg de peso corporal, por via intramuscular, uma vez por semana durante quatro semanas, à exceção dos animais do grupo controle (G1). Os animais foram distribuídos nos seguintes grupos: G1 (grupo controle sem osteoporose), G2 (grupo controle com osteoporose sem tratamento), G3 (grupo controle com osteoporose tratado com alendronato de sódio 0,2 mg/kg) e G4 (grupo com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica 1,2 mg/kg). Após 30 e 60 dias do início do tratamento dos animais, foram feitas as dosagens dos níveis séricos de fosfatase alcalina, fosfatase alcalina óssea, avaliação biométrica e histomorfométrica óssea.

Resultados:

Em relação às análises biométricas e histomorfométricas, aos 60 dias de tratamento o G4 apresentou densidade óssea (índice Seedor), densidade trabecular óssea e espessura da cortical de 0,222 ± 0,004 g/cm, 59,167 ± 2,401% e 387,501 ± 8,573 µm, respectivamente, com diferença positiva, estatisticamente significativa (p < 0,05), em relação ao grupo G2. Aos 30 e 60 dias de tratamento, o G4 apresentou níveis séricos de fosfatase alcalina óssea estatisticamente significativos (p < 0,05) e superiores a todos os grupos (7,451 ± 0,173 µg/L e 7,473 ± 0,529 µg/L, respectivamente).

Conclusão:

O tratamento com atorvastatina cálcica demonstrou a capacidade desse fármaco de aumentar a atividade osteoblástica e a atividade reparadora tecidual óssea, atuar de forma diferente do alendronato de sódio, que demonstrou atividade preponderantemente antirreabsortiva.

Palavras-chave:
Glicocorticóide; Difosfonatos; Alendronato; Fosfatase alcalina; Histomorfometria óssea

ABSTRACT

Objective:

To assess the effects of atorvastatin calcium in the treatment of dexamethasone-induced osteoporosis.

Methods:

Osteoporosis induction consisted of the administration of an intramuscular dose of 7.5 mg/kg of body weight of dexamethasone, once a week for four weeks, except for the control animals (G1). The animals were divided into the following groups: G1 (control group without osteoporosis), G2 (control group with untreated osteoporosis), G3 (control group with osteoporosis treated with sodium alendronate 0.2 mg/kg) and G4 (group with osteoporosis treated with atorvastatin calcium 1.2 mg/kg). Serum alkaline phosphatase, bone alkaline phosphatase, and biometric and bone histomorphometric assessments were performed after 30 and 60 days of treatment onset.

Results:

In relation to the biometric and histomorphometric analyses, at 60 days of treatment, G4 presented bone density (Seedor index), bone trabecular density, and cortical thickness of 0.222 ± 0.004 g/cm, 59.167 ± 2.401%, and 387,501 ± 8573 µm, respectively, with a positive and statistically significant difference (p < 0.05), in relation to G2. At 30 and 60 days of treatment, G4 presented statistically significant serum levels of alkaline phosphatase alkaline phosphatase (p < 0.05) that were higher than all groups (7.451 ± 0.173 µg/L and 7.473 ± 0.529 µg/L, respectively).

Conclusion:

Treatment with atorvastatin calcium demonstrated the ability of this drug to increase osteoblastic activity and bone tissue repair activity, acting differently from alendronate sodium, which demonstrated predominantly antirebsorptive activity.

Keywords:
Glucocorticoid; Diphosphonates; Alendronate; Alkaline phosphatase; Bone histomorphometry

Introdução

A osteoporose induzida por glicocorticoides é uma complicação grave e comum nos tratamentos prolongados com esses fármacos. Normalmente é verificada nesses casos diminuição da formação óssea, assim como incremento na sua reabsorção.¹

Esse quadro caracteriza uma doença progressiva que envolve deterioração estrutural do tecido ósseo e leva a fragilidade e aumento da suscetibilidade a fraturas causadas pela redução da massa óssea e pelo aumento do turnover ósseo.²

O objetivo do tratamento da osteoporose induzida com glicorticoides é evitar a ocorrência de futuras fraturas, o que acarreta diminuição da qualidade de vida. Atualmente usam-se, nas terapias farmacológicas contra a osteoporose, os bisfosfonatos, dentre eles o alendronato de sódio, que atuam preponderantemente ao inibir a reabsorção do tecido ósseo.^2,3

Segundo Drake et al.,⁴ o alendronato de sódio é aprovado para uso clínico na prevenção e no tratamento da osteoporose induzida por glicorticoides, demonstra maior eficácia quando os níveis de vitamina D e cálcio são adequados.

Tem sido descrito que o alendronato de sódio reduz a perda óssea em pacientes tratados com moderada e altas doses de prednisona para doenças heterogêneas.^3,5

No entanto, o alendronato de sódio, apesar de reduzir a incidência de fraturas, não apresenta ganho em formação óssea. Além disso, o seu uso prolongado demonstra vários efeitos colaterais, como fraturas subtrocantéricas do fêmur, osteonecrose de mandíbula, irritação esofágica, dentre outros, causa impacto negativo à adesão ao tratamento pelo paciente.^4,6

Lin et al.,⁷ em modelo de estudos de dislipidemias com ratas ovariectomizadas, verificaram que a atorvastatina, clinicamente usada no tratamento de dislipidemias, não somente diminuiu os níveis séricos de lipídios, mas também promoveu melhoria biomecânica óssea, assim como aumento de colágeno no tecido ósseo.

Alguns estudos recentes relataram a ação das estatinas na formação óssea pela estimulação da expressão da proteína morfogenética óssea (BMP)-2, a qual conduz a diferenciação osteoblástica e consequente formação óssea. Ocorre aumento da transcrição do gene da BMP-2, esse é o provável responsável pelos seus efeitos.⁸

Visto isso, passou-se a acreditar que as estatinas, se seletivamente direcionadas ao osso, poderiam apresentar efeitos benéficos no tratamento da osteoporose e de fraturas. Tais observações suscitaram grande interesse na comunidade científica e vários estudos foram feitos, demonstraram a ação das estatinas na melhoria da densidade óssea e na redução do número de fraturas.⁹

O presente trabalho tem como objetivo verificar, através da avaliação biométrica e histomorfométrica óssea, além dos marcadores bioquímicos, os efeitos da atorvastatina cálcica em ratas com osteoporose induzida com dexametasona.

Material e métodos

Procedimento experimental

No desenvolvimento deste trabalho, foram usadas 48 ratas (Rattus norvegicus) da raça Wistar, adultas, com em média 200 g, procedentes do biotério do central da nossa universidade, alimentados com ração comercial e água ad libitum durante todo o experimento.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (protocolo 36/2016).

Durante todo o período experimental, os animais permaneceram em gaiolas de polietileno opaco fechadas com tampa de aço inoxidável em forma de grade, cada uma com um animal. Os animais foram mantidos em ambiente climatizado com período de luz de 12 horas e as gaiolas foram higienizadas a cada dois dias.

Após uma semana de adaptação teve início o processo de indução da osteoporose com a administração do glicocorticoide dexametasona, por via intramuscular, na dose semanal de 7,5 mg/kg de peso corporal, durante quatro semanas, nos animais de todos os grupos, à exceção de 12 animais do grupo 1 (G1 - controle sem osteoporose).

Os animais submetidos à indução da osteoporose foram então distribuídos aleatoriamente em três grupos experimentais de 12 animais cada, receberam os seguintes tratamentos e denominações: G2 (controle com osteoporose sem tratamento), G3 (com osteoporose tratado com alendronato de sódio 0,2 mg/kg)¹⁰ e G4 (com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica 1,2 mg/kg).¹⁰ As medicações foram administradas diariamente por via oral (método de gavagem), foram usadas cânulas apropriadas.

Avaliação dos marcadores bioquímicos

Aos 30 dias e 60 dias após o início dos tratamentos seis animais de cada grupo foram anestesiados e através de laparotomia abdominal e posterior punção da veia cava caudal foram coletados 5 ml de amostra de sangue para a dosagem dos níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) e fosfatase alcalina isoenzima óssea (FAO).

Para o procedimento de laparotomia cada animal recebeu como medicação anestésica dissociativa a solução, via intramuscular, de 0,05 ml de cloridrato de ketamina (1 g/ml) com 0,05 ml de cloridrato de xilazina (23 mg/ml).

A dosagem sorológica de fosfatase alcalina (FAL) foi feita por espectrofotometria, com o Aparelho Multiparamétrico de Bioquímica (Alizé), bem como kit específico de uso em automação da marca Bioclin®.

Para a dosagem sorológica da fosfatase alcalina isoenzima óssea (FAO) foi usado o equipamento de quimioluminescência Access Immunoassay System II da Beckman Coulter®, assim como kit específico para dosagem, também da mesma indústria.

Exame histomorfométrico

Após a coleta de sangue, aos 30 dias e 60 dias após o início dos tratamentos, seis animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia com sobredosagem anestésica (tiopental sódico 30 mg/kg).

Através de dissecção, os fêmures esquerdos foram coletados e colocados em formol 10% neutrotamponado, durante 72 horas para fixação, e, posteriormente, foram descalcificados e processados rotineiramente para estudo histológico e corados com coloração tricrômico de Masson.

Para cálculo da densidade ocupada por osso trabecular e espessura cortical óssea, foi obtida uma imagem amostral de osso contida na região subcondral, de cada corte histológico, em microscópio óptico Olympus BX 41® (Tóquio, Japão) equipado com câmara digital (TCL-984 P®) acoplada. As imagens foram obtidas com objetiva de 10X. Essas imagens foram analisadas no software de análise de imagem de domínio público Image J (desenvolvido por Wayne Rasband do Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland).¹¹

Nas imagens obtidas foram feitas as medidas em µm da espessura da cortical óssea. A área composta por osso trabecular foi calculada através da proporção entre área ocupada por matriz orgânica óssea e área total da imagem.

Análise biométrica

Foram feitas medidas do comprimento de cada fêmur com paquímetro digital 150 mm e resolução 0,01 mm/0,0005 Metrotools®. Além disso, foi feita a pesagem de cada fêmur dissecado em balança analítica digital da marca A.Cientifica/Edutec® EEQ9003F-B com capacidade de 220 g e precisão de leitura de 0,1 mg. Foi calculado o índice Seedor pela divisão do peso de cada fêmur pelo seu respectivo comprimento e o resultado expresso em g/cm.¹²

Análise estatística

O ensaio biológico foi feito segundo delineamento inteiramente casualizado com quatro tratamentos e seis repetições. A princípio foi verificada a normalidade com o teste de Shapiro-Wilk (p < 0,05). Os grupos foram comparados entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os resultados, então, expressos em média e ± desvio-padrão.

Resultados

Os resultados das avaliações biométricas [medidas relação do peso ao tamanho do fêmur (índice Seedor) (fig. 1)] e histomorfométricas [densidade trabecular óssea (fig. 2) e espessura da cortical óssea (fig. 3)] demonstraram que durante todo o período experimental ocorreu uma progressiva perda de estrutura óssea que caracterizou o processo de indução da osteoporose nos grupos que receberam a dose de 7,5 m/kg de dexametasona e não receberam tratamento (G2).

Figura 1
Avaliação biométrica. Relação peso e tamanho (índice Seedor) dos fêmures após 30 e 60 dias de tratamento. Resultados são expressos como média ± desvio-padrão. Em cada período, médias seguidas de letra minúscula diferente diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). G1 grupo controle sem indução da osteoporose, G2 grupo controle com osteoporose sem tratamento, G3 grupo controle com osteoporose tratado com alendronato de sódio e G4 grupo com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica.

Figura 2
Avaliação histomorfométrica. Densidade trabecular óssea dos fêmures após 30 e 60 dias de tratamento. Resultados são expressos como média ± desvio-padrão. Em cada período, médias seguidas de letra minúscula diferente diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). G1 grupo controle sem indução da osteoporose, G2 grupo controle com osteoporose sem tratamento, G3 grupo controle com osteoporose tratado com alendronato de sódio e G4 grupo com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica.

Figura 3
Avaliação histomorfométrica. Espessura da cortical óssea dos fêmures após 30 e 60 dias de tratamento. Resultados são expressos como média ± desvio-padrão. Em cada período, médias seguidas de letra minúscula diferente diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). G1 grupo controle sem indução da osteoporose, G2 grupo controle com osteoporose sem tratamento, G3 grupo controle com osteoporose tratado com alendronato de sódio e G4 grupo com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica.

Os animais dos grupos tratados com o alendronato de sódio (G3) apresentaram índice Seedor (fig. 1), densidade trabecular óssea (fig. 2) e espessura da cortical óssea (fig. 3), tanto em 30 como 60 dias de tratamento, com diferenças significativas em relação ao grupo com osteoporose sem tratamento (G2), e com valores estatisticamente equiparáveis ao grupo normal (G1), demonstraram assim capacidade de prevenir a indução da osteoporose com a atuação da dexametasona na fase rápida, na qual há predominância de aumento de atividade osteoblástica.

Somente aos 60 dias de tratamento o grupo tratado com atorvastatina cálcica (G4) apresentou índice Seedor (fig. 1), densidade trabecular óssea (fig. 2) e espessura da cortical óssea (fig. 3) com diferenças significativas em relação ao grupo com osteoporose sem tratamento (G2), além de valores mais próximos a grupo normal (G1), demonstraram melhor capacidade desse fármaco de atuação na fase tardia da indução da osteoporose com dexametasona.

Aos 30 dias de tratamento pôde-se verificar um aumento de níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) em todos os grupos submetidos ao processo de indução da osteoporose (G2, G3 e G4) em relação ao grupo sem osteoporose (G1) (fig. 4).

Figura 4
Níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) após 30 e 60 dias de tratamento. Resultados são expressos como média ± desvio-padrão. Em cada período, médias seguidas de letra minúscula diferente diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). G1 grupo controle sem indução da osteoporose, G2 grupo controle com osteoporose sem tratamento, G3 grupo controle com osteoporose tratado com alendronato de sódio e G4 grupo com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica.

Aos 60 dias de tratamento verificou-se uma queda significativa dos níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) em todos os grupos osteoporóticos, apesar de os grupos tratados com alendronato de sódio (G3) e atorvastatina cálcica (G4) permanecerem com valores acima do parâmetro de normalidade (G1) (fig. 4).

Verifica-se também aos 30 e 60 dias de tratamento a não correspondência dos níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) e fosfatase alcalina óssea (FAO) (figs. 4 e 5).

Figura 5
Níveis séricos de fosfatase alcalina óssea (FAO) após 30 e 60 dias de tratamento. Resultados são expressos como média ± desvio-padrão. Em cada período, médias seguidas de letra minúscula diferente diferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). G1 grupo controle sem indução da osteoporose, G2 grupo controle com osteoporose sem tratamento, G3 grupo controle com osteoporose tratado com alendronato de sódio e G4 grupo com osteoporose tratado com atorvastatina cálcica.

Na avaliação do grupo com osteoporose sem tratamento (G2) foi possível verificar aos 30 e 60 dias de tratamento a redução progressiva dos níveis séricos da fosfatase alcalina óssea (FAO) (fig. 5).

Durante todo o período experimental o grupo que recebeu tratamento com alendronato de sódio (G3) apresentou níveis séricos de fosfatase alcalina óssea (FAO) abaixo do parâmetro de normalidade (G1), demonstrou, assim, o baixo potencial de atividade indutora da atividade de osteoblastos desse fármaco (fig. 5).

Tanto em 30 como em 60 dias de tratamento o grupo tratado com atorvastatina cálcica apresentou valores significativamente superiores de fosfatase alcalina óssea (FAO), esses valores foram superiores até ao grupo normal (G1) (fig. 5).

Discussão

Segundo Ferreira Junior et al.,¹⁰ a avaliação óssea histomorfométrica se caracteriza por ser um método de extrema valia para avaliação dinâmica do processo de remodelação óssea, precisa a extensão da perda óssea, das taxas de calcificação e de formação do tecido ósseo, é capaz de identificar alterações osteometabólicas como a osteoporose.

A osteoporose induzida pela dexametasona ocorre em duas fases: uma rápida, fase em que a densidade mineral óssea (DMO) é reduzida, presumivelmente devido à reabsorção óssea excessiva (osteoclastos), e uma tardia, fase progressiva, em que a DMO diminui devido à prejudicada formação óssea (osteoblastos e osteócitos).¹³

Na fase tardia os glicocorticoides diminuem o número e a função de osteoblastos. Esses efeitos conduzem a uma supressão da formação de osso, uma característica central na patogênese da osteoporose induzida por glicocorticoide. Os glicocorticoides diminuem a reprodução das células da linhagem dos osteoblastos, reduzem o conjunto de células que pode diferenciar-se em osteoblastos maduros. Além disso, os glicocorticoides prejudicam a diferenciação dos osteoblastos, assim como sua maturação.^13,14

Segundo Amaral et al.,² a aferição dos níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) inclui os teores da isoforma da fosfatase alcalina específica do tecido ósseo denominada fosfatase alcalina óssea (FAO), que é secretada pelos osteoblastos e pode apresentar aumento nos casos de remodelação óssea, deve, portanto, acompanhar esse perfil.

Entretanto, segundo Allen,¹⁵ a interpretação da fosfatase alcalina total (FAL) é complicada por poder ser afetada pelas variantes óssea, intestinal, renal e hepática, dificulta seu uso com o marcador da remodelação óssea.

De acordo com Amaral et al.,² a redução progressiva dos níveis séricos da fosfatase alcalina óssea (FAO) se deve à ação direta dos glicocorticoides, causa redução na quantidade e atividade de osteoblastos em além de resultar no impacto na redução de reposição de matriz óssea perdida, acarreta a supressão da produção de osteoprotegerina (OPG), que, em níveis normais, limita a liberação de enzimas pró-osteoclastogênicas.

Os resultados positivos de preservação da estrutura óssea apresentados pelo grupo tratado com alendronato de sódio (G3), apesar de baixa atividade osteoblástica, vista pelos níveis séricos de FAO, demonstra preponderância de atividade inibidora de reabsorção que se contrapõe à fase rápida (aumento de reabsorção óssea) de ação da dexametasona.^7,13,14

O principal mecanismo de ação dos bisfosfonatos se deve a uma afinidade muito elevada pelo componente mineral do tecido ósseo que se liga de maneira estável aos cristais de hidroxiapatita, inibe sua quebra e, assim, suprime eficazmente a reabsorção óssea.¹⁶

Além disso, os bisfosfonatos nitrogenados (alendronato, risedronato, ibandronato, pamidronato e ácido zoledrônico), além de apresentar a capacidade antirreabsortiva através da ligação com a hidroxiapatita, atuam predominantemente ao inibir a ativação da farnesil difosfato sintase na via do mevalonato, ocasionam apoptose de osteoclastos, com consequente diminuição da reabsorção óssea.⁷

Segundo Issa et al.,¹⁷ as estatinas têm demonstrado capacidade de diminuição da reabsorção óssea, aumento da densidade mineral óssea (DMO) e aumento da formação óssea.

A capacidade de atuação das estatinas na reabsorção óssea pode ser explicada pelo mecanismo de ação semelhante aos bisfosfonatos nitrogenados, atuam na via do mevalonato e inibindo a ação da 3-hidróxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-CoA) redutase, o que resulta na redução da atividade osteoclástica e modula, assim, a reabsorção óssea.⁷

O aumento dos níveis séricos de FAO, ocasionado pela atorvastatina cálcica, corresponde à capacidade das estatinas de estimulação da atividade osteoblástica, demonstra seu maior potencial de atuação na fase tardia da indução da osteoporose pela dexametasona.¹⁷

Segundo Alam,⁸ as estatinas estimulam o aumento da transcrição do gene da proteína morfogenética óssea BMP-2, com consequente aumento da expressão da BMP-2, o qual conduz à diferenciação osteoblástica e ao consequente aumento da formação óssea.

Estudos de Lee et al.¹⁸ com a lovastatina também verificaram aumento da atividade de fosfatase alcalina óssea, mineralização de matriz óssea e osteogênese de células ósseas in vitro.

Além disso, as estatinas atuam no tecido ósseo ao aumentar a expressão do fator de crescimento endotelial (VEGF), várias variantes de VEGF, bem como os seus receptores, estão expressas em osteoblastos, nos quais a presença dessa citocina tem demonstrado induzir aumento dos níveis de atividade da fosfatase alcalina óssea, assim como melhorar a resposta ao paratormônio (PTH).^19,20

Estudos de Kaji et al.²¹ reportaram que a Smad3, uma molécula fundamental na transdução da sinalização do TGF-β para o núcleo, promove aumento na produção do colágeno tipo I (Col1), aumento da atividade da fosfatase alcalina óssea (FAO) e capacidade de mineralização de células osteoblásticas de ratos. Além disso, foi verificado que tanto o paratormônio (PTH) como os glicorticoides modulam a via Smad3 nas células osteoblásticas independentemente do TGF- β.^19,21

As estatinas foram capazes de aumentar, em cultura de células osteoblásticas, o nível da Smad3 independentemente da indução do receptor TGF- β. Além disso, foi suprimida a apoptose de osteoblastos através da via TGF- β -Smad3.^19,21

Conclusão

Através das análises biométricas e histomorfométricas, foi possível constatar o processo de indução da osteoporose pela dexametasona, bem como avaliar a evolução positiva tanto do grupo tratado com alendronato de sódio como do grupo tratado com atorvastatina cálcica.

O tratamento com atorvastatina cálcica promoveu alterações positivas significativas nos níveis séricos da fosfatase alcalina óssea (FAO) e demonstrou a capacidade desse fármaco de aumentar a atividade osteoblástica e a atividade reparadora tecidual óssea e de atuar de forma diferente do alendronato de sódio, que demonstrou atuar preponderantemente como agente antirreabsortivo.

Os níveis séricos de fosfatase alcalina (FAL) que não apresentaram correspondência com a fosfatase alcalina óssea FAO podem ser afetados pelas variantes intestinal, renal e hepática e dificultar seu uso como parâmetro de aferição de atividade tecidual óssea.

• ☆
  Trabalho desenvolvido no Laboratório de Biofármacos, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, MG, Brasil.

Agradecimentos

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Aplicada da UFV pelo apoio à pesquisa.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Sep-Oct 2018

Histórico

• Recebido
  6 Jun 2017
• Aceito
  27 Jun 2017
• Publicado
  27 Jul 2018