Produção de biossurfactante por Lysinibacillus sp. e Bacillus sp. a partir de diferentes óleos como fonte de carbono

Production of biosurfactant by Lysinibacillus sp. and Bacillus sp. from different oils as carbon source

RESUMO

Biossurfactantes são moléculas multifuncionais produzidas por microrganismos e podem apresentar vantagens em relação aos surfactantes sintéticos, como baixa toxicidade, alta biodegradabilidade, maior redução da tensão superficial e alta diversidade química. No entanto, a produção em escala comercial ainda é escassa devido ao elevado custo dos substratos utilizados. Portanto, no presente trabalho foi avaliada a produção de biossurfactantes utilizando diferentes óleos como fonte de carbono, como óleo de soja, óleo de fritura, óleo diesel, óleo lubrificante novo e usado, a partir de dois gêneros de bactérias isoladas de lodo indústria de cosméticos e solo contaminado com óleo diesel, Lysinibacillus sp. e Bacillus sp. respectivamente. Estas foram identificadas por sequenciamento do fragmento do gene RNAr 16S e mantidas sob refrigeração a 4 ºC em tubos de ensaio, com ágar triptona de soja. Os ensaios de produção foram realizados sob agitação de 200 rpm a 30 °C com duração de 7 dias. A produção de biossurfactante foi analisada pela atividade emulsificante, índice emulsificação e por colapso da gota. As bactérias utilizadas produziram biossurfactante em todos os tipos de óleos testados. O óleo de soja mostrou-se o melhor substrato para produção de biossurfactante a partir do Lysinibacillus sp. e Bacillus sp. com índice de emulsificação de 50 % e 46,63 %, respectivamente.

Palavras-chave
emulsificantes; bactérias; fontes alternativas; fermentação

ABSTRACT

Biosurfactants are multifunctional molecules produced by microorganisms and havea some advantages compared to synthetic surfactants, such as low toxicity, high biodegradability ,improved tensoactivity and chemical diversity. However, commercial scale production is not viable due to the high cost of the substrates used. Therefore, in the present work we evaluated the production of biosurfactants using different oils as carbon source, such as soybean oil, frying oil, diesel oil, new and used lubricating oil, from two genera of bacteria isolated from sludge cosmetics industry and soil contaminated with diesel oil, Lysinibacillus sp. and Bacillus sp. respectively. These were identified by sequencing the 16S rRNA gene fragment and kept under refrigeration at 4 ° C in test tubes with tryptone soy agar. The production was carried out under agitation at 200 rpm at 30 °C for 7 days. The biosurfactant production was analyzed by emulsifying activity, emulsification index and drop collapse. The bacteria used produced biosurfactant in all types of oils tested. Soybean oil was the best substrate for the production of biosurfactant from Lysinibacillus sp. and Bacillus sp. with an emulsification index of 50% and 46.63%, respectively.

Keywords
Emulsifiers; bacterium; alternative sources; fermentation

1. INTRODUÇÃO

Biossurfactantes ou biotensoativos são surfactantes de origem microbiana, produzidos por bactérias, leveduras e fungos [¹, ²]. São compostos anfipáticos, contendo grupos hidrofóbicos (apolares) e hidrofílicos (polares) [³], que reduzem a tensão superficial ou interfacial entre duas fases líquidas [⁴, ⁵]. Essas moléculas orgânicas complexas podem apresentar propriedades, composição química e tamanhos moleculares diversos [⁶], sendo assim, classificados com base na estrutura da biomolécula e espécie produtora [¹, ⁷].

O gênero Bacillus é um dos mais estudados para produção de lipopeptídios [³, ⁸]. As espécies pertencentes a esse gênero produzem diferentes tipos desse biossurfactante como bacilomicinas [⁹], micosubtilionas [¹⁰], fengicinas [¹¹], iturinas e surfactina [¹²], sendo este último, considerado como um dos mais interessantespotentes biossurfactantes, pois apresentam citotoxicidade contra vários tipos de câncer, inibindo o crescimento celular, o ciclo celular, apoptose e interrupçãoparada da metástase, assim evitando a progressão da doença [¹³]. Além disso, a surfactina pode ser usada como agente de controle biológico de patógenos, devido as suas propriedades antibacterianas e antivirais [¹⁴].

Espécies do gênero Lysinibacillus também apresentam potencial para ade produção de lipopeptídios, como o Lysinibacillus chungkukjangi, a qual produz lipopetídeos que tiveram suas propriedades recentemente descobertas, com possibilidade de aplicação desse biossurfactante em vários ramos da indústria tais como: alimentício, farmacêutico e recuperação de petróleo [¹⁵].

A maioria dos surfactantes utilizados atualmente, provêm da indústria petroquímica, entretanto com os recorrentes problemas ambientais [¹⁶], a demanda por surfactantes biológicos tem aumentado. O uso de biossurfactantes como alternativas aos surfactantes sintéticos foi impulsionada pelo rápido progresso da biotecnologia [¹⁷, ¹⁸] e também por serem compostos naturais que oferecem uma série de vantagens sobre os surfactantes sintéticos [⁵, ¹⁹], como o potencial de biodegradabilidade, baixa toxicidade, solubilização de hidrocarbonetos, estabilidade térmica [²⁰], ação antimicrobiana [⁷], antibacteriana [²¹], antifúngica [²²], antiviral [¹⁴] podendo ser sintetizados a partir de matérias-primas de baixo custo, gerando uma economia em torno de 50% na produção final de biossurfactantes [⁵].

As propriedades e características dos biossurfactantes fazem com que este seja considerado uma molécula versátil podendo ser aplicado na indústria agrícola, cosmética e de detergentes [²³], na biorremediação e biodegradação, entre muitas outras [¹⁹, ²⁴]. Porém o alto custo para sua obtenção impede sua viabilidade para produção e aplicação em larga escala. Como estratégia para a redução dos custos da produção de biossurfactante, os subprodutos e os resíduos da agroindústria têm sido avaliados commo fontes de carbono alternativas [⁵], favorecendo, também, a minimização do impacto ambiental causado pelo descarte inadequado desses resíduos jeitos no ambiente [²⁵].

Assim, com o intuito de prospectar a produção de biossurfactante com baixo custo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as bactérias Lysinibacillus sp. e Bacillus sp. utilizando óleo de soja, óleo de fritura, óleo diesel, óleo lubrificante novo e usado como fontes de carbono para produção de biossurfactante.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

A metodologia foi desenvolvida de acordo com o fluxograma operacional , representado na Figura 1.

Figura 1
Fluxograma operacional.

2.1 Microrganismos

Os microrganismos utilizados foram: Lysinibacillus sp., isolado de amostras de lodo do reservatório de uma indústria de insumos cosméticos, situada na cidade de Sorocaba e Bacillus sp. isolado de solo contaminado com óleo diesel, obtido na cidade de Tatuí, ambas as cidades estão situadas em São Paulo, Brasil. As bactérias foram avaliadas por testes de beta hemólise e o resultado foi positivo para produção de biossurfactantes.

A identificação foi realizada por sequenciamento do fragmento do gene RNAr 16S. A metodologia consistiu na extração do DNA genômico diretamente das culturas, segundo protocolo descrito por VAN SOOLINGER et al. [²⁶]. Os oligonucleotídeos sintéticos utilizados para a reação de PCR foram p10f e p1100r, homólogos às extremidades conservadas do gene RNAr 16S de bactérias. Os produtos das amplificações foram purificados e submetidos diretamente ao sequenciamento usando o sequenciador automático ABI3500XL Series (Applied Biosystems). Os primers utilizados para o sequenciamento foram p10f e p1100r.

As sequências ob tidas foram comparadas com as bases de dados do Genbank e do RDP.

2.2 Produção do inóculo

A padronização do inóculo para os ensaios de produção de biossurfactantes foi realizada em solução salina (0,9%) e a absorbância foi verificada em espectrofotômetro através da turbidez observada em um comprimento de onda de 550 nm, que correspondeu a 1,5 x 10⁸ UFC/mL [²⁷].

2.3 Produção de biossurfactante

O meio de produção de biossurfactante (controle) foi composto por (em g/L): extrato de levedura (0,2), peptona (1), glicose (5), NaNO₃ (5), K₂HPO₄ (1), MgSO₄ (0,5), FeSO₄.7H₂O (0,01), KCl (0,03), CaCl₂ (0,02), KH₂PO₄ (0,8) e 1 % de óleo. Os óleos testados como fonte de carbono foram: óleo de soja, óleo de fritura, óleo diesel, óleo lubrificante de motor novo e óleo lubrificante de motor usado. O meio foi esterilizado em autoclave a 121 ºC por 15 min.

A fermentação foi realizada em frascos reagente de 250 mL contendo 49,0 mL do meio de cultura e 1 mL do inóculo. Após a inoculação, os frascos foram incubados a 30 ºC e a 200 rpm, durante 7 dias [²⁸].

2.4 MÉTODOS ANALÍTICOS

2.4.1 Determinação da presença de biossurfactante

Amostras do meio de cultura fermentado foram centrifugadas a 4000 rpm por 20 min ae 20 ºC, para remoção das células bacterianas. O sobrenadante foi submetido às análises de atividade emulsificante, índice de emulsificação e teste de colapso de gota.

2.4.2 Atividade emulsificante e Índice de emulsificação (%)

A atividade emulsificante foi determinada a partir de 3,5 mL do sobrenadante com adição de 2 mL de tolueno e, após agitação em vortex, foi realizada a leitura da densidade óptica em espectrofotômetro a 540 nm [²⁹].

A determinação do índice de emulsificação foi realizada a partir da mesma mistura de sobrenadante e tolueno, mantida em repouso por 24 h conforme o método descrito por BICCA et al. [³⁰].

Amostragens do sobrenadante fo­ram realizadas no tempo inicial e após 24 h para identificar a estabilidade da emulsão. O índice de emulsificação (E₂₄) foi calculado de acordo com a Equação 1.

Onde: I % = índice de emulsão (%); A_emulsão = altura da camada emulsão (cm); A_total = altura total (cm).

$$\mathrm{I}\%=\frac{A_{\mathit{e}\mathit{m}\mathit{u}\mathit{l}\mathit{s}\mathit{ã}\mathit{o}}}{A_{\mathit{t}\mathit{o}\mathit{t}\mathit{a}\mathit{l}}}\times 100$$ (1)

2.4.3 Colapso da gota

Para determinar o colapso de gota utilizou-se microplacas de 96 poços rasos, untados com 2 µL de óleo de motor 10 W- 40, mantidasdeixadas em repouso por 24 h. Após o repouso 5 µL do sobrenadante foram transferidos para cada um dos poços e o espalhamento das gotas foi avaliado após 2 min. O resultado foi considerado positivo quando visualmente se inferiu o espalhamento da gota [³¹].

2.4.4 Biomassa Seca

AoNo final dos ensaios de produção, foram centrifugados 15 mL da cultura (4000 rpm, 20 min a 20º C), o precipitado formado foi retirado e colocado em placas de Petri (previamente pesadas) e levadas a estufa a 105º C e pesadas após 24 h ou até peso constante.

2.4.5 Determinação do pH

Determinação do pH foi realizada no início e no final da fermentação, através de leitura direta em phmetro digitalpotenciômetro.

3. RESULTADOS

O maior índice de emulsificação foi o obtido com o óleo de soja commo fonte de carbono, enquanto que com o óleo lubrificante usado foi observado o menor índice (Figura 2), com os demais substratos o índice de emulsificação para o Bacillus sp. variou entre 44 a 46 %, e de 30 a 50 % para o Lysinibacillus sp.

Figura 2
Índices de emulsificação (%) obtidos com as diferentes fontes de carbono.

A quantificação de biomassa seca bacteriana proveniente das cepas Bacillus sp. e Lysinibacillus sp. Esta ão apresentada os na Tabela 1. Verificou-se que o caldo proveniente da fermentação com Lysinibacillus sp. e o óleo de soja como fonte de carbono, apresentou biomassa seca de 1,4 mg/L e índice de emulsificação em 50%, em cultivo com óleo lubrificante usado foi de 330,0 mg/L e o índice de emulsificação de 30%. Para o Bacillus sp. a biomassa seca foi de 70,0 mg/L proveniente de óleo de soja e de 50,0 mg/L para óleo lubrificante usado com índices de emulsificação em torno de 40 %.

Tabela 1
Biomassa seca (mg/L) do precipitado das bactérias Bacillus sp. e Lysinibacillus sp. nas diferentes fontes de carbono.

MICRORGANISMO	ÓLEO DE SOJA	ÓLEO DE FRITURA	ÓLEO DIESEL	ÓLEO LUBRIFICANTE NOVO	ÓLEO LUBRIFICANTE USADO
Bacillus sp.	1,6	130,0	70,0	310,0	50,0
Lysinibacillus sp.	1,4	200,0	70,0	120,0	330,0

A atividade emulsificante do Bacillus sp e Lysinibacillus sp. estaão arepresentadas na Tabela 2,onde observou-se que o máximo de atividade foi de 1,03 por Bacillus sp. e 0,761 com Lysinibacillus sp. Para ambos os gêneros a fermentação com óleo lubrificante novo apresentaram as menores atividades emulsificantes (0,057 e 0,104).

Tabela 2
Atividade emulsificante (%) do sobrenadante livre de células

MICRORGANISMO	ÓLEO DE SOJA	ÓLEO DE FRITURA	ÓLEO DIESEL	ÓLEO LUBRIFICANTE NOVO	ÓLEO LUBRIFICANTE USADO
Bacillus sp.	0,37	0,37	1,03	0,057	0,221
Lysinibacillus sp.	0,761	0,243	0,741	0,104	0,146

Na análise conjunta dos dados verificou-se que o óleo de soja, seguido de óleo de fritura foram as melhores fontes de carbono para produção de biossurfactante utilizando a cepa de Lysinibacillus sp.

O biossurfactante produzido por Bacillus sp. e Lysinibacillus sp. em todos os óleos testaramados foram positivo s para o colapso de gota e, a partir do resultado dessa análise qualitativa inferiu-se a propriedade tensoativaque o biossurfactante produzido tem potencial para reduzir a tensão superficial entre líquidos.

A determinação do pH foi realizada em duplicata após cada período de fermentação. Nos valores do pH do sobrenadante proveniente da fermentação dos meios de cultura em diferentes fontes de carbono, verificou-se que houve variação do pH para os cinco substratos (Tabela 3).

Tabela 3
Medidas de pH ao final das fermentações de Bacillus sp. e Lysinibacillus sp. em cada fonte de carbono.

MICRORGANISMO	ÓLEO DE SOJA	ÓLEO DE FRITURA	ÓLEO DIESEL	ÓLEO LUBRIFICANTE NOVO	ÓLEO LUBRIFICANTE USADO
Bacillus sp.	7,4	6,7	8,2	7,9	7,5
Lysinibacillus sp.	6,0	5,6	6,1	7,9	7,9

O menor pH foi observado no ensaio com óleo de fritura. O pH das fermentações utilizando óleo de soja como fonte de carbono, que apresentou melhor atividade emulsificante, variou entre as espécies estudadas. O pH da fermentação com óleo diesel mostrou uma leve alcalinização e o pH do óleo de fritura apresentou uma leve acidez em relação as demais fontes de carbono.

4. DISCUSSÃO

Os diferentes óleos avaliados neste trabalho podem ser usados como substratos para a produção de biossurfactante por Lysinibacillus sp. e Bacillus sp. e consequentemente reduzir os custos da produção. De acordo com a literatura, isolados que apresentam índice de emulsificação a partir de 40% são promissores para produção de biossurfactantes, pois a propriedade de interesse do biossurfactante é sua capacidade de emulsionar líquidos não miscíveis e formar as emulsões estáveis [³²].

Entre as cinco fontes de óleos testadas, para produção de biossurfactante pelos isolados de Lysinibacillus sp. e Bacillus sp. o óleo de soja destacou-se com o maior índice de emulsificação, provavelmente esse resultado foi devido a estruturas orgânicas simples tais como ácidos graxos, cuja cadeia contém 8 a 20 átomos de carbono, que são facilmente metabolizáveis [³³].

A produção de biossurfactante por Lysinibacillus sp. utilizando o óleo lubrificante usado apresentou o menor índice de emulsificação. Neste presente estudo não foi determinado a presença de metais neste óleo, entretanto, esse substrato normalmente apresenta concentração elevada de metais, que podem afetar os microrganismos [³⁴]. De acordo com SADLER e TRUDINGER [³⁵] dependendo da concentração de metais os microrganismos são afetados de diferentes formas: causando alterações morfológicas e bioquímicas, podendo inibir o crescimento microbiano ou até mesmo causar a morte microbiana. Embora a concentração de metais neste óleo seja superior ao encontrado no óleo lubrificante novo, este substrato é muito estudado como fonte de carbono para distintas espécies bacterianas [³⁶], pois apesaralém dos metais o óleo lubrificante usado apresenta em sua composição hidrocarbonetos [³²], o óleo diesel também apresenta hidrocarbonetos em sua composição, sendo bastante relatado para prospecção de biossurfactante [³⁷, ³⁸].

A presença de hidrocarbonetos nos substratos é importante, pois eles estão envolvidos na síntese dos grupos hidrofóbicos e hidrofílicos das moléculas de biossurfactante. DESAI e BANAT [³²] relataram que a síntese das porções hidrofóbicas e hidrofílicas, ocorre por duas vias metabólicas primárias usando, hidrocarbonetos e carboidratos, respectivamente. Diversos conjuntos específicos de enzimas reguladoras estão envolvidos na síntese das duas porções das moléculas de biossurfactante. Há diferentes possibilidades para a síntese das porções hidrofóbicas e hidrofílicas das moléculas biossurfactante e seu acoplamento: (1) as porções hidrofílicas e hidrofóbicas são sintetizadas por duas vias independentes; (2) a porção hidrofílica é sintetizada enquanto a síntese da porção hidrofóbica é induzida pelo substrato; (3) a porção hidrofóbica é sintetizada, enquanto a síntese da porção hidrofílica é dependente do substrato; e (4) a síntese de ambas as porções hidrofóbicas e hidrofílicas é dependente do substrato.

MNIF et al. [³⁹] verificaram a produção de biossurfactante para Lysinibacillus fusiformis utilizando como substrato o petróleo bruto a 1% e obtiveram um índice de emulsificação de 72%, e mostraram que essa bactéria pode ser utilizada para biorremediação em locais contaminados com hidrocarbonetos. SILVA et al. [⁴⁰] relataram que o biossurfactante produzido por Pseudomonas aeruginosa apresentou um valor de emulsão de 53,7% e 50,2% para o óleo diesel e óleo de motor, respectivamente.

A composição do óleo de cozinha é alterada depois do uso para fritura., Oo processo de fritura altera a concentração de ácidos graxos poliinsaturados, aumentando os ácidos graxos saturados e monoinsaturados [⁴¹], com isso este óleo pode conter 30% de compostos polares, entretanto este valor pode mudar dependendo da variedade de alimentos, do tipo de fritura e do número de vezes em que este foi utilizado [⁴²].

O índice de emulsificação para o óleo de fritura obtido a partir do Bacillus sp. no presente estudo foi semelhante ao mostrado por OLIVEIRA et al. [⁴³] que ao utilizarem o mesmo substrato como fonte de carbono para Bacillus pulimus, produziram biossurfactante e obtiveram um índice de emulsificação que variou de 45% a 50%. Os autores adicionaram ao meio de sais minerais diferentes concentrações do óleo de fritura (1% a 5%). Comumente as espécies pertencentes ao gênero Bacillus são bastantes estudadas e relatadas como produtoras de diferentes tipos biossurfactante, sendo a surfactina o principal lipopeptídio sintetizado [¹³].

É notório que existe uma grande variabilidade emcom relação ao índice de emulsificação, pois o tipo de biossurfactante produzido bem como as diferentes fontes de carbono testadas podem alterar a estrutura dos biossurfactantes e com isso influenciaremm nas propriedades emulsificantes [⁴⁴]. Além disso, a emulsão de diferentes hidrocarbonetos ocorre de distintas formas [⁴⁵]. Com base nesse contexto pode-se justificar o fato de uma mesma linhagem de Bacillus sp. ou Lysinibacillus sp. mostraram diferentes índices de emulsificação devido ao uso deem diferentes óleos como fonte de carbono.

A concentração do substrato ou a adição de suplementos ao meio podem influenciar na atividade emulsificante do biossurfactante, esse fato foi relatado por KIM et al. [⁴⁶] que mostraram que a atividade emulsificante do Emulsan pode ser modificada com a suplementação de ácidos graxos, atingindo uma maior atividade emulsificante (2,44 a 600 nm). O Emulsan é um biossurfactante polimérico e é sintetizado por Acinetobacter calcoaceticus, sendo reconhecido por sua capacidade em estabilizar emulsões do tipo óleo/água [⁴⁷]. KITAMOTO et al. [⁴⁸] utilizaram lipídios de monosileritritol produzido por Pseudozyma (Candida antarctica) a partir de óleos vegetais para produzir biossurfactante e obtiveram uma atividade emulsificante de 1,5 e 2,0 a 620 nm.

Embora a produção de biossurfactante seja comumente relatada como dependente do crescimento celular [⁴²], no presente estudo não houve essa relação, pois, alguns fatores como a concentração do substrato, pH e a composição do meio de cultivo podem interferir de forma a inibir ou aumentar a concentração do biossurfactante e o crescimento celular [⁴⁹].

A redução no pH foi observada em alguns substratos avaliados , e tal fato possivelmentedeve ter ocorreuido devido àa produção de metabólitos secundários pelas bactérias, que acidificam o meio durante o processo de fermentação [⁵⁰]. Além disso, Oo pH também pode ter influenciado na produção de biossurfactante, pois em pH ácido ou pH alcalino demais pode ocorrer um baixo nível de produção de biossurfactante [³⁶].

5. CONCLUSÕES

Os isolados Lysnibacillus sp. e Bacillus sp. foram capazes de produzir biossurfactantes a partir de diferentes óleos como fonte de carbono. O óleo de soja foi o substrato que apresentou os melhores resultados. O biossurfcatante produzido pode ser aplicado como agente emulsificante e surfactante. Este trabalho alinha-seintensifica ao esforço deà prospecção de diversos resíduos e/ou subprodutos a serem utilizados como fonte de carbono, de baixo custo, na produção de moléculas de interesse biotecnológico.

AGRADECIMENTOS

Ao programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Monitoramento Ambiental e ao Programa de Pós-Graduação em Planejamento e Uso de Recursos Renováveis (PPGPur) da UFSCar.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Dez 2020
• Data do Fascículo
  2020

Histórico

• Recebido
  06 Mar 2019
• Aceito
  26 Ago 2019