Investigação sorológica de casos subclínicos de leishmaniose tegumentar após um surto em uma localidade endêmica

Serological investigation of subclinical cutaneous leishmaniasis cases following an outbreak in an endemic area

Sandra Mara Alessi Aristides Arraes Mirela Teixeira Marini Daiane Martello Thaís Gomes Verzignassi Silveira Maria Valdrinez Campana Lonardoni Marcos Rafael Nanni Sobre os autores

Resumos

Investigou-se casos subclínicos de leishmaniose tegumentar em um bairro de Maringá-Paraná, pelas reações de imunofluorescência indireta e enzimaimunoensaio. Das 130 amostras analisadas, uma amostra apresentou título 40 e três apresentaram título 20 pela imunofluorescência indireta, enquanto 11 amostras apresentaram-se positivas pela reação de enzimaimunoensaio. Estes dados sugerem a existência de casos subclínicos nesta localidade.

Leishmaniose tegumentar; Imunofluorescência indireta; Enzimaimunoensaio; Casos subclínicos


Subclinical cases of cutaneous leishmaniasis were investigated in a district of Maringá, State of Paraná, by means of the indirect immunofluorescence reaction and enzyme immunoassay. Among the 130 samples analyzed, one presented titer 40 and three presented titer 20 in the indirect immunofluorescence reaction, while 11 samples were positive in the enzyme immunoassay reaction. These data suggest that subclinical cases exist at this locality.

Cutaneous leishmaniasis; Indirect immunofluorescence; Enzyme immunoassay; Subclinical cases


COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Investigação sorológica de casos subclínicos de leishmaniose tegumentar após um surto em uma localidade endêmica

Serological investigation of subclinical cutaneous leishmaniasis cases following an outbreak in an endemic area

Sandra Mara Alessi Aristides ArraesI; Mirela Teixeira MariniII; Daiane MartelloII; Thaís Gomes Verzignassi SilveiraI; Maria Valdrinez Campana LonardoniI; Marcos Rafael NanniIII

IDepartamento de Análises Clínicas, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR

IIProjeto de Iniciação Científica, Curso Farmácia, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR

IIIDepartamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá, Maringá, PR

Endereço para correspondência

RESUMO

Investigou-se casos subclínicos de leishmaniose tegumentar em um bairro de Maringá-Paraná, pelas reações de imunofluorescência indireta e enzimaimunoensaio. Das 130 amostras analisadas, uma amostra apresentou título 40 e três apresentaram título 20 pela imunofluorescência indireta, enquanto 11 amostras apresentaram-se positivas pela reação de enzimaimunoensaio. Estes dados sugerem a existência de casos subclínicos nesta localidade.

Palavras-chaves: Leishmaniose tegumentar. Imunofluorescência indireta. Enzimaimunoensaio. Casos subclínicos.

ABSTRACT

Subclinical cases of cutaneous leishmaniasis were investigated in a district of Maringá, State of Paraná, by means of the indirect immunofluorescence reaction and enzyme immunoassay. Among the 130 samples analyzed, one presented titer 40 and three presented titer 20 in the indirect immunofluorescence reaction, while 11 samples were positive in the enzyme immunoassay reaction. These data suggest that subclinical cases exist at this locality.

Key-words: Cutaneous leishmaniasis. Indirect immunofluorescence. Enzyme immunoassay. Subclinical cases.

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é doença endêmica presente em todos os estados brasileiros11. No Estado do Paraná tem se mostrado endêmica3 10 16 17, apresentando uma incidência de 4,2% de casos/100 mil habitantes12.

O meio urbano da Cidade de Maringá-PR apresenta arborização exuberante com a manutenção de fragmentos florestais remanescentes de Mata Atlântica. Estes ambientes são propícios para a manutenção de fauna silvestre, atuando como possíveis focos naturais de transmissão da LTA19. No período de 2000 a 2006, foram registrados em Maringá 189 casos humanos de LTA13, dos quais 25 residiam próximos à Unidade de Conservação Parque Borba Gato8.

A transmissão da LTA em moradores próximos de unidades de conservação, indica a provável existência nesses locais de animais silvestres, reservatórios do parasita, que possibilitam a manutenção do ciclo do parasito e, conseqüentemente, a infecção do homem19.

O Laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC) da Universidade Estadual de Maringá (UEM) é Centro de Referência da Fundação Nacional de Saúde para o diagnóstico laboratorial da LTA e tem realizado os exames parasitológicos (microscopia direta) e imunológicos [intradermorreação de Montenegro (IDRM) e teste de imunofluorescência indireta (IFI)]. Neste laboratório20, foi padronizado o teste de enzimaimunoensaio (ELISA) mostrando que apesar da detecção de reatividade cruzada com outras doenças, como a de Chagas, o teste foi capaz de detectar 97% de pacientes com parasitológico positivo e 97% dos pacientes com parasitológico e IDRM negativos. A reatividade cruzada com a doença de Chagas foi relatada em 6,3% dos indivíduos residentes em municípios da região6.

O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de casos com sorologia positiva para LTA em familiares e vizinhos de pessoas diagnosticadas com a doença no bairro Borba Gato, município de Maringá, Paraná.

Local de estudo. Conforme mostra a Figura 1, a Cidade de Maringá (sede da 15ª Regional de Saúde do Paraná) está inserida na região Noroeste do Estado do Paraná, sendo cortada pelo Trópico de Capricórnio. Possui as coordenadas geográficas: 23° 25' latitude sul; 51º 57' longitude oeste; altitude de 596m, com média pluviométrica anual de 1.500ml e umidade relativa do ar de 66%14.


Pacientes. Foram estudados 130 indivíduos que eram da família e/ou vizinhos de pessoas que tiveram LTA, sendo todos moradores das proximidades da mata existente no bairro Borba Gato. Amostras de sangue foram coletadas para o diagnóstico laboratorial da doença e os soros armazenados a -18ºC até o uso.

Imunofluorescência-Leishmania. Foram utilizadas formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/1987/M11272) e conjugado anti-IgG humano-FITC15. Foram considerados como significativos títulos >40. As amostras positivas foram testadas para anticorpos anti-Trypanosoma cruzi por imunofluorescência (IFI).

Imunofluorescência-Trypanosoma cruzi. Foram utilizadas formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (BioMérieux) e conjugado anti-IgG humano-FITC, considerando como significativos títulos >40.

ELISA-Leishmania. Formas promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/1987/M11272) foram cultivadas em meio 199 (Sigma) suplementado com 10% (v/v) de soro bovino fetal inativado, penicilina G (100UI/ml), estreptomicina (100mg/ml), L-glutamina (0,2mM) e 1% (v/v) de urina humana a 25ºC. Os parasitas foram lavados com salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,2 a 4°C a 1.700 x g durante 10 minutos, liofilizados e mantidos a 4ºC. O preparo do antígeno e a execução do método seguiu o descrito por Yoneyama e cols20, como brevemente descrito. As placas foram sensibilizadas com o extrato diluído em tampão carbonato-bicarbonato (0,1M, pH 9,6). Os soros foram diluídos a 1:150 e adicionados à placa. A reação foi revelada com conjugado anti-IgG humano peroxidase e OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride, Sigma), parada com de H2SO4 3M e a absorbância medida em 492nm na leitora de microplacas Anthos 2010 (Labtec). Cada amostra foi analisada em duplicata e foram consideradas positivas aquelas com absorbância média superior a 0,68 (cutt off)20. Em todas as placas foram incluídos controles positivos e negativos para verificação da reatividade do ensaio.

Aspectos éticos. O trabalho foi desenvolvido de acordo com a Resolução 196/96 do CNS/MS, submetido ao Comitê Permanente de Ética em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos (COPEP/UEM) e aprovado conforme Parecer nº 164/2005.

A Figura 1 apresenta a localização da cidade de Maringá na região Noroeste do Estado do Paraná e a 15ª Regional de Saúde.

A Tabela 1 mostra os resultados das 130 amostras de soros na imunofluorescência indireta para LTA e doença de Chagas e no enzimaimunoensaio para LTA. Dos 130 moradores do bairro Borba Gato analisados, que não apresentavam lesão, três tiveram a IFI para LTA com título 20 e um com título 40 e 11 apresentaram anticorpos anti-Leishmania na ELISA. A amostra de número 58 apresentou a maior absorbância (2,070) pela ELISA, também apresentou maior título na IFI-Leishmania (40) e foi a única amostra positiva (título 80) na IFI-Chagas.

A prevalência da LTA depende do contato dos indivíduos com o ambiente florestal5 e a população rural e periurbana de áreas endêmicas está permanentemente exposta à picada do inseto flebótomo9. Seis dos 11 indivíduos com sorologia positiva, moradores do Parque Borba Gato, Maringá-PR, residiam em uma mesma rua que margeia a mata.

Os testes sorológicos são pouco utilizados para o diagnóstico da LTA20, sendo necessária a associação de diferentes métodos para aumentar a positividade do diagnóstico da doença16. Têm sido encontradas algumas dificuldades na utilização do teste intradérmico de Montenegro para o diagnóstico da leishmaniose, como por exemplo, o uso de diferentes espécies do parasita e de diferentes formas de preparação de antígenos além da capacidade do teste em induzir reações de hipersensibilidade tardia quando realizada pela segunda vez. A reação de IFI é a mais empregada, sendo sensível, porém com possibilidades de reações cruzadas, especialmente com a doença de Chagas, o que pode explicar o resultado obtido em um dos pacientes estudados. Em pacientes com lesões entre um a seis meses de evolução é freqüente a negatividade da IFI7. A utilização de diferentes antígenos em técnicas mais sensíveis, como a ELISA, pode fornecer diagnóstico mais específico.

A presença de anticorpos anti-Leishmania detectados pela ELISA em 11 (8,5%) dos 130 moradores estudados sugere a ocorrência de casos subclínicos, após o surto de leishmaniose, ocorrido em 2003-2004 neste bairro. Este percentual é semelhante ao encontrado anteriormente em áreas endêmicas de Leishmania braziliensis1 4 18 e de Leishmania chagasi2 onde 10% de pessoas saudáveis tiveram a intradermorreação de Montenegro positiva.

Os resultados mostram a presença de anticorpos anti-Leishmania detectados por ELISA e sugerem a ocorrência de casos subclínicos entre os moradores do bairro Borba Gato, Maringá, após o surto de LTA.

  • Endereço para correspondência:
    Drª Sandra Mara A.A. Arraes
    Av. Colombo 5790, Jardim Universitário, Zona 7
    87020-900 Maringá, PR
    Tel: 55 44 3261-4878; Fax: 55 44 3261-4860
    e-mail:
  • Recebido para publicação em: 06/08/2007

    Aceito em: 28/03/2008

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    Endereço para correspondência: Drª Sandra Mara A.A. Arraes Av. Colombo 5790, Jardim Universitário, Zona 7 87020-900 Maringá, PR Tel: 55 44 3261-4878; Fax: 55 44 3261-4860 e-mail: smaaarraes@uem.br

    Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      24 Jun 2008
    • Data do Fascículo
      Abr 2008

    Histórico

    • Aceito
      28 Mar 2008
    • Recebido
      06 Ago 2007
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