Atividade biológica do extrato hidroalcoólico de Bauhinia forficata Link sobre Herpetomonas samuelpessoai (Galvão.) Roitman

Biologic activity of the hydroalcoholic extract of Bauhinia forficata Link on Herpetomonas samuelpessoai (Galvão.) Roitman

Atividade biológica do extrato hidroalcoólico de Bauhinia forficata Link sobre Herpetomonas samuelpessoai (Galvão.) Roitman

Biologic activity of the hydroalcoholic extract of Bauhinia forficata Link on Herpetomonas samuelpessoai (Galvão.) Roitman

Pereira, A.C.S.^I; Ribeiro, G.E.^II; Souza, L.C.R.^I; Rufino, L.R.A. ^I; Cabral, I.S.R.^II; Boriollo, M.F.G.^I; Nogueira,D.A.^I; Oliveira, N.M.S.^I; Fiorini, J.E.I, ^*

^IUnivesidade José do Rosário Vellano - UNIFENAS, Laboratório de Biologia e Fisiologia de Microrganismos Rodovia MG 179, Km 0, CEP: 37130-000, Alfenas, MG, Brasil

^IIUniverversidade Federal de Alfenas, UNIFAL-MG, Laboratório de Microbiologia e Imunologia Básica, Rua Gabriel Monteiro da Silva, 700, Centro, CEP: 37130-000, Alfenas, MG, Brasil

RESUMO

Inúmeros esforços têm sido dirigidos para conferir às plantas seu real papel e valor na terapia. Este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana, mutagênica, toxicidade, e os efeitos no crescimento e diferenciação de Herpetomonas samuelpessoai, do extrato hidroalcoólico de Bauhinia forficata. Para avaliar a atividade antimicrobiana foi realizado o teste de difusão em ágar, bem como a determinação das concentrações inibitória (CIM) e microbicida mínimas (CMM). O potencial clastogênico e/ou aneugênico, in vivo, foi avaliado usando o teste do micronúcleo em medula óssea de camundongos Swiss albinus. Foi determinada também a dose letal média (DL₅₀). O extrato inibiu o crescimento de oito bactérias, mostrando-se mais ativo para Gram-positivas e não foi eficiente para os fungos, tendo sido ativo nas concentrações de 2000, 1000, 500 e 250 mg/mL contra os microrganismos testados. Os resultados mostraram que nas concentrações administradas (500, 1000 e 2000 mg/Kg), não houve aumento estatisticamente significativo de micronúcleos. Não houve ação no crescimento e diferenciação de Herpetomonas samuelpessoai nas concentrações testadas. Com relação a DL₅₀, o extrato não apresentou toxicidade.

Palavras-chave: Bauhinia forficata, Herpetomonas samuelpessoai, pata de vaca, antimicrobianos, mutagenicidade.

ABSTRACT

Numerous efforts have been directed to discover the role and the value of plants in therapy. This work aimed to evaluate the antimicrobial activity, mutagenicity, toxicity and effects on growth and differentiation of Herpetomonas samuelpessoai of the hydroalcoholic extract of Bauhinia forficata. To evaluate the antimicrobial activity it was performed the agar diffusion test, minimum inhibitory (MIC) and microbicidal (MMC) concentrations. The in vivo clastogenic and / or aneugênic potential was evaluated using the micronucleus test in mice bone marrow Swiss albinus. It was also determined the median lethal dose (LD₅₀). The extract inhibited the growth of eight bacteria, being more active against Gram-positiveones, and was not active against fungi. The microorganisms tested had MIC concentrations of 2000, 1000, 500 and 250 mg / mL. The results showed that the tested concentrations (500, 1000 and 2000 mg / kg) had no statistically significant increasedthe micronucleus. There was no action on the growth and differentiation of Herpetomonas samuelpessoai at the concentrations tested. In respect to the LD₅₀, the extract showed no toxicity.

Key words:Bauhinia forficata, Herpetomonas samuelpessoai, cow's-paw, antimicrobial, mutagenicity.

INTRODUÇÃO

Algumas espécies do gênero Bauhinia são conhecidas popularmente como "pata-de-vaca", "unha-de-vaca", entre outros nomes e são utilizadas para fins medicinais. Este gênero pertence à família Leguminosae e abrange cerca de 300 espécies presentes em áreas tropicais do mundo (Lusa e Bona, 2009).

Bauhina forficata é utilizada na medicina popular brasileira e se destaca pela sua relevância terapêutica no tratamento do diabetes mellitus (Trojan-Rodrigues et al., 2012). Possui atividades biológicas como hipoglicemiante (Curcio et al., 2012), antioxidante (Khalil et al., 2008; Peroza et al., 2013) e anticoagulante (Oliveira et al., 2005). Esta espécie desperta o interesse para produção de fitoterápicos e se encontra na Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao Sistema Único de Saúde (RENISUS) (Ministério da Saúde, 2009).

Estudos recentes mostram que substâncias presentes em preparações medicinais podem causar efeitos tóxicos, como danos no DNA, devido à sua citotoxicidade, mutagenicidade e propriedades carcinogênicas. A avaliação dos danos causados são de extrema importância para minimizar os riscos destes agentes, principalmente em tratamentos a longo prazo (Sisenando et al., 2009).

O desenvolvimento de novos fármacos requer uma completa investigação da eficácia e segurança da substância-teste. O potencial de risco e benefício deve ser cuidadosamente considerado, de modo que os benefícios de seu uso superem os efeitos colaterais (Varanda, 2006).

Os estudos fitoquímicos e farmacológicos realizados com B. forficata sugerem a presença de proantocianidinas, leucoantocianidinas, triterpenos, esteróides, flavonóides, além de açúcares redutores (Marques et al., 2012; Cechinel Filho, 2003). A literatura aponta os flavonóides como responsáveis pela atividade biológica, sendo a kaempferitrina o marcador químico e farmacológico de excelência (De Sousa et al., 2004; Lino et al., 2004).

Apesar da larga utilização da B. forficata na medicina popular, há poucos estudos sobre a atividade antimicrobiana e seus efeitos genotóxicos, tornado-se necessários estudos científicos que comprovem a eficácia ou ações indesejáveis de suas propriedades.

Este trabalho teve como objetivo verificar a atividade antimicrobiana e mutagênica do extrato hidroetanólico da folha de B.forficata. Segundo Mateuca et al. (2006) a frequência de micronúcleos é forte preditivo para o desenvolvimento de câncer. O teste do micronúcleo em medula óssea de roedores in vivo, além de atender às exigências dos órgãos nacionais que regulam os registros farmacológicos e químicos, também segue as recomendações do Gene-Tox Program da Environmental Protection Agency. Ensaios com sistemas eucarióticos envolvendo seu metabolismo podem indicar a capacidade mutagênica de produtos naturais e sintéticos.

MATERIAL E MÉTODOS

Preparo do material vegetal e extrato bruto

As folhas de Bauhinia forficata foram coletadas, em um único exemplar da planta, em sua parte média, na Universidade José do Rosário Vellano (UNIFENAS) campus de Alfenas, MG no mês de fevereiro/2010. A cidade fica localizada no sul de Minas Gerais cuja região apresenta clima temperado com temperaturas variando entre 21-25ºC na época da coleta das folhas. Em seguida, lavadas em água corrente e secas em estufas a 35ºC durante uma semana para eliminação da umidade e estabilização do conteúdo enzimático. Depois, foram trituradas em moinho elétrico para obtenção do pó. A exsicata foi depositada no Herbário da Unifenas, sob o n^o BF-468.

Para preparação do extrato hidroalcoólico foram pesados 200 g das folhas trituradas, previamente lavadas e secas, e suspensas em 800 mL de etanol 70% (v/v), e submetidas à maceração por sete dias. Após, foi realizada a filtração em papel filtro e o extrato obtido foi concentrado em rotoevaporador em temperatura inferior a 40 ºC. Em seguida, foi realizada liofilização do extrato.

Avaliação da atividade antimicrobiana

Microrganismos e preparo do inóculo

Foram utilizados os microrganismos relacionados na Tabela 1, oriundos do Laboratório de Biologia e Fisiologia de Microrganismos, da Universidade José do Rosário Vellano/ UNIFENAS, rotulados na American Type Culture Collection (ATCC).

As cepas foram repicadas em ágar Mueller Hinton( pH7,2), incubadas a 37ºC, por 24 h. Para o preparo do inóculo, as culturas de cada microrganismo foram transferidas para tubos de ensaio contendo 9 mL de salina esterilizada de forma a obter-se turbidez correspondente ao tubo 0,5 da Escala de Mc Farland.

Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Microbicida Mínima (CMM)

A concentração inibitória mínima (CIM) (NCCLS, 2003) foi determinada nos extratos que apresentaram atividade inibitória no teste de difusão em ágar. Os testes foram realizados em microplacas de 96 poços. No primeiro poço foi adicionado o extrato com concentração de 2000 mg/mL, e a partir deste foram preparadas diluições seriadas decrescentes de 2000 mg/mL a 3,9 mg/mL. Foram inoculados nos poços 10 µL da suspensão microbiana com turvação equivalente ao tubo 0,5 da Escala de Mac Farland. Foi realizado o controle de esterilidade do meio de cultura e de esterilidade dos extratos. As placas foram incubadas a 37 ºC, por 24 horas e após este período foi observado presença ou ausência de turvação. Foi considerado CIM a menor concentração que não apresentou turvação.

A CMM foi realizada nas concentrações do extrato que apresentaram inibição para o crescimento bacteriano. Os testes foram realizados em placas de Petri contendo Ágar Mueller Hinton ( pH7,2) e incubadas a 37ºC por 24 horas.

Teste de difusão em ágar

Foi utilizado o método de difusão em ágar atualmente recomendado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)(NCCLS, 2003), que se baseia originalmente no método descrito por Bauer et al. (1966). Foram preparadas placas de Ágar Mueller-Hinton (pH 7,2) para bactérias e Ágar Mueller-Hinton com glicose ( pH 6,0) para leveduras.Posteriormente foram feitos poços de 4 mm de diâmetro na superfície do ágar, com auxílio de um tubo de metal. Foram preparadas suspensões microbianas em soro fisiológico com turvação correspondente ao tubo 0,5 da Escala de Mc Farland. Esta suspensão foi inoculada (0,1 mL) na superfície do ágar, com auxílio de swab. Foram colocados nos poços os extratos de folhas de Bauhinia forficata concentrados 10 X objetivando diminuir o volume a ser depositado nos poços e de modo a obter as concentrações finais utilizadas nos experimentos. Um controle positivo com solução de clorexidina a 0,12% (v/v) foi também utilizado. Este procedimento foi realizado segundo a metodologia descrita por Barkvoll (1998) e Barros & Fiorini ( 2000) onde os Autores não utilizaram antibióticos comerciais no procedimento. Também foi utilizado um controle negativo com água destilada. As placas foram incubadas a 37ºC, por 24 horas. Após a incubação foi feita a leitura dos halos de inibição do crescimento microbiano.

Crescimento e diferenciação celular de Herpetomonas samuelpessoai

A diferenciação celular foi realizada em meio de cultivo quimicamente definido (pH6,5) (Roitman et aI., 1972). Cerca de 10⁶ células foram incubadas juntamente com doses crescentes do extrato hidroalcóolico do vegetal, a 28°C por 72 horas.

As células foram coletadas por centrifugação e lavadas 2X em PBS, pH 7,2. Após a lavagem, as células foram ressuspensas no mesmo tampão e realizado um esfregaço fino lâmina de vidro. A lâmina foi deixada secar a temperatura ambiente e, posteriormente, as células foram coradas pelos métodos Panótico e Giemsa e foram observadas em microscopia óptica objetivando estimar os percentuais de formas pro, para e opistomastigota.

O crescimento de H. Samuelpessoai foi estimado por contagem das células em câmara de Neubauer com sistemas controle e submetidos ao tratamento com o extrato após incubação em estufas BOD 28ºC, por um período de 72 horas. Os tripanosomatídeos foram fixados em formalina a 10%. Foram considerados os resultados médios obtidos de pelo menos dois experimentos realizados em duplicata.

Dose letal média (DL₅₀)

Para determinação da dose letal média (DL₅₀) foram utilizados grupos de camundongos Swiss albinus (n=3 animais/grupo/sexo), pesando entre 30 e 40 gramas, provenientes do Biotério Central da UNIFENAS, que receberam, por via oral (V.O.), dose única de diferentes concentrações (3, 50, 300 e 2000 mg/Kg) do extrato hidroalcoólico de Bauhinia forficata, seguindo as normas da Organization for EconomicCo-operation and Development (OECD, 1998) para testar toxicidade oral aguda de produtos químicos. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade José do Rosário Vellano- UNIFENAS, Campus de Alfenas-MG, sob n^o 02A/2010.

Teste do Micronúcleo

Para a realização do teste do micronúcleo (Schmid, 1976), foram utilizados camundongos Swiss albinus, adultos jovens, provenientes do Biotério Central da UNIFENAS. Os animais foram divididos em seis grupos (n=6 por grupo, sendo 3 machos e 3 fêmeas).

O extrato de B. forficata foi testado separadamente empregando-se 3 doses (1000; 1500 e 2000 mg/Kg de peso corporal), selecionadas de acordo com a DL₅₀, e administrados via gavagem (100µL/10 g de animal).O grupo controle negativo recebeu NaCl (150 mM) por gavagem e o controle positivo foi tratado com N-Nitroso-N-ethylurea (ENU) (50 mg/Kg - Sigma N8509) de modo intraperitoneal.

Após 24 e 48 horas do término do tratamento, os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical. Os fêmures foram removidos, a epífise proximal foi retirada para expor o canal medular e, com o auxílio de uma agulha 13 x 4.5 mm e 3 mL de solução de NaCl (150 mM), a medula foi retirada, lavando-se o canal medular com solução de NaCl. O material foi transferido para tubos de vidro e centrifugados a 1000 rpm/5 min.

Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante, e o sedimento foi ressuspenso com solução de formaldeído 4% e levemente homogeneizado com o auxílio de uma pipeta Pasteur. Uma gota desta suspensão celular foi colocada em uma lâmina limpa e seca, e depois, realizou-se o esfregaço.

As lâminas foram secas à temperatura ambiente e, após 24 horas, coradas com Leishman eosina-azul de metileno e submetidas à análise microscópica. Em cada lâmina 2000 eritrócitos policromáticos foram analisados.

Análise estatística

Para os ensaios de ação antimicrobiana foi utilizada estatística descritiva. Os dados obtidos no teste do micronúcleo foram submetidos à análise estatística de variância one-way (ANOVA), em delineamento inteiramente casualizado e esquema fatorial 5⋅2⋅2 (tratamento⋅sexo⋅tempo), e ao teste de Tukey empregando o software SAS^® (versão 8.01).O teste de Scott-Knott foi empregado para os resultados de crescimento e diferenciação celular. Diferenças estatísticas foram fixadas como sendo significativas para ρ<0,05.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A avaliação do potencial antibacteriano do extrato hidroalcoólicode B. forficata, demonstrou atividade sobre o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, porém não foi eficaz para as cepas fúngicas. Todos os microrganismos que apresentaram CIM nas concentrações de 250, 1000, e 2000 mg/mL, obtiveram halos de inibição no teste de difusão em ágar,exceto P. mirabilis. Somente Bacillus cereus e Micrococcus luteus apresentaram CMM de 1000 e 2000 mg/mL, respectivamente. Isto poderia ser explicado pelo tipo de processo metabólico dos mesmos o que os levaria a apresentarem maior sensibilidade à ação do extrato nas concentrações propostas. Ademais, observa-se que houve diferença expressiva entre as duas bactérias, relacionada à CMM, provavelmente pelo fato de B. cereus ser um organismo formador de endósporo e aeróbio estrito e o Micrococcus ser fermentador facultativo e não formador de esporo. (Tabela 2).

Os resultados obtidos confirmaram estudo realizado por Silva e Filho (2002),no qual os extratos de B. forficata foram testados contra fungos filamentosos e leveduras patogênicas, por meio do teste de diluição em caldo, não havendo atividade antifúngica.

Kumar et al. (2005) verificaram a atividade antimicrobiana do extrato de Bauhinia racemosa, sendo este efetivo para Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Vibriocholerae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Micrococcusluteus, Staphylococcus epidermidise Candidaalbicans, em concentrações que variaram de 25 a 200 µg/mL.

Ahmed et al (2012) avaliaram atividade antimicrobiana das espécies Bauhinia bowkeri, Bauhinia galpinii, Bauhinia petersianae Bauhinia variegata. Todas apresentaram boa atividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans e Cryptococcus neoformans, nas concentrações de 30 a 2500 µg/mL.

Sousa et al. (2000) avaliaram a atividade antimicrobiana dos extratos das frações da B. forficata e B. microstachya por meio do método de difusão em ágar, observando que somente uma fração da B. forficata inibiu o crescimento de E. coli e S. aureus na concentração de 1000 µg/mL.

Estes estudos corroboram com os resultados deste trabalho, demonstrando que não só B. forficata, mas várias espécies deste gênero possuem propriedades antimicrobianas. No entanto, há uma diferença entre as concentrações consideradas inibitórias. Isso pode ser explicado pela diferença de espécie, na qual cada uma apresenta composição química diferente e consequentemente maior ou menor concentração de princípios ativos, podendo haver ainda diferenças decorrentes do solo, clima e sazonalidade.

Os flavonoides, que são solubilizados em meio alcoólico, foram descritos como responsáveis pelas atividades biológicas de B. forficata (Silva e Filho, 2002), além de outros princípios ativos que sinergicamente contribuem para a atividade antimicrobiana.

As cepas Gram-positivas demonstraram-se mais sensíveis ao extrato do que as Gram-negativas. Isso se deve, provavelmente, a diferenças da composição química e física da parede celular entre os dois grupos de bactérias, entre outros fatores.

Tripanosomatídeos não patogênicos, como Herpetomonas samuelpessoai, surgiram como modelos importantes para o estudo dos processos biológicos básicos realizados por uma célula eucariótica (Gomes et al., 2012) sendo o mesmo utilizado como modelo para o estudo dos efeitos do extrato hidroalcóolico de B. forficata sobre o crescimento e diferenciação celular.

Os experimentos de crescimento celular em presença do extrato hidroalcoólico de Bauhinia forficata demonstraram que o número de tripanosomatídeos não foi reduzido e nem aumentado mesmo exacerbando-se a concentração do extrato, o que demonstra que este não inibe e nem estimula o crescimento de Herpetomonas samuelpessoai, nas concentrações testadas.

Tabela 3

Com relação à diferenciação celular, não foram observadas formas diferenciadas (para-opistomastigota) estatisticamente significativas, quando comparadas com os sistemas controles (Tabela 4), indicando a ausência de substâncias contidas no extrato potencialmente mitogênicos e, ou, mutagênicos, nesse sistema experimental.

Não foi encontrado na literatura estudos dos efeitos de B. forficata sobre este flagelado, nem mesmo utilizando plantas do mesmo gênero. No entanto, estudos utilizaram este modelo experimental para avaliar os efeitos de diferentes plantas medicinais (Fernandes et al., 2011; Perazzo et al., 2011).

No que tange à determinação da DL₅₀, após tratamento dos camundongos Swiss albinus, com concentrações de 1000 mg/kg, 1500 mg/Kg e 2000 mg/kg do extrato hidroalcoólico de B.forficata observação detalhada por um período de 14 dias, não foi constatado nenhum óbito, indicando que este extrato não apresenta toxicidade relativa para estes animais nas concentrações testadas.

O método do micronúcleo baseia-se na análise da frequência de danos ocorridos ao DNA, os quais são resultantes de mitoses ou meioses celulares que, em contato com agentes clastogênicos e aneugênicos, podem gerar a perda de fragmentos ou de cromossomos inteiros, formando assim os micronúcleos. A análise da relação entre eritrócitos policromáticos e normocromáticos fornece o indicativo do extrato estar diminuindo a produção de novos eritrócitos (policromáticos). Se isto ocorrer, a droga poderá ser considerada citotóxica (Fernandes et al., 2011).

Os dados da Tabela 5 demonstram os resultados do teste do micronúcleo obtidos em camundongos Swiss fêmeas e machos, tratados com as três doses do extrato de B. forficata (1000, 1500 e 2000 mg/Kg) e os controles positivo e negativo, nos tempos de 24 e 48 horas, respectivamente. São apresentados os números de eritrócitos policromáticos micronucleados (PCEMNs) para cada animal e a média de cada grupo. Esta Tabela também mostra a média da razão entre o número de eritrócitos policromáticos (PCE) e normocromáticos (NCE), em 2.000 células analisada/ animal.

Os resultados revelaram diferenças estatísticas significativas do número/índice percentual de PCEs micronucleados entre o grupo de animais do controle positivo (ENU 50mg/Kg) e controle negativo (NaCl 0,9%), bem como controle positivo e tratamentos (1000-2000mg/Kg).Entretanto, essas diferenças não foram observadas entre o grupo de animais do controle negativo e o grupo de animais tratados com o extrato e, ainda, entre os sexos e os tempos de tratamento (24-48h), sugerindo que o extrato hidroalcoólico de folhas de B.forficata não apresenta potencial clastogênico e/ou aneugênico. Este dado confirma os resultados encontrados no teste de diferenciação celular com H. samuelpessoai onde não foram constatadas células diferenciadas para opistomastigotas.

Estudo realizado por Macedo et al. (2008), utilizando folhas de Bauhinia monandra, por meio do teste do micronúcleo em Allium cepa (cebolas) e transformação plasmidial em Escherichia coli, comprovaram os resultados obtidos neste experimento, no qual o gênero Bauhinia não apresenta propriedades clastogênicas.

Menezes (2007) isolou dois flavonóides, quercetina-3,7-O-diramnosídeo e canferol-3,7-O-diramnosídeo do extrato aquoso de B. forficata. Os flavonóides, devido às suas propriedades antioxidantes e a capacidade de modular várias enzimas e receptores celulares, dependendo do número e posição dos grupos hidroxílicos no anel A e B, podem agir como mutagênicos ou um pró-oxidante (Skibola e Smith, 2000; Silva et al., 2000; Hodek et al., 2002). Este fato pode estar relacionado com a ausência de mutagenicidade da B. forficata, no qual os grupos hidroxílicos podem estar em posições e em números não específicos para exercer ação mutagênica.

Conclui-se que o extrato hidroalcóolico apresenta atividade antimicrobiana e considerando as concentrações, tempo e sistemas testes avaliados, não é tóxico, nem apresenta clastogenicidade. Contudo, ensaios adicionais de mutagenicidade devem ser realizados para confirmar a hipótese de uso seguro da planta.

Recebido para publicação em 20/09/2013

Aceito para publicação em 02/04/2014

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Set 2014
• Data do Fascículo
  Set 2014

Histórico

• Recebido
  20 Set 2013
• Aceito
  02 Abr 2014