gp19 recombinante como um antígeno potencial para detecção de anticorpos anti-<i>Ehrlichia canis</i> em soros de cães

A erliquiose monocítica canina, causada por Ehrlichia canis, é uma doença endêmica em diversas regiões do Brasil. Algumas técnicas de diagnóstico sorológico, utilizando proteínas imunodominantes de E. canis como antígenos, estão disponíveis, porém suas especificidades e sensibilidades são questionáveis. Com base nesse fato, o objetivo deste trabalho foi testar o potencial antigênico da proteína GP19 recombinante (rGP19) para posterior utilização em testes diagnósticos. A rGP19, expressa em E. coli cepa BL21 (DE3) C41, foi reconhecida por soros de cães experimentalmente infectados pelas técnicas de ELISA e Western blotting. Dessa maneira, conseguiu-se obter um antígeno promissor com a capacidade de diferenciar animais positivos de negativos, até mesmo uma semana após a infecção.

Diagnóstico; sorologia; rickettsias; ehrliquiose

Autoria

Rômulo Silva de Oliveira

Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, BrasilUniversidade Federal de PelotasBrasilPelotas, RS, BrasilDepartamento de Microbiologia e Parasitologia, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, Brasil

Rodrigo Casquero Cunha

Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, BrasilUniversidade Federal de PelotasBrasilPelotas, RS, BrasilCentro de Desenvolvimento Tecnológico, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, Pelotas, RS, Brasil

Jonas Moraes-Filho

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, BrasilUniversidade de São PauloBrasilSão Paulo, SP, BrasilFaculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil

Relber Aguiar Gonçales

Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, BrasilUniversidade de São PauloBrasilSão Paulo, SP, BrasilPós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil

Ana Paula de Souza Stori de Lara

Luciana Farias da Costa de Avila

Marcelo Bahia Labruna

Fábio Pereira Leivas Leite ^**Corresponding author: Fábio Pereira Leivas Leite. Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTEC, Biotecnologia, Campus Capão do Leão, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, prédio 19, Corredor da Embrapa, s/n, Capão do Leão, CEP 96160-000, Pelotas, RS, Brasil. e-mail: fabio@leivasleite.com.br

*Corresponding author: Fábio Pereira Leivas Leite. Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTEC, Biotecnologia, Campus Capão do Leão, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, prédio 19, Corredor da Embrapa, s/n, Capão do Leão, CEP 96160-000, Pelotas, RS, Brasil. e-mail: fabio@leivasleite.com.br

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Figuras

Figuras (9)

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Figure 1
The plasmid pAE-gp19 with the gp19 gene inserted between the KpnI and EcoRI restriction enzyme sites.

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Figure 2
Solubility test for GP19. 12% SDS-PAGE stained with Coomassie Blue. M: Molecular marker (Bio-Rad); 1: total extract sonicated; 2: pellet of the sonication with Akta Wash buffer; 3: supernatant of the sonication with Akta Wash buffer; 4: pellet of the solubilization with Akta Wash buffer with N-lauroylsarcosine; 5: supernatant of the solubilization with Akta Wash buffer with N-lauroylsarcosine; 6: pellet of the solubilization with Akta Wash buffer with urea; 7: supernatant of the solubilization with Akta Wash buffer with urea. Arrows indicate gp19.

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Figure 3
12% SDS-PAGE stained with Coomassie Blue. M: Molecular marker (Bio-Rad); 1:1 µg of polyhistidine-tag protein with 73 kDa; 2:10 µg of bovine serum albumin (BSA); 4:3 µg of purified rGP19.

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Figure 4
Western blotting. M: Molecular marker Dual Color (Bio-Rad); 1 and 5) 1 µg of polyhistidine-tag protein; 2) 5 µg of bovine serum albumin (BSA); 3 and 4) 3 µg of purified rGP19; 1, 2, and 3) incubated with anti-His; 4 and 5) incubated with dog anti-E. canis. Arrows: rGP19 recognized by anti-His and anti-E. canis; asterisk: dimers and trimers of rGP19 recognized by anti-His and anti-E. canis.

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Figure 5
ELISA standardization. P50, P100, P150, and P200 are positive sera, incubated with 50, 100, 150, and 200 ng of rGP19 per well, respectively. N50, N100, N150, and N200 are negative sera, incubated with 50, 100, 150, and 200 ng of rGP19 per well, respectively.

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Figure 6
Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from dog 1 and its OD_492nm from ELISA.

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Figure 7
Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from dog 2 and its OD_492nm from ELISA.

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Figure 8
Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from dog 3 and its OD_492nm from ELISA.

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Figure 9
Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from the three dogs and their OD_492nm from ELISA.

Figure 1 The plasmid pAE-gp19 with the gp19 gene inserted between the KpnI and EcoRI restriction enzyme sites.

Figure 2 Solubility test for GP19. 12% SDS-PAGE stained with Coomassie Blue. M: Molecular marker (Bio-Rad); 1: total extract sonicated; 2: pellet of the sonication with Akta Wash buffer; 3: supernatant of the sonication with Akta Wash buffer; 4: pellet of the solubilization with Akta Wash buffer with N-lauroylsarcosine; 5: supernatant of the solubilization with Akta Wash buffer with N-lauroylsarcosine; 6: pellet of the solubilization with Akta Wash buffer with urea; 7: supernatant of the solubilization with Akta Wash buffer with urea. Arrows indicate gp19.

Figure 3 12% SDS-PAGE stained with Coomassie Blue. M: Molecular marker (Bio-Rad); 1:1 µg of polyhistidine-tag protein with 73 kDa; 2:10 µg of bovine serum albumin (BSA); 4:3 µg of purified rGP19.

Figure 4 Western blotting. M: Molecular marker Dual Color (Bio-Rad); 1 and 5) 1 µg of polyhistidine-tag protein; 2) 5 µg of bovine serum albumin (BSA); 3 and 4) 3 µg of purified rGP19; 1, 2, and 3) incubated with anti-His; 4 and 5) incubated with dog anti-E. canis. Arrows: rGP19 recognized by anti-His and anti-E. canis; asterisk: dimers and trimers of rGP19 recognized by anti-His and anti-E. canis.

Figure 5 ELISA standardization. P50, P100, P150, and P200 are positive sera, incubated with 50, 100, 150, and 200 ng of rGP19 per well, respectively. N50, N100, N150, and N200 are negative sera, incubated with 50, 100, 150, and 200 ng of rGP19 per well, respectively.

Figure 6 Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from dog 1 and its OD_492nm from ELISA.

Figure 7 Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from dog 2 and its OD_492nm from ELISA.

Figure 8 Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from dog 3 and its OD_492nm from ELISA.

Figure 9 Comparison between the titration by IIFA of the sera collected from the three dogs and their OD_492nm from ELISA.

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[1] *Corresponding author: Fábio Pereira Leivas Leite. Centro de Desenvolvimento Tecnológico – CDTEC, Biotecnologia, Campus Capão do Leão, Universidade Federal de Pelotas – UFPel, prédio 19, Corredor da Embrapa, s/n, Capão do Leão, CEP 96160-000, Pelotas, RS, Brasil. e-mail: fabio@leivasleite.com.br