Utilização de um ELISA baseado em NcSRS2 de Neospora caninum expressa em Pichia pastoris para diagnóstico de neosporose em ovinos e cães

A neosporose é uma doença causada pelo protozoário Neospora caninum que leva a perdas econômicas importantes em muitos países. No presente estudo, é descrita a utilização da proteína recombinante NcSRS2 de N. caninum expressa em Pichia pastoris em um ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para o diagnóstico de infecção por Neospora em ovelhas e cães. Observou-se, que utilizando-se um ELISA, o teste produziu uma especificidade de 94,5% e uma sensibilidade de 100% para ovinos; e uma especificidade de 93,3% e sensibilidade de 100% para cães. Uma maior sensibilidade foi observada em relação à IFI que foi confirmada por Western blot. Os resultados deste estudo sugerem que a proteína recombinante expressa em P. pastoris é bom antígeno para ser utilizado no diagnóstico imunológico para detectar N. caninum em duas espécies importantes expostas a esta parasitose

Neospora caninum ; Pichia pastoris ; NcSRS2; ELISA

Autoria

Amanda Fernandes Pinheiro

Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, BrazilUniversidade Federal de PelotasBrazilPelotas, RS, BrazilDepartamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto de Biologia, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, Brazil

Sibele Borsuk

Núcleo de Tecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, BrazilUniversidade Federal de PelotasBrazilPelotas, RS, BrazilNúcleo de Tecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, Brazil

Maria Elisabeth Aires Berne

Luciano da Silva Pinto

Renato Andreotti

Centro Nacional Gado de Corte, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, Campo Grande, MS, BrazilEmpresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaBrazilCampo Grande, MS, BrazilCentro Nacional Gado de Corte, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa, Campo Grande, MS, Brazil

Talita Roos

Barbara Couto Roloff

Fábio Pereira Leivas Leite ^**Corresponding author: Fábio Pereira Leivas Leite, Núcleo de Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Rua Gomes Carneiro, n. 1, Centro, CP 354, CEP 96010-610, Pelotas, RS, Brazil, e-mail: fabio_leite@ufpel.edu.br

*Corresponding author: Fábio Pereira Leivas Leite, Núcleo de Biotecnologia, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas, Rua Gomes Carneiro, n. 1, Centro, CP 354, CEP 96010-610, Pelotas, RS, Brazil, e-mail: fabio_leite@ufpel.edu.br

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Figure 1
(a) Western Blot using recombinant NcSRS2 protein expressed in the P. pastoris system. The recombinant protein reacted with serum samples from animals (sheep and dogs) naturally infected with N. caninum. Full-range rainbow molecular weight marker (GE). (b) Samples 1 and 2 are from sheep serum that was IFAT-negative, but reacted above the ELISA threshold (i.e. they were positive), and samples 3, 4 and 5 were IFAT-positive and reacted under the ELISA threshold (i.e. they were negative). (c) Samples 1 to 4 are from dogs that were IFAT-negative, but reacted above the ELISA threshold (i.e. they were positive), and samples 5 to 9 were IFAT-positive and reacted under the ELISA threshold (i.e. they were negative).

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Figure 2
ROC analysis on the ELISA-NcSRS2 test using 37 confirmed positive and 73 confirmed negative sheep serum samples (as shown using the indirect fluorescence antibody test). (a) Frequency distribution of the confirmed positive (1) and confirmed negative (0) serum samples. The samples were considered positive when the cutoff values were greater than or equal to a mean ELISA absorbance value of 0.25. (b) ROC plot. Area under curve = 0.996 (0.008); 95% confidence interval from 0.958 to 0.997. (c) Negative predictive values (squares) and positive predictive values (diamonds) associated with the ELISA-NcSRS2 test for varying prevalence levels of neosporosis, determined using ROC analysis based on mean OD threshold values in ELISA.

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Figure 3
ROC analysis on the ELISA-NcSRS2 test using 21 confirmed positive and 44 confirmed negative canine serum samples (as shown using the indirect fluorescence antibody test). (a) Frequency distribution of the confirmed positive (1) and confirmed negative (0) serum samples. The samples were considered positive when the cutoff values were greater than or equal to a mean ELISA absorbance value of 0.21. (b) ROC plot. Area under curve = 0.986 (0.018); 95% confidence interval from 0.919 to 0.997. (c) Negative predictive values (squares) and positive predictive values (diamonds) associated with the ELISA-NcSRS2 test for varying prevalence levels of neosporosis, determined using ROC analysis based on mean OD threshold values in ELISA.

Figure 1 (a) Western Blot using recombinant NcSRS2 protein expressed in the P. pastoris system. The recombinant protein reacted with serum samples from animals (sheep and dogs) naturally infected with N. caninum. Full-range rainbow molecular weight marker (GE). (b) Samples 1 and 2 are from sheep serum that was IFAT-negative, but reacted above the ELISA threshold (i.e. they were positive), and samples 3, 4 and 5 were IFAT-positive and reacted under the ELISA threshold (i.e. they were negative). (c) Samples 1 to 4 are from dogs that were IFAT-negative, but reacted above the ELISA threshold (i.e. they were positive), and samples 5 to 9 were IFAT-positive and reacted under the ELISA threshold (i.e. they were negative).

Figure 2 ROC analysis on the ELISA-NcSRS2 test using 37 confirmed positive and 73 confirmed negative sheep serum samples (as shown using the indirect fluorescence antibody test). (a) Frequency distribution of the confirmed positive (1) and confirmed negative (0) serum samples. The samples were considered positive when the cutoff values were greater than or equal to a mean ELISA absorbance value of 0.25. (b) ROC plot. Area under curve = 0.996 (0.008); 95% confidence interval from 0.958 to 0.997. (c) Negative predictive values (squares) and positive predictive values (diamonds) associated with the ELISA-NcSRS2 test for varying prevalence levels of neosporosis, determined using ROC analysis based on mean OD threshold values in ELISA.

Figure 3 ROC analysis on the ELISA-NcSRS2 test using 21 confirmed positive and 44 confirmed negative canine serum samples (as shown using the indirect fluorescence antibody test). (a) Frequency distribution of the confirmed positive (1) and confirmed negative (0) serum samples. The samples were considered positive when the cutoff values were greater than or equal to a mean ELISA absorbance value of 0.21. (b) ROC plot. Area under curve = 0.986 (0.018); 95% confidence interval from 0.919 to 0.997. (c) Negative predictive values (squares) and positive predictive values (diamonds) associated with the ELISA-NcSRS2 test for varying prevalence levels of neosporosis, determined using ROC analysis based on mean OD threshold values in ELISA.

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