Estudo da morfologia renal após a oclusão da aorta abdominal infra-renal em ratos

Study of renal morphology after infrarenal aortic cross-clamping in rats

ARTIGO ORIGINAL

Estudo da morfologia renal após a oclusão da aorta abdominal infra-renal em ratos

Study of renal morphology after infrarenal aortic cross-clamping in rats

Eliane Alencar do Nascimento Feitosa, TCB- RJ^I; Murched Omar Taha, TCBC-SP^II; Djalma José Fagundes, TCBC- SP^III; Cristina Maeda Takiya^IV; Lúcio Ronaldo Cardoso^V; Doris Moura Campos^VI

^IPós-graduanda do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação da UNIFESP-EPM

^IIProfessor Afiliado do Departamento de Cirurgia da UNIFESP-EPM

^IIIProfessor Adjunto do Departamento de Cirurgia-coordenador do PPG-CeEX da UNIFESP-EPM

^IVProfessora Adjunta do Departamento de Histologia e Embriologia da UFRJ

^VProfessor Adjunto da Disciplina de Nefrologia da UFRJ

^VIAluna bolsista de Iniciação Científica PIBIC-CNPq

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Relacionar as alterações morfológicas renais sob microscopia de luz, de ratos submetidos à oclusão de aorta, em modelo que simule a condição clínica de reparação cirúrgica de um aneurisma de aorta abdominal.

MÉTODO: Ratos Wistar (N = 60), machos pesando entre 200 e 250g, foram distribuídos em três grupos: I (simulado); II (isquemia); III (isquemia + reperfusão); e cada grupo redistribuído em dois subgrupos: A (30 min); B (60 min). Foi realizada isquemia utilizando clamp vascular (8mm) na aorta abdominal infra-renal de acordo com o grupo estudado. Ao final de cada experimento os animais foram mortos e realizada análise histológica renal cortical e medular (descritiva e morfométrica) através de metodologia convencional (parafina-hematoxilinaeosina). A análise semiquantitativa de lesão tubular e intersticial foi realizada de acordo com o índice de lesão tubular e índice de lesão intersticial. Para a análise estatística foram aplicados os seguintes testes: Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Comparações múltiplas (p < 0,001).

RESULTADOS: Observou-se no grupo III alterações histológicas tubulares e intersticiais significantes com relação aos outros grupos (p < 0,001).

CONCLUSÕES: A oclusão da aorta abdominal infra-renal em ratos está associada a lesões estruturais renais tanto tubulares quanto intersticiais principalmente na fase de reperfusão.

Descritores: Morfologia: Rim: Aorta abdominal: Ratos, Wistar.

ABSTRACT

BACKGROUND: The aim of this study was to investigate the influence of infrarenal corss-clamping in the renal tissue.

METHODS: Groups of male Wistar rats (N = 60) were subjected or not to infrarenal aortic cross-clamping following or not by reperfusion according to each group: IA (sham-30 min-n = 10); IB (sham-60min-n = 10); IIA (30min of ischaemia-n = 10); IIB (60min of ischaemia-n =10); IIIA (30min of ischaemia + 30min of reperfusion-n = 10); IIIB (60min of ischaemia + 60min of reperfusionn = 10). All animals were submitted to nephrectomy. The histological analyses (descriptive and morphometry) were accomplished through conventional methodology (paraffin embedding and hematoxilylin and eosin staining). Semiquantitative analyses of tubular damage (modified structure) and intersticial edema were carried out according to an index of intensity of injury. Data was validated by applying statistical tests: Mann-Whitney, Kruskal-Wallis, Multiple Comparisons. Significance was accepted at p < 0.001.

RESULTS: Occurrence of signicant tubular and intersticial damages in group III was observed.

CONCLUSION: Occlusion of the infrarenal aorta in rats can lead to renal morphological effects, especially in reperfusion phase.

Key words: Morphology; Kidney; Aorta abdominal; Rats, Wistar.

INTRODUÇÃO

Desde a primeira operação realizada com sucesso para a ressecção de aneurisma da aorta abdominal infra-renal feita por Dubost em 1951, tem sido verificada a associação subseqüente de insuficiência renal, que é uma causa importante de morbidade e mortalidade no pós-operatório ^1-4. Sua instalação é multifatorial tendo sido verificado que o clampeamento da aorta infra-renal parece ser um dos fatores mais importantes na patogênese da disfunção renal ^5-7. Esta varia de 1 a 65% em diferentes estudos ^8-10. A insuficiência renal tem como substrato anatômico a necrose tubular aguda, com manifestações clínicas e laboratoriais muito semelhantes em seres humanos e animais de experimentação como o rato^{8, 11}.

O desenvolvimento e a progressão da insuficiência renal aguda se devem à perda da função das células epiteliais tubulares devido a um processo de deleção ou morte. A disfunção renal ocorre, na grande maioria das vezes, após períodos de isquemia/reperfusão renal^12-16.

Além disso, é bem conhecido o fato de que na lesão isquêmica e na isquemia/reperfusão ocorre também necrose tubular e células em apoptose, que podem ser vistas ao longo dos segmentos do néfron, e contribuem para o estabelecimento da insuficiência renal^17-21.

Independente da via das lesões nefron-tubulares, é importante estabelecer uma relação temporal entre a oclusão da artéria aorta infra-renal e o aparecimento de lesões renais.

A proposta desta pesquisa foi relacionar as alterações morfológicas sob microscopia de luz com o grupo de oclusão de aorta, num modelo em ratos que simule a condição clínica de reparação cirúrgica de um aneurisma da aorta abdominal.

MÉTODO

O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP-EPM (Protocolo no. 836/01) e ratificado pela Comissão de Ética da Universidade Iguaçu (UNIG).

Foram utilizados 60 ratos (Rattus norvegicus albinus), machos, com peso médio de 220 gramas. Os animais foram mantidos no Biotério da Universidade Iguaçu (UNIG) por quinze dias, para observação e adaptação.

Os procedimentos operatórios foram realizados no Laboratório do Biotério da Universidade Iguaçu e no Laboratório da Disciplina de Histologia e Embriologia-UFRJ. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em três grupos: I = simulado; II = isquemia; III = isquemia + reperfusão. Os animais foram redistribuídos aleatoriamente (n = 10) nos seguintes subgrupos: IA = simulado de 30 minutos; IB = simulado de 60 minutos; IIA = isquemia de 30 minutos; IIB = isquemia de 60 minutos; IIIA = isquemia de 30 minutos + reperfusão de 30 minutos; IIIB = isquemia de 60 minutos + reperfusão de 60 minutos.

Os animais foram anestesiados com inalação de éter dietílico. Iniciou-se o ato operatório somente após ter sido constatada a perda dos reflexos de endireitamento, de retirada do membro pélvico ao estímulo doloroso provocados por preensão e do reflexo palpebral. Foi realizada laparotomia mediana de aproximadamente quatro centímetros com bisturi lâmina 15, com subseqüente afastamento das alças intestinais para a direita. A dissecção da aorta abdominal infra-renal foi realizada por meio de gazes, cotonetes e pinças hemostáticas apropriadas.

Em seguida foi realizada heparinização sistêmica na dose de 10 a 15 U/100g/peso, por punção da veia cava utilizando-se seringa de 1 ml acoplada à agulha 13 x 3 (30G 1/2). Após três minutos a aorta abdominal infra-renal foi ocluída através de clampe vascular 8 mm. Ao término do tempo de oclusão da aorta infra-renal de cada animal foi realizada nefrectomia bilateral, e os animais mortos por exsangüinação.

O estudo histológico compreendeu uma análise descritiva e uma semi-quantitativa. O estudo descritivo compreendeu uma análise do compartimento glomerular e do compartimento túbulo-intersticial renal. Neste último foi analisado em separado o compartimento intersticial onde os seguintes parâmetros foram determinados: edema intersticial, congestão capilar, hemorragia intersticial e inflamação e, no compartimento tubular, o grau de vacuolização, descamação celular e alteração nuclear.

A avaliação semiquantitativa de cada parâmetro foi feita às cegas. As imagens foram capturadas por câmara digital (Coolpix 550, Nikon, Japan) acoplada a microscópio de luz (Eclipse400, Nikon, Japan) utilizando a lente objetiva de X40. Os cortes histológicos receberam coloração pela HE sendo analisados 10 campos corticais e cinco campos medulares por animal.

As imagens foram avaliadas por um observador e a quantificação foi feita segundo uma escala de zero a três cruzes, correspondendo à alteração ausente, leve, moderada e intensa, respectivamente.

Os resultados foram expressos como índice de lesão intersticial e índice de lesão tubular, correspondendo ao somatório de pontos conferidos para cada parâmetro correspondente, segundo metodologia descrita por Takito ²²:

- índice de lesão intersticial: valor máximo = 12

- índice de lesão tubular: valor máximo = 9

A análise estatística dos resultados obtidos foi realizada pela Disciplina de bioestatística do Departamento de Medicina Preventiva da UNIFESP-EPM.

Para a análise estatística, de acordo com a natureza das variáveis estudadas, foram aplicados os seguintes testes: teste de Mann-Whitney; análise de variância por posto de Kruskal-Wallis; em todos os testes fixou-se em 0,001 o nível de rejeição da hipótese de nulidade, assinalando-se com um asterisco (*) os valores significantes²³.

RESULTADOS

O corte de rins dos animais do grupo IA apresentavam histologia preservada semelhante ao normal, aspecto visto tanto nas colorações pela HE e PAS. Nos animais do grupo IB foi verificado haver uma pequena alteração do contorno apical de células tubulares na HE assim como diminuto alargamento do interstício renal por edema.

Na coloração pelo PAS não foi verificada alteração grosseira em borda estriada dos túbulos. Nos animais dos grupos IIA e B assim como nos dos grupos IIA e IIIB foram verificadas intensificação das lesões tubulares, irregularidade na borda apical chegando à perda focal do citoplasma apical nos grupos III (A e B) e perda focal da afinidade tintorial pelo PAS indicativo de alteração/perda da borda estriada além de progressão do edema intersticial.

Congestão capilar discreta foi verificada no interstício e glomérulos evidenciada nos grupos IIIA e B (Figuras 1, 2, 3 e 4). Células inflamatórias não foram vistas nos grupos I, II e IIIA. No grupo IIIB foi verificada a presença de células inflamatórias, leucócitos polimorfonucleares ou células mononucleares no interstício (uma célula inflamatória em raros campos) sendo mais comum a presença destas células nos capilares sangüíneos intersticiais. Hemorragia intersticial não foi verificada nos cortes histológicos dos grupos.

A análise descritiva das lesões renais se correlacionou com os achados histomorfométricos como pode ser visto no Gráfico 1.

A análise estatística dos dados histomorfométricos demonstrou haver alteração tubular e intersticial significante entre os animais dos grupos IIIB em comparação com os outros grupos estudados. Também foi verificado haver diferença significativa entre os animais isquêmicos e reperfundidos com o tempo.

DISCUSSÃO

Este trabalho confirmou a presença de alterações histológicas tubulares após lesão por isquemia e isquemia/ reperfusão em ratos submetidos à clampeamento infra-renal da aorta e sacrificados imediatamente após a oclusão, tanto após 30 quanto 60 minutos de isquemia, com e sem reperfusão.

É bem conhecido o fato de que alterações morfológicas compatíveis com necrose isquêmica de células tubulares renais são verificadas após pelo menos 30 minutos de isquemia e com mais de uma hora de reperfusão ^24-27. As modificações, reflexo da irreversibilidade da injúria, consistem na presença de alterações nucleares como picnose, cariólise ou cariorréxis associada com a homogeneidade e acidofilia citoplasmática ¹⁸. É bem conhecido o fato que muitas vezes as células agredidas ainda conseguem sobreviver apresentando somente alterações subletais que consistem em degeneração hidrópica ou vacuolar com modificações metabólicas discretas, mas ainda compatíveis com a sobrevivência celular.

Entretanto, com o aporte de oxigênio, quando do restabelecimento do fluxo sanguíneo, as lesões se exacerbam pelo fato dessas células já estarem metabolicamente comprometidas não tendo, portanto, a capacidade de exercer suas funções no sentido de manter o equilíbrio iônico e suas defesas antioxidantes ^18,19. Associado à morte celular por necrose, genes reguladores da apoptose também são ativados culminando com a perda maior de células ao longo dos segmentos dos nefrons o que contribue para o estabelecimento da insuficiência renal ^20,21.

Nosso protocolo experimental, empregando animais mortos logo após a isquemia ou logo após a liberação do clampe, permitiu a demonstração de que com 30 minutos de isquemia já há alterações tubulares que são agravadas com 30 minutos de reperfusão. Existem trabalhos anteriores confirmando que a presença de necrose tubular aguda morfológica é verificada após dois dias de reperfusão ²⁸.

Foram verificadas, porém, modificações da borda estriada tubular, associada à ruptura da integridade celular e à obstrução tubular em estudos realizados após 30 minutos de isquemia e duas horas de reperfusão ²⁹ ou após uma hora de isquemia com uma a três horas de reperfusão ⁸. Os achados são semelhantes aos encontrados em nosso experimento após uma hora de isquemia e reperfusão. Em estudo semelhante ao nosso, porém com exploração ultra-estrutural, Arendshorst et al ⁸ comprovaram que após uma a três horas de isquemia houve o aparecimento de modificações subletais (tumefação mitocondrial de baixa amplitude – condensação da matrix e dilatação das cristas) em túbulos, o que corrobora os nossos achados.

Sabe-se que os tecidos fixados por imersão podem apresentar artefatos que são facilmente confundidos com alterações patológicas. Estudo realizado considerando a reação das células renais durante autólise in vitro evidenciou que, mesmo em tecidos fixados imediatamente após a retirada do organismo há alterações mais proeminentes em túbulos proximais. A maioria dos túbulos se apresenta com a luz não aparente devido à tumefação celular, havendo também alguma perda da afinidade tintorial nuclear ³⁰.

Não utilizamos uma fixação por perfusão devido ao fato de que esta ao ser realizada com animais ainda vivos poderia alterar o tempo de reperfusão ou provocar reperfusão nos animais submetidos somente a isquemia o que alteraria o protocolo do nosso experimento. Igualmente, em nosso material levamos em consideração a presença destes artefatos.

As modificações consideradas foram comparativas em relação aos animais do grupo simulado. Por este motivo optamos por utilizar uma análise semiquantitativa de imagens digitalizadas para diminuir a margem de erro. O achado de modificações no compartimento tubular no grupo IB apesar de ser um controle pode ter sido provocado pelo maior tempo de exposição do rim.

Concluindo, a oclusão da aorta abdominal infra-renal em ratos está associada a modificações morfológicas renais principalmente na fase de reperfusão.

Recebido em 20/12/2004

Aceito para publicação em 14/06/2005

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

Trabalho realizado no Programa de Pós-Graduação em Cirurgia e Experimentação - UNIFESP-EPM, no Departamento de Histologia e Embriologia - UFRJ; Laboratório do Biotério da Universidade Iguaçu - UNIG.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Nov 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Aceito
  14 Jun 2005
• Recebido
  20 Dez 2004