Polimorfismos dos genes metilenotetrahidrofolato redutase, fator de crescimento transformador β1 e linfotoxina-α e susceptibilidade à artrite reumatoide

Olfat G. Shaker Amina M. Alnoury Gehan A. Hegazy Hemmat E. El Haddad Safaa Sayed Ahmed Hamdy Sobre os autores

ABSTRACT

Background:

Rheumatoid arthritis is a widely prevalent autoimmune disorder with suggested genetic predisposition.

Objectives:

The aim of this study is to detect the pattern of genetic polymorphism of methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR C677 T and A1298 C), transforming growth factor-β1 (TGF-β1 T869 C) and lymphotoxin-α (LT-α A252G) in patients having rheumatoid arthritis and correlate these patterns to disease activity and serum levels of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), B-Cell Activating Factor (BAFF), and osteopontin.

Methods:

A total of 194 subjects, 90 controls and 104 patients with rheumatoid arthritis were genotyped for MTHFR C677 T and A1298 C, TGF-β1 T869 C and LT-α A252G polymorphisms using a methodology based on PCR-RFLP. Also serum levels of TNF-α, osteopontin and BAFF were measured by ELISA kits.

Results:

The CT genotype and T allele of MTHFR C677 T and GG genotype and G allele of LT-α A252G are associated with the risk of RA and with higher levels of the pro-inflammatory cytokine, TNF-α in patients with rheumatoid arthritis.

Conclusion:

Our findings suggest that there is association between MTHFR C677 T and LT-α A252G genes polymorphisms and increased risk of RA in this sample of Egyptian population.

Keywords:
Rheumatoid arthritis; Gene polymorphism; MTHFR C677 T and A1298 C; TGF-β1 T869 C; LT-α A252G

RESUMO

Antecedentes:

A artrite reumatoide é uma doença autoimune amplamente prevalente com sugerida predisposição genética.

Objetivos:

Detectar o padrão de polimorfismo dos genes metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR C677 T e A1298 C), fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1 T869 C) e linfotoxina-α (LT-α A252G) em pacientes com artrite reumatoide e correlacionar esses padrões com a atividade da doença e os níveis séricos de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator ativador de linfócitos B (BAFF) e osteopontina.

Métodos:

Foram genotipados 194 indivíduos – 90 controles e 104 com artrite reumatoide – à procura de polimorfismos dos genes MTHFR C677 T e A1298 C, TGF-β1 T869 C e LT-α A252G com uma metodologia baseada na PCR-RFLP. Mensuraram-se também os níveis séricos de TNF-α, osteopontina e BAFF com kits de Elisa.

Resultados:

O genótipo CT e o alelo T do MTHFR C677 T e o genótipo GG e alelo G do LT-α A252G estão associados ao risco de AR e a níveis mais elevados da citocina pró-inflamatória TNF-α em pacientes com artrite reumatoide.

Conclusão

Os achados do presente estudo sugerem que há associação entre os polimorfismos dos genes MTHFR C677 T e LT-α A252G e um risco aumentado de AR nessa amostra da população egípcia.

Palavras-chave:
Artrite reumatoide; Polimorfismo genético; MTHFR C677 T e A1298 C; TGF-β1 T869 C; LT-α A252G

Introdução

A artrite reumatoide (AR) é uma doença autoimune muito prevalente, que afeta aproximadamente 1% da população nos países desenvolvidos; as mulheres são mais frequentemente afetadas do que os homens (aproximadamente 3:1).11 Helmick CG, Felson DT, Lawrence RC, Gabriel S, Hirsch R, Kwoh CK, et al. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. Part I. Arthritis Rheum. 2008;58:15-25. Nessa doença, as articulações são o principal alvo de ataque, com grande tendência à destruição das articulações e, consequentemente, a déficits em todos os aspectos da qualidade de vida.22 Vinay DS, Kwon BS. Targeting TNF superfamily members for therapeutic intervention in rheumatoid arthritis. Cytokine. 2012;57:305-12. As causas exatas da doença são desconhecidas, mas fatores ambientais e predisposição genética estão envolvidos. Embora esses fatores não sejam suficientes para o desenvolvimento da doença, podem desempenhar um papel na heterogeneidade do quadro clínico e na resposta ao tratamento e ser o alvo de agentes terapêuticos. Formas polimórficas do gene metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) e alguns genes de citocinas têm sido estudados como possíveis marcadores da susceptibilidade, gravidade e/ou proteção na AR.33 Inanir A, Yigit S, Tekcan A, Tural S, Kismali G. IL-4 and MTHFR gene polymorphism in rheumatoid arthritis and their effects. Immunol Lett. 2013;152:104-8.

O C677 T (Ala 222 Val) e o A1298 C (Glu 429 Ala) são dois polimorfismos genéticos comuns do gene MTHFR. Ambos estão associados à diminuição na atividade da enzima 5, 10 metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), com menor grau para o polimorfismo A1298 C em comparação com o C677 T.44 De Mattia E, Toffoli G. C677T and A1298C MTHFR polymorphisms, a challenge for antifolate and fluoropyrimidine-based therapy personalisation. Eur J Cancer. 2009;45:1333-51. Essa enzima é responsável pela síntese de metilenotetrahidrofolato, necessária para a síntese de purina e pirimidina e regeneração da metionina a partir da homocisteína.55 Spyridopoulou KP, Dimou NL, Hamodrakas SJ, Bagos PG. Methylene tetrahydrofolate reductase gene polymorphisms and their association with methotrexate toxicity: a meta-analysis. Pharmacogenet Genomics. 2012;22:117-33. A diminuição na atividade dessa enzima resulta em níveis elevados de homocisteína, que são comumente encontrados em pacientes com artrite reumatoide (AR) e são parcialmente responsáveis pela alta taxa de complicações cardiovasculares nesses indivíduos.66 Erb N, Kitas G. Homocysteine modulation as a reason for continuous folic acid supplementation in methotrexate-treated rheumatoid arthritis patients. Rheumatology. 2001;40:715-6.

O fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) é um fator de crescimento que regula a proliferação celular, a cicatrização de feridas e a angiogênese de um modo específico à célula.77 Epstein FH, Blobe GC, Schiemann WP, Lodish HF. Role of transforming growth factor β in human disease. N Engl J Med. 2000;342:1350-8. Está presente em abundância em articulações reumatoides e tem uma função anti-inflamatória, porque a sobre-expressão desse gene reduziu a artrite em um modelo animal.88 Evans CH, Ghivizzani SC, Kang R, Muzzonigro T, Wasko MC, Herndon JH, et al. Gene therapy for rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 1999;42:1-16. Indivíduos com polimorfismos nas regiões de codificação e regulação do TGF-p 1 têm uma maior propensão a desenvolver transtornos imunes. O polimorfismo TGF-β1 (T869 C) afeta os níveis séricos de TGF-β1 e é usado como marcador para o aumento no risco de doença em várias enfermidades.99 Aoki CA, Borchers AT, Li M, Flavell RA, Bowlus CL, Ansari AA, et al. Transforming growth factor beta (TGF-beta) and autoimmunity. Autoimmun Rev. 2005;4:450-9.

As citocinas desempenham um papel importante na patogênese da AR e seus processos inflamatórios associados e destruição articular. Isso ocorre principalmente por meio do desvio do equilíbrio para níveis mais elevados de citocinas pró-inflamatórias à custa de citocinas anti-inflamatórias. Assim, a concentração de membros da superfamília pro-inflamatória TNF-α está diretamente correlacionada com a patologia da doença.1010 Perricone C, Ceccarelli F, Valesini G. An overview on the genetic of rheumatoid arthritis: a never-ending story. Autoimmun Rev. 2011;10:599-608. O TNF-α é uma potente citocina pró-inflamatória produzida principalmente por macrófagos. É considerado um dos principais mediadores inflamatórios da inflamação e destruição articular na AR ao induzir outras citocinas inflamatórias e estimular a expressão de moléculas de adesão pelos fibroblastos.1111 Vasanthi P, Nalini G, Rajasekhar G. Role of tumor necrosis factor-alpha in rheumatoid arthritis: a review. APLAR J Rheumatol. 2007;10:270-4. A linfotoxina-α (LT-α), outro membro da superfamília do TNF anteriormente conhecida como fator de necrose tumoral-β (TNF-β), induz à apoptose celular e a respostas inflamatórias após a ligação ao receptor de TNF tipos 1 e 2, respectivamente.1212 Lu R, Dou X, Gao X, Zhang J, Ni J, Guo L. A functional polymorphism of lymphotoxin-alpha (LTA) gene rs909253 is associated with gastric cancer risk in an Asian population. Cancer Epidemiol. 2012;36:e380-6. Detectou-se um polimorfismo de nucleotídeo único (A252G) no primeiro intron do gene LT-α e relatou-se que esse aumenta a expressão do nível plasmático de LT-α.1313 Messer G, Spengler U, Jung MC, Honold G, Blomer K, Pape GR, et al. Polymorphic structure of the tumor necrosis factor (TNF) locus: an NcoI polymorphism in the first intron of the human TNF-beta gene correlates with a variant amino acid in position 26 and a reduced level of TNF-beta production. J Exp Med. 1991;173:209-19. Os dois alelos resultantes desse polimorfismo de nucleotídeo único são designados LT-α (10,5 kb) e LT-α (5,5 kb). O alelo LT-α (5,5 kb) está associado a níveis plasmáticos mais elevados de LT-α, malignidades linfoides e a um pior desfecho de doenças autoimunes.1414 Partida-Rodríguez O, Torres J, Flores-Luna L, Camorlinga M, Nieves-Ramírez M, Lazcano E, et al. Polymorphisms in TNF and HSP-70 show a significant association with gastric cancer and duodenal ulcer. Int J Cancer. 2010;126:1861-8.

Outro membro da família TNF é o fator ativador de linfócitos B (BAFF), que pode se ligar a linfócitos B, estimular a sua proliferação e promover a sua sobrevivência e, consequentemente, ajudar na regulação da resposta imune inata e adaptativa. Observou-se uma desregulação do BAFF em pacientes com doenças autoimunes como a artrite reumatoide.1515 Sun J, Lin Z, Feng J, Li Y, Shen B. BAFF-targeting therapy, a promising strategy for treating autoimmune diseases. Eur J Pharmacol. 2008;597:1-5. A osteopontina (OPN) também é uma citocina pró-inflamatória que tem efeitos imunorreguladores em doenças autoimunes e pode estar envolvida na patogênese da AR.1616 Wang KX, Denhardt DT. Osteopontin: role in immune regulation and stress responses. Cytokine Growth Factor Rev. 2008;19:333-345.

O objetivo deste estudo é detectar o padrão de polimorfismo do gene MTHFR dos tipos (C677 T) e (A1298 C), TGF-β1 (T869 C) e LT-α (A252G) em pacientes com artrite reumatoide egípcios e se há alguma correlação daqueles padrões com a atividade da doença e os níveis séricos de TNF-α, BAFF e osteopontina.

Amostra e métodos

Seleção da amostra

Trata-se de um estudo observacional transversal comparativo que foi feito na Unidade de Reumatologia Kasr Al Aini da Faculdade de Medicina da Universidade do Cairo, de maio a dezembro de 2013. O estudo foi feito de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e foi aprovado pelo comitê de ética local da Faculdade de Medicina da Universidade do Cairo.

Foi obtido um consentimento informado por escrito de todos os participantes, depois de se explicarem a finalidade e a natureza da pesquisa. Foram incluídos 104 pacientes com artrite reumatoide (16 homens e 88 mulheres) e 90 indivíduos saudáveis de idade e sexo correspondentes que atuaram como controle. Os pacientes estavam em tratamento regular com fármacos anti-inflamatórios não esteroides (Aine) (n = 42), metotrexato (n = 88), prednisona (n = 24), leflunomida (n = 32) e hidroxicloroquina (n = 56). Os pacientes eram tratados com diferentes combinações dos fármacos anteriores. Fizeram-se uma anamnese completa e exame físico de todos os pacientes e calcularam-se o escore de atividade da doença em 28 articulações (DAS-28) e a pontuação total do Health Assessment Questionnaire (HAQ).

Exames laboratoriais

Mensuraram-se os níveis séricos de BAFF, OPN e TNF-α com kits de Elisa obtidos da R&D Systems, Minneapolis, MN para os dois primeiros e da AviBion, Helsinki, Finlândia para o TNF-α, de acordo com o protocolo do fabricante.

Análise molecular

Extração de DNA

O DNA genômico foi extraído do sangue periférico com o minikit QIAamp DNA (Qiagen, Valencia, CA, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. A genotipagem foi feita por reação da polimerase em cadeia – polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (PCR-RFLP).

Genotipagem do MTHFR A1298C1717 Van der Put NM, Gabreels F, Stevens EM, Smeitink JA, Trijbels FJ, Eskes TK, et al. A second common mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase gene: an additional risk factor for neural-tube defects? Am J Hum Genet. 1998;62:1044-51.

Usou-se um conjunto de primers forward "5’-TGG CTT GGA GCT GAA GGA CTA C-3” e reverse "5’-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3” para a amplificação de um fragmento de 241 pares de bases; em seguida, o fragmento amplificado foi digerido pela enzima MboII. O perfil de PCR foi: desnaturação inicial a 95 ºC durante 5 min, seguido por 35 ciclos de 30 segundos cada a 94 ºC, 51 ºC e 72 ºC, depois durante 10 min a 72 ºC. O genótipo AA produz duas bandas de 211 e 30 bp, o genótipo CC produz uma banda única de 241 bp (não dividida), e os genótipos AC produzem três bandas de 241, 211 e 30 bp.

Genotipagem do MTHFR C677T1818 Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, et al. A candidate genetic risk factor for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet. 1995;:111-3.

Usou-se um conjunto de primers forward "5’-CAT CCC TAT TGG CAG GTT AC-3” e reverse "5’-GAC GGT GCG GTG AGA GTG-3” para a amplificação de um fragmento de 198 pares de bases; em seguida, os fragmentos amplificados foram digeridos pela enzima HinfI. O perfil de PCR foi: desnaturação inicial a 94 ºC durante 5 min, seguido por 35 ciclos de 30 segundos cada a 94 ºC, 61 ºC e 72 ºC e uma extensão final a 72 ºC durante 5 min. O genótipo CC selvagem foi identificado por um fragmento único de 198 bp, o genótipo (TT) pelos fragmentos de 175/23 bp e o genótipo heterozigoto (CT) pelos fragmentos de 198, 175 e 23 bp.

Genotipagem dos genótipos TGF-β1 T869C1919 Wood NA, Thomson SC, Smith RM, Bidwell JL. Identification of human TGF-beta1 signal (leader) sequence polymorphisms by PCR-RFLP. J Immunol Methods. 2000;234:117-22.

Usou-se um conjunto de primers forward "5’-TTCCCTCGAGGCCCTCCTA-3” e reverse "5’-GCCGCAGCTTGGACAGGATC” para a amplificação de fragmentos de 294 bp do gene TGF-β1. Os produtos da PCR foram então digeridos pela enzima MspA1I. O perfil de PCR foi: desnaturação a 96 ºC durante 10 minutos, seguido por 35 ciclos de 75 segundos cada a 96 ºC, 62 ºC e 72 ºC, e uma extensão final a 72 ºC durante 5 min. O alelo T resultou em quatro fragmentos de 161, 67, 40 e 26 bp. O alelo C resultou em fragmentos de 149, 67, 40, 26 e 12 bp.

Genotipagem do LT-α (A252 g)2020 Vasconcelos DF, Da Silva MA, Marques MR, De Brito Junior RB, Vasconcelos AC, Barros SP. Lymphotoxin-alpha gene polymorphism +252A/G (rs909253, A/G) is associated with susceptibility to chronic periodontitis: a Pilot Study. ISRN Dent. 2012;2012:617245. PubMed PMID: 23050158. PubmedCentral PMCID: 3463161.

Um fragmento de 782 bp do intron 1 (+252A/G) do gene LT-α foi amplificado por PCR com um conjunto de primers: (forward) "5’-AGAGGGGTGGATGCTTGGGTTC-3” e (reverse) "5’-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3”. Os produtos da PCR foram digeridos pela enzima de restrição NcoI. O alelo G produz um fragmento único de 782 bp (não digerido). O alelo G é digerido em bandas de 586 bp e 196 bp. O perfil de PCR foi: incubação durante 5 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 1 min a 95 ºC, 1 min a 52 ºC e 1 min a 72 ºC, com uma extensão final a 72 ºC durante 7 min.

Análise estatística

Usou-se o programa Statistical Package of Social Science Software (SPSS), versão 19, para analisar os dados. Os dados foram resumidos com a frequência e a percentagem para os dados qualitativos ou média e desvio padrão para os quantitativos. A análise de qui-quadrado foi usada para testar o desvio da distribuição dos genótipos do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A comparação entre pacientes e controle saudáveis foi feita por meio do teste de qui-quadrado ou teste exato de Fisher para dados qualitativos e teste t de Student e análise de variância para os quantitativos. Usou-se a análise de regressão bivariada para detectar a associação entre as diferentes formas genéticas polimórficas e a doença. A análise da curva Receiver Operating Characteristics (ROC) foi feita para explorar a capacidade de discriminação da osteopontina e TNF em pacientes com AR. Valores de p inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

As características dos pacientes, incluindo idade, duração da doença, manifestações clínicas, atividade da doença e VHS são mostradas na tabela 1.

Tabela 1
Características dos pacientes

A comparação entre os níveis séricos de osteopontina, BAFF e TNF-α (expressos como a média ± DP) em pacientes e controles mostrou que os níveis séricos de OPN e de TNF-α foram significativamente maiores nos pacientes em comparação com os controles (p < 0,001). O nível sérico de BAFF não apresentou diferença estatisticamente significativa entre pacientes e controles (p = 0,6) (tabela 2).

Tabela 2
Comparação entre os níveis séricos de osteopontina, BAFF e TNF-α (expressos como a média ± desvio padrão) em pacientes e controles

Ao comparar a capacidade do TNF, da osteopontina e do BAFF de discriminar os controles dos pacientes com artrite reumatoide, a curva ROC mostrou que o TNF-α tem uma maior capacidade de discriminação do que a OPN, com sensibilidade (94,2%) e especificidade (84,4%) no valor de ponto de corte de 15,2 pg/mL. Por outro lado, a OPN tem sensibilidade (71,2%) e especificidade (53,3%) no valor de ponto de corte de 5,7 ng/mL, tal como calculado pela curva ROC (fig. 1).

Figura 1
Curva ROC que mostra a capacidade de TNF, osteopontina e BAFF de discriminar os controles dos pacientes com artrite reumatoide.

Os resultados deste estudo mostraram que as frequências genotípicas de todos os casos estudados estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg para o MTHFR C677 T e A1298 C e TGF-β1 T869 C. Quanto ao LT-α A252G, as frequências genotípicas estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg somente no grupo controle.

Analisou-se a associação entre a artrite reumatoide e diferentes formas polimórficas do MTHFR C677 T, MTHFR A1298 C, TGF-β1 T869 C e LT-α A252G (tabela 3). Os resultados dessa análise mostraram uma associação estatisticamente significativa entre a artrite reumatoide e o genótipo CT, alelo T do MTHRF C677 T e genótipo GG e alelo G do LT-α A252G. Por outro lado, o genótipo AC do MTHFR A1298 C mostrou um efeito protetor para a doença, quando comparado com o genótipo AA selvagem. Além disso, não foi detectada associação estatisticamente significativa entre as diferentes formas polimórficas do polimorfismo T869 C do gene TGF-β1 e a artrite reumatoide (tabela 3).

Tabela 3
Associação entre a artrite reumatoide e diferentes formas polimórficas de MTHFR C677 T, MTHFR A1298 C, TGF-β1 T869 C e LT-α A252G

O HAQ total não apresentou qualquer associação com diferentes formas polimórficas do polimorfismo MTHFR C677 T (χ2 = 5,5, p = 0,06), MTHFR A1298 C, (χ2 = 2,26, p = 0,32), TGF-β1 T869 C (χ2 = 1,31, p = 0,52) ou LT-α (χ2 = 1,1, p = 0,57). Além disso, a atividade da doença, conforme mostrada pelo DAS-28, não esteve associada a formas polimórficas de qualquer dos genes examinados – MTHFR C677 T (χ2 = 0,4 p = 0,81), MTHFR A1298 C (χ2 = 0,69, p = 0,7), TGF-β1 T869 C (χ2 = 4,27, p = 0,12) e LT-α (χ2 = 4,54, p = 0,1).

Descobriu-se que os níveis séricos de TNF-α diferem significativamente nas diferentes formas polimórficas de todos os genes testados, com exceção do MTHFR A1298 C, como mostrado na tabela 4. O teste post hoc mostrou que o TNF-α sérico é significativamente maior no genótipo CT do que no genótipo CC do MTHFR C677 (p = 0,009), no genótipo CT do que no genótipo TT do TGF-β1 T869 C (p = 0,005), no genótipo GG quando comparado com o genótipo AA (p = 0,008) e genótipo AG (p = 0,005) do LT-α A252G. Não há diferença estatisticamente significativa nos níveis séricos de OPN e BAFF nos diferentes genótipos dos genes examinados (tabela 4).

Tabela 4
Comparação entre os níveis séricos de osteopontina, TNF-α e FABF nos diferentes genótipos em todos os casos estudados (n = 194)

Discussão

Embora a etiologia da AR permaneça pouco clara, fatores de susceptibilidade – que incluem fatores ambientais e genéticos – são evidentes. Os fatores genéticos constituem cerca de 50% desses fatores.33 Inanir A, Yigit S, Tekcan A, Tural S, Kismali G. IL-4 and MTHFR gene polymorphism in rheumatoid arthritis and their effects. Immunol Lett. 2013;152:104-8. As citocinas pró-inflamatórias amplificam o processo inflamatório e a destruição das articulações reumatoides. O fator de necrose tumoral, a osteopontina e o BAFF estão entre essas citocinas.33 Inanir A, Yigit S, Tekcan A, Tural S, Kismali G. IL-4 and MTHFR gene polymorphism in rheumatoid arthritis and their effects. Immunol Lett. 2013;152:104-8.

Neste estudo, os níveis séricos de TNF-α foram significativamente mais elevados em pacientes em comparação com os controles. Os resultados referentes ao TNF-α coincidem com os resultados de estudos anteriores, como os de Gheita et al.2121 Gheita TA, Azkalany GS, Gaber W, Mohey A. Clinical significance of serum TNFα and-308 G/A promoter polymorphism in rheumatoid arthritis. Egypt Rheumatol. 2015;37:49-54. e Ismail et al.;2222 Ismail F, Ali HA-H, Ibrahim HM. Possible role of leptin, and tumor necrosis factor-alpha in hypoandrogenicity in patients with early rheumatoid arthritis. Egypt Rheumatol. 2011;4:209-15. esses autores explicaram os resultados por seu papel vital e central na etiologia e patogênese da AR, daí os inibidores do TNF terem sido os primeiros fármacos biológicos antirreumáticos modificadores da doença (DMARD) a ser aprovados para o tratamento da AR. Esses medicamentos são agora parte do tratamento de rotina dos pacientes com essa doença.2323 Willrich MA, Murray DL, Snyder MR. Tumor necrosis factor inhibitors: clinical utility in autoimmune diseases. Transl Res. 2015;165:270-82. No entanto, Ebrahimi et al.2424 Ebrahimi AA, Noshad H, Sadreddini S, Hejazi MS, Mohammadzadeh Sadigh Y, Eshraghi Y, et al. Serum levels of TNF-alpha, TNF-alpha RI, TNF-alpha RII and IL-12 in treated rheumatoid arthritis patients. Iran J Immunol. 2009;6:147-53. relataram um aumento não significativo nos níveis séricos de TNF-α em pacientes quando comparados com os controles.

Além disso, nossos resultados mostraram um aumento significativo nos níveis séricos de OPN em pacientes com AR em comparação com o grupo controle saudável; isso concorda com os achados de Ji et al.2525 Ji H-I, Lee S-H, Song R, Yang H-I, Lee Y-A, Hong S-J, et al. Serum level of osteopontin as an inflammatory marker does not indicate disease activity or responsiveness to therapeutic treatments in patients with rheumatoid arthritis. Clin Rheumatol. 2014;33:397-402. e Chen et al.,2626 Chen G, Zhang X, Li R, Fang L, Niu X, Zheng Y, et al. Role of osteopontin in synovial Th17 differentiation in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2010;62:2900-8. que explicaram esses resultados pelo papel fundamental da OPN e seus receptores na patogênese da AR. Assim, vários estudos experimentais com o objetivo de usar a OPN como alvo terapêutico estão sendo feitos e os desfechos desses resultados são promissores.2727 Zhang F, Luo W, Li Y, Gao S, Lei G. Role of osteopontin in rheumatoid arthritis. Rheumatol Int. 2015;35:589-95.

Por outro lado, os níveis séricos de BAFF não mostraram diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos, o que concorda com os resultados encontrados previamente por Eldin et al.2828 Eldin AB, Sayed S, Hegazy G, Shaker O. B-Cell Activating Factor (BAFF) in systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and Behçet's disease. Arch Rheumatol. 2012;27:185-94. No entanto, Mahdy et al.2929 Mahdy AA, Raafat HA, El-Fishawy HS, Gheita TA. Therapeutic potential of hydroxychloroquine on serum B-cell activating factor belonging to the tumor necrosis factor family (BAFF) in rheumatoid arthritis patients. Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University; 2014. e Moura et al.3030 Moura RA, Cascão R, Perpétuo I, Canhão H, Vieira-Sousa E, Mourão AF, et al. Cytokine pattern in very early rheumatoid arthritis favours B-cell activation and survival. Rheumatology. 2010:keq338. relataram um aumento significativo nos níveis séricos de BAFF entre pacientes com AR, em especial naqueles com maior atividade da doença e duração da doença mais curta. Essa discrepância de resultados pode ser atribuída à diferente atividade e duração da doença no grupo estudado.

O genótipo CT e o alelo T do MTHFR C677 T estão associados à AR e a um nível sérico superior de TNF-α, mas não têm efeito significativo sobre os níveis séricos de OPN e BAFF. Por outro lado, as diferentes formas polimórficas do MTHFR A1298 C não estiveram associadas à AR ou aos níveis séricos de TNF-α, OPN ou BAFF. O genótipo AC do MTHFR A1298 C mostrou efeito protetor para a doença. Isso pode ser decorrente do maior efeito do MTHFR C677 T na enzima MTHFR, que resulta em hiper-homocisteinemia e subsequente ativação da cascata de citocinas. Os resultados de estudos prévios foram heterogêneos; alguns não mostraram associação entre o risco de AR e as diferentes formas polimórficas do MTHFR C677 T e A1298 C.3131 Palomino-Morales R, Gonzalez-Juanatey C, Vazquez-Rodriguez TR, Rodriguez L, Miranda-Filloy JA, Fernandez-Gutierrez B, et al. Research article A1298C polymorphism in the MTHFR gene predisposes to cardiovascular risk in rheumatoid arthritis. Heart Fail. 2010;5:2.3.,3232 Hughes LB, Beasley TM, Patel H, Tiwari HK, Morgan SL, Baggott JE, et al. Racial or ethnic differences in allele frequencies of single-nucleotide polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and their influence on response to methotrexate in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2006;65:1213-8. Outros relataram associação do alelo T, mas não de alguma das formas polimórficas do MTHFR C677 T com a AR.33 Inanir A, Yigit S, Tekcan A, Tural S, Kismali G. IL-4 and MTHFR gene polymorphism in rheumatoid arthritis and their effects. Immunol Lett. 2013;152:104-8. Rubini et al.3333 Rubini M, Padovan M, Baricordi O, Fotinidi M, Govoni M, Trotta F. The c. 1298A> C polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene is associated with rheumatoid arthritis susceptibility in Italian patients. Clin Exp Rheumatol. 2008;26:163. relataram uma associação entre o genótipo CC do MTHFR A1298 C, mas não de alguma das formas polimórficas do MTHFR C677 T com a suscetibilidade à AR na população italiana. Essa heterogeneidade de resultados pode ser atribuída às variações étnicas nas frequências alélicas e genotípicas, conforme relatado por Hughes et al.;3232 Hughes LB, Beasley TM, Patel H, Tiwari HK, Morgan SL, Baggott JE, et al. Racial or ethnic differences in allele frequencies of single-nucleotide polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and their influence on response to methotrexate in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2006;65:1213-8. esses autores encontraram um aumento significativo no alelo T do MTHFR C677 T e no alelo C do MTHFR A1298 C (independentemente do status de doença) em brancos quando comparados com negros americanos. Além disso, foi descrita uma interação significativa entre os polimorfismos MTHFR e fatores nutricionais/ambientais (ou seja, níveis de folato, idade, tabagismo e ingestão de álcool).44 De Mattia E, Toffoli G. C677T and A1298C MTHFR polymorphisms, a challenge for antifolate and fluoropyrimidine-based therapy personalisation. Eur J Cancer. 2009;45:1333-51. O fator de crescimento transformador β1 (TGF-β1) é uma citocina anti-inflamatória associada à remissão da doença; além disso, tem o potencial de ser uma citocina pró-inflamatória. Relatou-se que polimorfismos do TGF-β1 estão associados a variações nos níveis séricos de TGF-β1 e a diversas doenças.3434 Alayli G, Kara N, Tander B, Canturk F, Gunes S, Bagci H. Association of transforming growth factor beta1 gene polymorphism with rheumatoid arthritis in a Turkish population. Joint Bone Spine. 2009;76:20-3. Neste estudo, os genótipos do TGF-β1 (T869 C) não estiveram associados à AR. No entanto, o genótipo CT esteve associado a um aumento significativo no TNF sérico quando comparado com o genótipo TT. Isso vem associado aos resultados de dois estudos de metanálise feitos por Zhang et al.3535 Zhang L, Yan J-W, Wang Y-X, Wan Y-N, Li J-P, Liu P, et al. Association of TGF-β1+ 869C/T promoter polymorphism with susceptibility to autoimmune diseases: a meta-analysis. Mol Biol Rep. 2013;40:4811-7. e Chang et al.,3636 Chang W-W, Su H, He L, Zhao K-F, Wu J-L, Xu Z-W. Association between transforming growth factor-β1 T869C polymorphism and rheumatoid arthritis: a meta-analysis. Rheumatology. 2010;49:652-6. que não mostraram associação clara do polimorfismo T869 C e alelo T do TGF-β1 com a AR em uma população mundial; contudo, foi sugerida associação apenas nas pessoas de ascendência asiática. Os resultados de Hussein et al.3737 Hussein YM, Mohamed RH, El-Shahawy EE, Alzahrani SS. Interaction between TGF-β1 (869C/T) polymorphism and biochemical risk factor for prediction of disease progression in rheumatoid arthritis. Gene. 2014;536:393-7. foram diferentes; eles encontraram associação do alelo T do TGF-β1 com a susceptibilidade à AR em pacientes egípcios. Os resultados do presente estudo também mostraram associação do alelo G e do genótipo GG do LT-α A252G com a AR e níveis séricos mais elevados de TNF-α. Esses resultados concordam com os achados de Karray et al.3838 Karray EF, Bendhifallah I, Benabdelghani K, Hamzaoui K, Zakraoui L. Tumor necrosis factor gene polymorphisms and susceptibility to rheumatoid arthritis in regional Tunisian population. J Infect Dis Immun. 2011;3:30-5. e Al-Rayes et al.,3939 Al-Rayes H, Al-Swailem R, Albelawi M, Arfin M, Al-Asmari A, Tariq M. TNF-alpha and TNF-beta gene polymorphism in Saudi rheumatoid arthritis patients. Clin Med Insights Arthritis Musculoskelet Disord. 2011;4:55-63. que relataram associação entre os genótipos GG e AA com a AR, enquanto o genótipo GA foi refratário.

Do exposto, pode-se concluir que o genótipo CT do MTHFR C677 T, o genótipo AC do MTHFR A1298 C e o genótipo GG do LT-α A252G estão associados a um risco aumentado de AR em pacientes egípcios.

Que se tem conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliar, simultaneamente, a associação entre os polimorfismos MTHFR C677 T e A1298 C, TGF-β1 T869 C e LT-α A252G com a AR e com as citocinas pró-inflamatórias TNF, BAFF e OPN em pacientes egípcios.

Este estudo apresenta algumas limitações, como a inclusão de um grupo muito amplo de pacientes quanto à duração da doença, atividade da doença e fármacos usados pelos pacientes, além de não fazer qualquer menção à positividade do fator reumatoide e anti-CCP. Os níveis de citocinas podem variar amplamente com esses fatores e também com outros detalhes metodológicos, como o tempo entre a amostra ser coletada e processada, a pontuação no DAS-28, os fármacos usados e suas doses quando as amostras são coletadas.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Sep-Oct 2016

Histórico

  • Recebido
    17 Out 2015
  • Aceito
    16 Mar 2016
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