ANTAGONISMO IN VITRO DE Trichoderma spp. A Verticillium dahliae KLEB

ANTAGONISMO IN VITRO DE Trichoderma spp. A Verticillium dahliae KLEB¹

M.P. MARTINS-CORDER¹,2; I.S. de MELO³

²Depto. Ciências Florestais/CCR/UFSM, CEP: 97119-900 - Santa Maria, RS.

³ CNPMA/EMBRAPA, C.P. 69, CEP: 13820-000 - Jaguariuna, SP.

RESUMO: O presente trabalho visou testar e selecionar isolados selvagens de Trichoderma spp. quanto à capacidade antagônica ao fungo fitopatogênico Verticillium dahliae. Os ensaios in vitro consistiram de testes para avaliar a capacidade hiperparasítica e de antibiose através da produção de metabólitos voláteis e não voláteis. Pela técnica de culturas pareadas, 47 isolados de diversas espécies de Trichoderma foram avaliados e, pelos resultados obtidos, 20 foram selecionados. Através do teste de antibiose, selecionaram-se 7 isolados: T15P e Tal-1 (T. viride), TW6 e CNP311A (T. koningii), CNP17 e TCII (T. harzianum) e Tal-10 (T. aureoviride) os quais inibiram completamente o crescimento micelial de V. dahliae através da produção de metabólitos. Observações microscópicas demonstraram interações de hifas entre Trichoderma sp. e V. dahliae, tais como: enrolamento, crescimento paralelo de ambos, formação de ganchos.

Descritores: biocontrole, parasitismo, antagonismo, Trichoderma, Verticillium

IN VITRO ANTAGONISM OF Trichoderma spp. AGAINST Verticillium dahliae KLEB

ABSTRACT: This work was carried out to test and to select wild strains of Trichoderma spp. with antagonistic ability against Verticillium dahliae. The in vitro assay consisted of the antibiosis technique by assessment of volatile and non-volatile metabilites and hyphal interaction. Forty seven Trichoderma strains were evaluated and twenty strains were selected by their antagonistic ability against V. dahliae. Through the antibiosis test, seven strains of different species T15P and Tal-1 (T. viride); TW6 and CNP311A (T. koningii); CNP17 and TCII (T. harzianum) and Tal-10 (T. aureoviride) inhibited the mycelial growth of V. dahliae due to the production of metabolites. Several kinds of hyphal interference were observed such as coiling and hook formation.

Key Words: biocontrol, parasistism, Trichoderma, Verticillium, antagonism

INTRODUÇÃO

Espécies de Trichoderma são consideradas eficientes antagonistas contra uma série de fungos fitopatogênicos, atuando tanto pela produção de metabólitos voláteis como de não voláteis (Claydon et al., 1987; Camporota, 1985; Rai et al., 1980; Dennis & Webster, 1971a, b) como também pelo hiperparasitismo (Papavizas, 1985; Barak et al., 1985; Vajna, 1985 a, b; Chet & Elad, 1983; Dennis & Webster, 1971c; Barnett, 1963) e pela competição por nutrientes, espaço e oxigênio (Chet & Elad, 1983).

A produção de metabólitos tóxicos por espécies de Trichoderma foi primeiramente observada por Weindling (1934), que determinou haver difusão do princípio letal em hifas jovens. As espécies de Trichoderma também produzem exoglucanases e endoglucanases, celobiase e quitinase, que são enzimas importantes na degradação e na lise da parede celular de fungos fitopatogênicos (Ridout et al., 1988; Papavizas, 1985; Elad et al., 1982). Os mecanismos de controle biológico podem ocorrer simultaneamente durante o processo de vida do antagonista. A capacidade para produzir tais substâncias e o seu efeito fungicida pode variar entre espécies e entre isolados da mesma espécie.

É importante conhecer antes de lançar mão de estratégias para aumentar a efetividade desses agentes quais são as características passíveis de serem manipuladas para tornar o biocontrole viável. De acordo com Kemerly & Stack (1987), as pricipais características para iniciar um programa de melhoramento genético, através da obtenção de novas linhagens de Trichoderma spp. são: capacidade de sobrevivência no solo, produção de metabólitos tóxicos, resistência a temperaturas extremas e estabilidade metabólica. Visando o controle integrado, vários estudos têm sido realizados no sentido de produzir novos biótipos de Trichoderma spp. resistentes a diversos fungicidas (Cassiolato, 1995; Peterbauer et al., 1992; Melo & Silva, 1991, Gullino & Garibaldi, 1988).

A murcha verticilar causada por V. dahliae tem causado severos danos à cultura de berinjela (Solanum melongena). Diversas medidas fitossanitárias são tomadas, sem grandes êxitos, pois o patógeno pode persistir no solo durante muitos anos na forma de microesclerócios. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo selecionar isolados de Trichoderma spp. quanto à sua capacidade de produzir metabólitos tóxicos, competir e hiperparasitar V. dahliae "in vitro", para posteriormente, serem empregados em testes de casa de vegetação e de campo.

MATERIAIS E MÉTODOS

Teste de antagonismo em confrontação direta: 47 isolados de Trichoderma spp. foram testados contra V. dahliae. Discos de ágar contendo micélio e conídios de V. dahliae foram colocados em placas de Petri (90 mm), contendo meio de batata-dextrose-ágar (BDA), a uma distância de aproximadamente 1,0 cm da borda. As culturas foram incubadas por 10 dias, em temperatura ambiente, na ausência de luz. A seguir, fez-se a repicagem de Trichoderma spp. nas placas de Petri, em posição oposta à colônia do patógeno. As colônias foram incubadas durante 5 dias, em temperatura ambiente e em fotoperíodo de 12 horas. Nas avaliações, utilizou-se o critério de Bell et al. (1982) através de escala de notas com valores de 1 a 5. O delineamento foi inteiramente casualizado, com 3 repetições por tratamento.

Os 20 isolados de Trichoderma spp. selecionados, foram classificados taxonomicamente no Departamento de Micologia da Universidade Federal de Pernambuco, sendo: Tal-1 e T15P (T. viride Pers. ex. S.T. Gray); Tal-4, Tal-6, Tal-9, Tal-10, TW16, TH15, T410 e T218 (T. aureoviride Rifai); TW6 e CNP311A (T. koningii Oud); TW14, TV, TISE, TIV e T10P (T. pseudokoningii); CNP17, TCII e TW5 (T. harzianum). Novamente, esses 20 isolados de Trichoderma foram testados contra outros isolados de V. dahliae (IM₁, IM₂ e IM₃, procedentes de Piracicaba SP, Campinas SP e Betim MG, respectivamente) os quais tiveram como hospedeiro comum, a cultura de berinjela. Neste caso, substituiu-se o meio de BDA pelo meio de extrato de malte-agar, pH 6,0 e o critério de avaliação, pela porcentagem de colonização (%C), seguiu o recomendado por Camporota (1985), em que: %C = DT/DE100, sendo DT, o raio de crescimento da colônia de Trichoderma spp. em direção frontal à colônia de V. dahliae e DE, a distância que separa as duas colônias.

Teste de antibiose: o método consistiu em cobrir assepticamente toda a superfície do meio de extrato de malte-ágar (pH 6,5), com discos de papel celofane (9,0 cm de diâmetro). A seguir, discos de ágar contendo micélio mais conídios de Trichoderma spp. foram colocados no centro, sobre a superfície do papel celofane (Dennis & Webster, 1971a). Os isolados de Trichoderma spp. foram os mesmos selecionados no teste descrito anteriormente. As colônias foram incubadas por 48 horas à temperatura ambiente, sob luz contínua. Tomou-se as medidas de diâmetro médio da colônia de Trichoderma spp. e finalmente, retirou-se o papel celofane (juntamente com a colônia de Trichoderma spp.). As placas foram invertidas e adicionaram-se aproximadamente 30 ml de clorofórmio na sua parte inferior, a fim de eliminar resíduos estruturais de Trichoderma. Após a evaporação do produto, voltou-se à posição original das placas de Petri. A seguir, fez-se a semeadura através da adição de 0,12 ml da suspensão contendo estruturas de V. dahliae sobre o meio, espalhando uniformemente o inóculo com auxílio da alça de Drigalsk. As placas foram incubadas a 25 C, na ausência de luz. A suspensão contendo estruturas de V. dahliae foi obtida de colônias crescendo em meio de aveia-ágar, durante 12 dias, a 26 C.

Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, com 3 repetições por tratamento. Tomou-se o diâmetro médio do halo de inibição formado por Trichoderma spp., após 3 dias de incubação, através do crescimento de V. dahliae.

Teste de avaliação do efeito de metabólitos voláteis: o método baseado em Bharat et al. (1980), consistiu em posicionar tampas de placas de Petri umas sobre as outras, após ter vertido meio de extrato de malte-ágar em cada uma delas. Na extremidade inferior da placa, semeou-se o antagonista e na superior, o patógeno, ambos na forma de discos de ágar (1 cm) contendo micélio e conídios. Lateralmente, vedaram-se as tampas com membrana plástica e em seguida, incubou-se o material em temperatura ambiente, por 7 dias, sob luz fluorescente contínua. Utilizaram-se os seguintes isolados: Tal-1 e T15P (T. viride); TW6 e CNP311A (T. koningii); e IM₁ (V. dahliae). O delineamento inteiramente casualizado conteve 4 repetições por tratamento. A testemunha recebeu apenas V. dahliae tanto na parte superior como na parte inferior da placa de Petri.

Estudos sobre a interação de hifas: empregou-se a mesma metodologia descrita anteriormente, no teste de antagonismo em confrontação direta, com exceção apenas que, neste teste, posicionou-se previamente, uma lamínula esterilisada entre as duas colônias opostas. Para as observações microscópicas, efetuou-se a montagem de lâminas após a adição de uma gota do corante Azul de Bromofenol sobre a lamínula contendo estruturas dos dois fungos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dentre os 47 isolados de Trichoderma spp., foram selecionados 20 isolados que receberam nota 1 e alguns outros que receberam nota 2 (TABELA 1). Constatou-se que a maioria dos antagonistas colonizou e produziu esporos em abundância sobre as colônias de V. dahliae. Boosalis (1964) relata que a intensa esporulação pode ocorrer quando determinados hospedeiros estimulam a reprodução de seus parasitas.

Os isolados de Trichoderma spp. selecionados e re-avaliados no teste de antagonismo em confrontação direta mostraram uma estreita magnitude de variação e poucos tratamentos apresentaram diferenças estatísticas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade (TABELA 2). Esses resultados mostraram que houve uma redução na variabilidade para a característica em estudo, com a seleção feita no primeiro ensaio.

Pelo teste de antibiose foi possível quantificar a produção de metabólitos de Trichoderma spp. (TABELA 3). Os isolados que apresentaram os melhores resultados foram: T15P, Tal-1, TW6, CNP311A, CNP17, TCII e Tal-10. Com exceção do TW6, os demais isolados selecionados através do teste de antibiose, produziram metabólitos que não permitiram mais o crescimento de V. dahliae no meio. O T15P apresentou melhor resposta quanto à produção de metabólitos, visto que sua colônia, ao atingir cerca de 4,0 cm, mostrava inibição completa do crescimento de V. dahliae. O TW6 apesar de colonizar rapidamente o substrato, foi o isolado que apresentou maior instabilidade metabólica, pois verificou-se que, apesar de apresentar halo de inibição superior à média, constatou-se que após algumas horas houve, a retomada de crescimento de V. dahliae. Os outros isolados testados que apresentaram diâmetro médio de colônia acima da média mostraram pouca capacidade para produzirem metabólitos, através do halo de inibição

Empregou-se como critério de seleção o potencial para produção de metabólitos, a velocidade para colonizar o substrato e o fato de ter pelo menos dois isolados da mesma espécie. Apesar dos antibióticos apresentarem grande importância no antagonismo, a competição é um mecanismo essencial em condições naturais.

Para o teste de produção de metabólitos voláteis, verificou-se que os 4 isolados selecionados (T15P, Tal-1, TW6 e CNP311A) apresentaram diferenças significativa em relação ao controle, apesar de não diferirem entre si, pelo teste de Tukey a 1% de probabilidade (TABELA 4). Verificou-se que as colônias de V. dahliae tornaram-se frequentemente reduzidas na presença de Trichoderma spp.. De acordo com Dennis & Webster (1971 b), T. viride e T. koningii são eficientes produtores de metabólitos voláteis em meio de cultura. Esses autores explicam que os antibióticos voláteis atuam sobre os fungos suscetíveis através da inibição do crescimento micelial e que isolados com capacidade para produzirem substâncias não voláteis nem sempre produzem substâncias voláteis. Os antagonistas selecionados no presente estudo são produtores tanto de metabólitos voláteis como de metabólitos não voláteis.

Através dos estudos de interação de hifas de Trichoderma spp. e V. dahliae, verificaram-se várias formas típicas de parasitismo (Figura 1). Crescimento paralelo das hifas de ambos os fungos (Figura 1a), formação de estruturas semelhantes a ganchos, que cresciam em direção aos feixes de hifas do hospedeiro (Figura 1b, c, d), enrolamentos de hifas do antagonista sobre o patógeno (Figura 1e, f) e intensiva fragmentação de hifas do hospedeiro ocorreu frequentemente.

No presente estudo, verificou-se que os isolados de T. viride e T. koningii selecionados através da antibiose, competição por substrato e hiperparasitismo, mostraram ampla potencialidade para antagonizar V. dahliae "in vitro". Os mecanismos de controle biológico podem ocorrer simultaneamente ao longo do processo de vida do antagonista os quais se sobrepõem e prejudicam o desenvolvimento dos competidores. Trichoderma spp. causaram a degradação das hifas hospedeiras através da secreção de metobólitos tóxicos inibindo o desenvolvimento de V. dahliae. Quando se estabeleceu o contato íntimo entre as hifas, o antagonista enrolou-se no hospedeiro, formando estruturas semelhantes a ganchos, causando a destruição da parede celular, provavelmente para obter nutrientes a partir das células mortas. Adicionalmente, o crescimento de Trichoderma spp. foi bastante agressivo, conferindo a esses antagonistas uma enorme capacidade como competidores através da rápida colonização do substrato. As espécies de Trichoderma podem parasitar também estruturas de resistência como microescleródios, que são frequentemente produzidos por V. dahliae (Melo, 1991; Chet & Hennis, 1985).

Figura 1 -
Interação de hifas de Trichoderma spp. (coradas de azul intenso) e Verticilium dahliae (não coradas). (A) crescimento em contato íntimo de T. pseudokoningii, isolado TIV, com IM₂ (x100). (B) idem ao anterior, a ponta da seta indica início da formação de um gancho (x100). (C) crescimento em contato íntimo e formação de ganchos de T. aureo-viride, isolado TW16, envolvendo conídios de IM₃ (x100). (D) formação de ganchos. (E) enrolamento de hifas do isolado TW6 de T. koningii, a seta mostra um clamidosporo (x40). (F) enrolamento de hifas de T. aureoviride, isolado T218, sobre IM₃, a seta mostra parte da hifa de V. dahliae (x40).

Diante dos resultados obtidos no presente estudo, evidenciou-se a necessidade de testar esses isolados de Trichoderma spp. em condições de casa de vegetação e de campo, para comprovar seu potencial como agentes de biocontrole da murcha verticilar de berinjela causada por V. dahliae.

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Recebido para publicação em 22.10.96

Aceito para publicação em 26.06.97

¹Parte da Dissertação do primeiro autor apresentado à ESALQ/USP.

Parte da Dissertação do primeiro autor apresentado à ESALQ/USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Nov 1998
• Data do Fascículo
  Jan 1998

Histórico

• Recebido
  22 Out 1996
• Aceito
  26 Jun 1997