Padronização do diagnóstico de Blastocystis hominis por diferentes técnicas de coloração

Standardization of Blastocystis hominis diagnosis using different staining techniques

Resumos

INTRODUÇÃO: O presente trabalho foi realizado no período de março a maio de 2008, com o objetivo de avaliar a eficácia de diferentes técnicas para diagnóstico de Blastocystis hominis em uma amostra da população atendida pelo Laboratório de Biomedicina da Universidade Feevale, Novo Hamburgo/RS. MÉTODOS: Foram estudadas 100 amostras de fezes de crianças e adultos, que foram coletadas e submetidas às técnicas de sedimentação espontânea (HPJ), sedimentação em formol-éter (Ritchie) e de coloração por Gram e May-Grünwald-Giemsa (MGG). RESULTADOS: A presença de Blastocystis hominis foi observada em 40 amostras, quando utilizadas técnicas de coloração (MGG e Gram), enquanto que as técnicas de sedimentação se mostraram menos eficientes (32 amostras positivas para a técnica de Ritchie e 20 amostras positivas para a técnica de HPJ). CONCLUSÕES: Nossos resultados demonstram que o HPJ foi menos eficiente que outros métodos, indicando a necessidade de se incluir na rotina do laboratório técnicas que permitam a identificação deste parasita.

Blastocystis hominis; Parasitas intestinais; Diagnóstico; Técnicas de coloração


INTRODUCTION: The present study was carried out from March to May 2008, with the aim of evaluating the effectiveness of different techniques for diagnosing Blastocystis hominis in a sample of the population attended at the Biomedicine Laboratory of Feevale University, Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul. METHODS: On hundred feces samples from children and adults were evaluated. After collection, the samples were subjected to the techniques of spontaneous sedimentation (HPJ), sedimentation in formalin-ether (Ritchie) and staining by means of Gram and May-Grünwald-Giemsa (MGG). RESULTS: The presence of Blastocystis hominis was observed in 40 samples, when staining techniques were used (MGG and Gram), while sedimentation techniques were less efficient (32 positive samples using the Ritchie technique and 20 positive samples using the HPJ technique). CONCLUSIONS: Our results demonstrate that HPJ was less efficient than the other methods, thus indicating the need to include laboratory techniques that enable parasite identification on a routine basis.

Blastocystis hominis; Intestinal parasites; Diagnosis; Staining techniques


ARTIGO ARTICLE

Padronização do diagnóstico de Blastocystis hominis por diferentes técnicas de coloração

Standardization of Blastocystis hominis diagnosis using different staining techniques

Dayane EymaelI; Graziela Maria SchuhII; Rejane Giacomelli TavaresIII, IV

ILaboratório de Biomedicina, Setor de Parasitologia, Universidade Feevale, Novo Hamburgo, RS

IICurso de Biomedicina, Instituto de Ciências Biológicas, Centro Universitário Franciscano, Santa Maria, RS

IIICurso de Biomedicina, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale, Novo Hamburgo, RS

IVDepartamento de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS

Endereço para correspondência

RESUMO

INTRODUÇÃO: O presente trabalho foi realizado no período de março a maio de 2008, com o objetivo de avaliar a eficácia de diferentes técnicas para diagnóstico de Blastocystis hominis em uma amostra da população atendida pelo Laboratório de Biomedicina da Universidade Feevale, Novo Hamburgo/RS.

MÉTODOS: Foram estudadas 100 amostras de fezes de crianças e adultos, que foram coletadas e submetidas às técnicas de sedimentação espontânea (HPJ), sedimentação em formol-éter (Ritchie) e de coloração por Gram e May-Grünwald-Giemsa (MGG).

RESULTADOS: A presença de Blastocystis hominis foi observada em 40 amostras, quando utilizadas técnicas de coloração (MGG e Gram), enquanto que as técnicas de sedimentação se mostraram menos eficientes (32 amostras positivas para a técnica de Ritchie e 20 amostras positivas para a técnica de HPJ).

CONCLUSÕES: Nossos resultados demonstram que o HPJ foi menos eficiente que outros métodos, indicando a necessidade de se incluir na rotina do laboratório técnicas que permitam a identificação deste parasita.

Palavras-chaves:Blastocystis hominis. Parasitas intestinais. Diagnóstico. Técnicas de coloração.

ABSTRACT

INTRODUCTION: The present study was carried out from March to May 2008, with the aim of evaluating the effectiveness of different techniques for diagnosing Blastocystis hominis in a sample of the population attended at the Biomedicine Laboratory of Feevale University, Novo Hamburgo, Rio Grande do Sul.

METHODS: On hundred feces samples from children and adults were evaluated. After collection, the samples were subjected to the techniques of spontaneous sedimentation (HPJ), sedimentation in formalin-ether (Ritchie) and staining by means of Gram and May-Grünwald-Giemsa (MGG).

RESULTS: The presence of Blastocystis hominis was observed in 40 samples, when staining techniques were used (MGG and Gram), while sedimentation techniques were less efficient (32 positive samples using the Ritchie technique and 20 positive samples using the HPJ technique).

CONCLUSIONS: Our results demonstrate that HPJ was less efficient than the other methods, thus indicating the need to include laboratory techniques that enable parasite identification on a routine basis.

Key-words:Blastocystis hominis. Intestinal parasites. Diagnosis. Staining techniques.

INTRODUÇÃO

Blastocystis hominis é um protozoário intestinal anaeróbico encontrado em muitas espécies animais, inclusive humanos. Esse organismo unicelular foi descrito primeiramente como um fungo por Brumpt, em 1912, foi re-classificado e incluído entre os protozoários após os estudos de Zierdt & Tan, em 19761,2. Recentemente, Blastocystis hominis foi classificado como um membro da família Stramenopiles. Embora muito pouco se saiba sobre o significado desse parasita na saúde pública, ele é considerado o mais comum dos protozoários reportados em amostras fecais humanas, desenvolvendo infecções em mais de 50% dos portadores em países em desenvolvimento, e uma taxa um pouco menor nos países desenvolvidos3-7.

No Brasil, sua presença já foi relatada em diversos estudos, seja em portadores hígidos ou em imunodeprimidos1,7,8-11.

Em relação à sua classificação, estudos moleculares, utilizando reações de polimerização em cadeia (PCR), classificaram as diversas espécies de Blastocystis isoladas em aves e mamíferos em nove subtipos (1 a 9), de acordo com a análise das sequências de subunidades ribossomais pequenas (SSU rRNA)3,12.

Seu ciclo está compreendido basicamente pela contaminação fecal-oral. É um organismo polimórfico, com quatro formas principais descritas: vacuolar, granular, amebóide e cística, além das formas multivacuolar e avacuolar7,13,14. A forma vacuolar é a encontrada na maioria das vezes em fezes15. Esta se apresenta esférica, com vacúolo central, diâmetro de 6 a 15 micras e apresenta uma camada superficial de espessura variável6,13. Alguns estudos relatam a forma morfológica encontrada com a existência ou não de sintomatologia, sendo a forma vacuolar encontrada tanto em pacientes com sintomas, bem como naqueles com ausência de sintomas. Já as formas granulares, são mais relacionadas aos portadores assintomáticos, e a forma amebóide sempre é encontrada em pacientes sintomáticos13,15. Entretanto, essa forma é extremamente lábil e muito raramente pode ser observada nas fezes13.

Há controvérsias quanto à patogenicidade desse parasita. Alguns autores citam que em situações de alta carga parasitária de Blastocystis hominis e na ausência de outros parasitas, vírus ou bactérias, esse protozoário pode causar sintomas como diarréias, cólicas, náuseas, febres, vômitos e desconforto abdominal. Em pacientes imunodeprimidos, o quadro ainda torna-se mais intenso6,13,16. Outros autores afirmam que é preciso analisar muito bem os sintomas, pois são os mesmos de outras doenças, infecciosas ou não17.

Vários estudos indicam que os métodos de sedimentação espontânea ou de flutuação são ineficazes na busca de Blastocystis hominis nas fezes, pois o contato deste protozoário com água acarretaria a lise do mesmo, produzindo resultados falso-negativos9-11,17. Uma alternativa para melhorar o desempenho destas técnicas parece ser a conservação prévia das mesmas com formol ou outro tipo de conservante18.

Esta hipótese ainda é controversa, pois outro estudo demonstrou que não foi encontrada diferença nos resultados em amostras de fezes diluídas em água ou em solução fisiológica1. Estes métodos se baseiam na sedimentação das fezes, seja espontânea ou por centrifugação, onde o sedimento é avaliado através da coloração com lugol19.

Outros autores sugerem que, para obter uma identificação adequada deste parasita, sejam utilizadas técnicas de coloração, como a coloração por tricrômio, hematoxilina férrica, Giemsa, Gram ou Wright13.

O diagnóstico imunológico, através da detecção de antígenos fecais ou anticorpos ainda não se encontra disponível para aplicação clínica, muito embora já existam estudos nesse sentido. Da mesma forma, outros métodos como avaliação de fluídos obtidos por aspiração de secreções duodenais, endoscopia, sigmoidoscopia ou cultura de material fecal não são indicados, devido ao fato de serem extremamente invasivos e não apresentarem total eficácia na detecção do parasita13.

A grande maioria dos autores encontra consenso quando afirma que a dificuldade na identificação deste protozoário está no treinamento adequado dos analistas clínicos, que possuem dificuldade em reconhecer e identificar o Blastocystis hominis ou, ainda, não atribuem a devida importância ao mesmo, não o mencionando nos resultados dos exames7,9,10,17.

Devido à frequência com que esse parasita tem sido encontrado na população, destaca-se a importância da padronização de técnicas parasitológicas que permitam o diagnóstico do Blastocystis hominis, através da sua correta identificação1,20.

MÉTODOS

De março a maio de 2008, foram analisadas 100 amostras de fezes, espontaneamente emitidas e preservadas em frasco contendo formol, encaminhadas ao Setor de Parasitologia do Laboratório de Biomedicina da Universidade Feevale.

Cada amostra fecal foi dividida em duas partes: a primeira parte foi submetida ao método de sedimentação espontânea (HPJ)19 e a segunda parte foi submetida ao método de centrífugo-sedimentação em formol-éter (Ritchie)19. O sedimento resultante da técnica de Ritchie foi dividido em duas partes, sendo a primeira avaliada em microscopia com lugol, e a segunda parte utilizada para confecção de esfregaços fixados com metanol, que foram corados através das técnicas de May-Grünwald-Giemsa (MGG) e Gram, para avaliação da existência de Blastocystis hominis11. Para as técnicas de sedimentação, foram avaliadas 3 lâminas (coradas com lugol) e para as técnicas de coloração permanente, foram confeccionadas duas lâminas, sendo uma delas corada por MGG e outra por Gram, e ambas foram avaliadas microscopicamente8,21,22.

Para validação dos resultados, em todas as técnicas foi utilizado um pool, sabidamente positivo para o parasita em questão, como forma de controle de qualidade. Da mesma forma, os reagentes usados na coloração tiveram seu controle de qualidade realizado, através da avaliação da data de validade e características físico-químicas.

Para análise estatística utilizou-se um teste não-paramétrico, o teste qui-quadrado.

RESULTADOS

Inicialmente todas as 100 amostras foram submetidas a quatro técnicas de análise: HPJ, Ritchie, coloração por MGG e coloração por Gram. Deste total, 22 foram negativas e 78 foram positivas para presença de parasitos (Tabela 1). Em relação aos protozoários, Endolimax nana foi a mais prevalente, sendo observada em 46 amostras, o que corresponde a 58,9% das amostras positivas. Blastocystis hominis foi encontrado em 40 amostras analisadas, sendo encontrado em 51,2% das amostras positivas. Outros protozoários encontrados foram Entamoeba coli (22 amostras) e Giardia lamblia (7 amostras). Dentre os helmintos, observou-se a maior prevalência de Ascaris lumbricoides, em 9 amostras (Tabela 2).

Segundo a Tabela 3, podemos observar que utilizando-se técnicas de coloração (MGG e Gram), a identificação de Blastocystis hominis foi mais efetiva do que quando comparada com os métodos de sedimentação convencionais, especialmente o HPJ. Das 40 amostras positivas para Blastocystis hominis, identificadas por coloração permanente, somente 20 foram também identificadas pela técnica de HPJ e 32 pela técnica de Ritchie. Importante ressaltar que todas as 20 amostras positivas na técnica de HPJ, também, foram positivas na técnica de Ritchie. Entretanto, se observou diferença estatística significativa entre duas técnicas de sedimentação (HPJ e Ritchie), bem como quando comparadas as técnicas de coloroção (MGG e Gram) com a técnica de HPJ. Quando comparadas as técnicas de coloração utilizadas (Gram e MGG), percebe-se que ambas apresentam eficiência semelhante, conforme já descrito na Tabela 3.

Na Figura 1, podemos comparar as imagens obtidas com as diferentes colorações utilizadas.

DISCUSSÃO

Vários estudos sobre a importância do Blastocystis hominis em patologias humanas têm sido realizados1,3,6,8,9,12,14,23. Entretanto, seu papel exato ainda não se encontra perfeitamente elucidado. Não está categoricamente provado que esse protozoário seja comensal. Por outro lado, há relatos que consideram a possibilidade dele causar manifestações clínicas, sobretudo quando excluídos outros agentes tidos como patogênicos. Outrossim, julgam que a quantidade encontrada influi, em especial, nos indivíduos imunocomprometidos9,10. Alguns autores sugerem que esse deva ser considerado patogênico somente em pessoas sintomáticas, especialmente crianças, ou quando o número de organismos no exame microscópico das fezes excederem cinco organismos por campo4.

Grande parte dessa confusão se deve à dificuldade de execução do diagnóstico adequado. Segundo Amato Neto e cols (2004), sua visualização só poderia ser realizada com o uso do exame direto ou de colorações permanentes, como hematoxilina férrica, tricrômio ou da tionina10. Já segundo Velásquez e cols (2005), a preservação das amostras com formol a 10% permite o diagnóstico utilizando a técnica de sedimentação espontânea em água, apesar da fragilidade das formas vacuolares7. Resultados semelhantes foram relatados por Martins e cols (2007), onde foi possível a visualização do protozoário em preparações utilizando água1.

Embora as técnicas rotineiras sejam de mais fácil execução, muitas vezes a falta de treinamento dos analistas pode gerar dificuldades no diagnóstico. Para facilitar a observação, em nosso laboratório avaliamos quatro métodos de diagnóstico: dois rotineiramente utilizados (HPJ e Ritchie) e dois métodos de coloração permanente (MGG e Gram).

Em relação aos métodos de sedimentação, nosso estudo demonstrou que a técnica de centrífugo-sedimentação foi mais efetiva no isolamento de protozoários, especialmente de Endolimax nana e Blastocystis hominis do que a técnica de HPJ (Tabela 3). Esse achado pode ser resultante da força centrífuga aplicada, que possivelmente força a deposição da forma vacuolar do protozoário. Além disso, a utilização de formalina-éter promove a obtenção de um sedimento um pouco mais purificado do que a sedimentação espontânea, facilitando a análise21,24.

Semelhante ao relatado por Amato Neto e cols (2004), a identificação do Blastocystis hominis se tornou extremamente facilitada com a utilização de técnicas de coloração permanente, muito embora não se tenha utilizado a coloração por hematoxilina férrica (Figura 1)9,10. Como vantagens da utilização de qualquer uma das técnicas de coloração permanente (MGG e Gram), podemos citar a sua utilização rotineira nos laboratórios clínicos, seja no setor de Hematologia ou no setor de Bacteriologia, o que dispensa o gasto econômico do laboratório com a montagem de uma técnica de coloração específica25. Observamos também que utilizando o método de coloração de MGG há uma maior facilidade, já que, durante a coloração de Gram, temos a etapa da descoloração que é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente pode provocar a remoção do cristal violeta do interior dos núcleos periféricos do Blastocystis hominis, ou ainda, se não houver a descoloração necessária não iremos observar o vacúolo central, prejudicando assim a visualização do parasita em questão22,26.

Cabe ressaltar que o sucesso na identificação de Blastocystis hominis, utilizando-se técnicas de coloração, foi favorecido pela utilização de sedimentos obtidos pela técnica de Ritchie, que certamente promoveu uma maior concentração dos espécimes parasitários, além de eliminar gotículas de gordura, que poderiam ser confundidas com o parasita, em função de forma e tamanho21,24.

Embora o método de coloração seja um processo mais demorado e trabalhoso que os métodos convencionais utilizados, muitas publicações relatam que este é o método mais sensível para a visualização de Blastocystis hominis, o que evidencia a necessidade de se incluir a coloração na rotina do laboratório, evitando assim a ocorrência de resultados falso-negativos9,13,17,27,28.

A blastocistose ainda permanece cercada de controvérsias e incertezas, sobretudo referente à patogenicidade. Enquanto alguns autores sustentam a idéia de que a infecção por Blastocystis hominis é autolimitada e não deve ser tratada, outros afirmam que sua frequência e patogenicidade são realmente significativas. Assim, é importante e desejável que conhecimentos adequados sejam satisfatoriamente divulgados, para evitar procedimentos impróprios e auxiliar no sentido de tornar ampla a difusão de corretas particularidades vinculadas a tal microorganismo.

CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.

Recebido para publicação em 12/05/2009

Aceito em 12/04/2010

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    Profª. Rejane Giacomelli Tavares
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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    07 Jun 2010
  • Data do Fascículo
    Jun 2010

Histórico

  • Aceito
    12 Abr 2010
  • Recebido
    12 Maio 2009
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