Produção de álcoois superiores por linhagens de Saccharomyces durante a fermentação alcoólica

Production of higher alcohols by Saccharomyces strains during alcoholic fermentation

TECNOLOGIA AGROINDUSTRIAL

Produção de álcoois superiores por linhagens de Saccharomyces durante a fermentação alcoólica

Production of higher alcohols by Saccharomyces strains during alcoholic fermentation

L.E. Gutierrez

Departamento de Química da ESALQ/USP, C.P. 9, CEP.-13.418-900, Piracicaba,SP. e CEBTEC/FEALQ

RESUMO

A produção de álcoois superiores pelas leveduras Saccharomyces cerevisiae M-300-A, Saccharomyces uvarum IZ-1904 e levedura de panificação (Saccharomyces cerevisiae) foi estudada em diversas condições de temperatura, concentração de sacarose, pH, fontes de nitrogênio e com inibidor 2-4 dinitrofenol (DNP). Em todas as condições estudadas, a levedura Saccharomyces uvarum IZ-1904 apresentou a menor formação de álcoois superiores enquanto a levedura de panifícação apresentou os teores mais elevados. Com o aumento de temperatura e da concentração de sacarose ocorreu maior formação de álcool isoamílico pelas leveduras estudadas. Em pH 4,5 ocorreu menor produção de álcoois superiores do que em pH 3,0. Na presença do inibidor DNP ocorreu significativa redução (p< 0,05) nos teores de álcool isoamílico. As leveduras utilizadas não apresentaram o mesmo comportamento em relação ao sulfato de amônio e uréia quanto a formação de álcoois superiores.

Descritores: álcoois superiores, Saccharomyces, fermentação alcoólica.

ABSTRACT

The production of higher alcohols by Saccharomyces cerevisiae M-300-A, Saccharomyces uvarum IZ-1904 and baker's yeast (5. cerevisiae) was studied under several temperature conditions, sucrose level, pH, nitrogen sources and with 2-4 dinitrophenol (DNP). The yeast IZ-1904 showed lower production of higher alcohols than other yeasts in all conditions studied. With the increase of temperature and higher level of sucrose an increase of isoamyl alcohol production was observed. A lower formation of higher alcohols was observed at pH 4.5 than at pH 3.0. With the addition of DNP occurred a significant reduction in isoamyl alcohol content. The yeasts did not show the sanie production of higher alcohols in relation to urea and ammonium sulfate.

Key Words: higher alcohols, Saccharomyces, alcoholic fermentation.

INTRODUÇÃO

A produção de etanol pela via fermentativa é acompanhada pela formação de compostos como glicerol, ácido succínico e álcoois superiores. A presença de álcoois superiores no meio fermentativo é indesejável nas destilarias porque dificulta a obtenção do etanol puro.

No caso das bebidas alcoólicas, os álcoois superiores desempenham papel importante no aroma (RANKINE, 1967; SUOMALAINEN, 1971).

A formação de álcoois superiores nas leveduras ocorre através da descarboxilação de cetoácidos intermediários da biossíntese de aminoácidos seguida de redução de aldeídos pela desidrogenase alcoólica conforme esquematizado por WEBB & INGRAHAM (1963).

No caso da bactéria Zimomonas, BEVERS & VERACHTERT (1976) propuseram que os mecanismos dessa síntese são comparáveis, com pequenas diferenças, aos utilizados pelas leveduras.

Diversos fatores influenciam a formação de álcoois superiores pelas leveduras como a espécie e a linhagem (RANKINE, 1967; FAHRASMANE et al., 1985), temperatura (HOUGH & STEVENS, 1961), composição do meio (AYRAPAA, 1967 e 1971); SUOMALAINEN & KAHANPAA, 1963; GILDENHUYS & SLAUGHTER, 1983.)

A produção de álcoois superiores acompanhou o crescimento da levedura e a formação de etanol (VOLLBRECHT & RADLER, 1974) embora NORDSTRON & CARLSSON (1965) não tenham encontrado correlação entre a formação de álcoois e o crescimento da levedura.

O objetivo do presente trabalho foi o de estudar a produção de álcoois superiores, em diversas condições, pelas leveduras de grande utilização no processo de obtenção de etanol pela via fermentativa.

MATERIAL E MÉTODOS

Microorganismo: foram utilizadas a levedura Saccharomyces cerevisiae M-300-A fornecida pelo Departamento de Genética da ESALQ/USP, Saccharomyces uvarum IZ-1904 fornecida pelo Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da ESALQ/USP e a levedura de panificação Fleischmann (Saccharomyces cerevisiae) obtida no comércio. As leveduras foram multiplicadas anaerobiamente na presença de ácido oleico e ergosterol segundo GUTIERREZ (1989).

Meio de fermentação: o meio utilizado nos ensaios de fermentação apresentou a seguinte composição por litro: sacarose 80 a 160 g, K₂HPO₄ 1,3 g, MgSO₄ 0,9 g, CaCl₂ 0,16 g, ácido cítrico 6 g, extrato de levedura 2,5 e 5 g. O pH foi acertado a 3.0; 4.0 e 4.5 com solução de KOH 5N.

Ensaio de fermentação: 80 ml dos meios contidos em frascos cônicos de 125 ml foram inoculados com suspensões das leveduras de modo a proporcionar o mesmo numero de células inicial (3 a 4x10⁷ células/ml) e a quantidade expressa em matéria seca foi de 160 mg/100 ml de meio para Fleischmann, 80 mg para IZ-1904 e 120 mg para M-300-A. As temperaturas utilizadas foram de 12°C, 25°C e 34°C. As fermentações foram acompanhadas por pesagens para se determinar o CO2 produzido e o final do processo fermentativo. Após o final da fermentação, o meio foi centrifugado e o sobrenadante utilizado para determinação de álcoois superiores. Foram realizados diversos tratamentos: efeitos da temperatura, concentrações de sacarose, pH, do inibidor 2-4 dinitrofenol (DNP) e fontes de nitrogênio.

Álcoois superiores: foram determinados por cromatografia em fase gasosa conforme metodologia descrita em GUTIERREZ (1989).

Análise estatística: foi adotado o delineamento de parcelas subdivididas com três repetições segundo GOMES (1985).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na TABELA 1 são apresentados os teores de álcoois superiores no vinho obtido com 3 leveduras nas temperaturas de 12°C, 25°C e 34°C.O efeito da temperatura não foi o mesmo para os álcoois analisados (n-propílico, iso-butílico e isoamílico). Não houve efeito para n-propílico para as 3 leveduras e ligeiro aumento para álcool isobutílico. A variação mais sensível e significativa (p <0,05) ocorreu para álcool isoamílico, onde para as 3 leveduras estudadas, ocorreu maior produção com o aumento da temperatura.

Os resultados apresentados na TABELA 1 não concordam com as observações de DAUDT & HOUGH (1975) quando verificaram redução no teor de álcool n-propílico com o aumento da temperatura e estão de acordo para o álcool isoamílico. RANKINE (1967) também verificou decréscimo no álcool n-propílico e aumento nos álcoois isobutílico e isoamílico em temperaturas mais elevadas de fermentação. Essas diferenças provavelmente poderiam ser explicadas pela levedura utilizada e variação da temperatura, pois MERRITT (1966) relatou que a temperatura ótima para a produção de álcoois superiores foi de 30°C enquanto os dados da TABELA 1 mostram maior produção a 34°C. A maior produção nessa temperatura poderia ser explicada pelo menor crescimento das leveduras em temperaturas mais elevadas conforme observado por GUTIERREZ (1989), assim os cetoácidos não sendo utilizados para a síntese de aminoácidos, seriam convertidos em álcoois superiores, embora NORDSTROM & CARLSSON (1965) não tenham encontrado correlação entre a formação de álcoois e o crescimento da levedura.

Na TABELA 2 são apresentados os teores de álcoois superiores de vinhos produzidos por 3 leveduras em quatro concentrações de sacarose (8, 11, 14 e 16%). Não foi detectado efeito da concentração de sacarose sobre a produção do álcool n-propílico nas leveduras estudadas. Em relação ao álcool isobutílico observou-se comportamento diferente para as leveduras; a levedura IZ-1904 não apresentou variação, houve pequeno aumento para M-300-A e aumento significativo (p<0,05) para levedura de panificação. Com aumento da concentração de sacarose do meio ocorreu aumento na formação do álcool isoamílico nas leveduras estudadas, sendo que o aumento foi mais sensível na levedura Fleischmann sugerindo uma maior demanda por nitrogênio, fato este sugerido por ZAGO (1982).

Os dados apresentados na TABELA 2 confirmam observações de AYRAPAA (1971). Nos ensaios realizados, a concentração de sacarose variou enquanto foi mantida fixa a concentração de extrato de levedura (fonte de nitrogênio), assim provavelmente ocorreu deficiência de nitrogênio induzida pelas maiores concentrações de sacarose, provocando dessa maneira aumento na produção de álcoois superiores pois como observado por AYRAPAA (1968 e 1971) aumentando a disponibilidade de nitrogênio ocorreu redução na formação de álcoois superiores.

Nas 3 leveduras estudadas, o aumento do pH do meio de fermentação foi acompanhado por redução na produção dos álcoois, principalmente no álcool isoamílico (TABELA 3). Segundo QUAIN & DUFFIELD (1985) a formação de álcoois superiores seria uma necessidade para elevar pH intracelular através da descarboxilação de cetoácidos, assim em meios com pH mais elevado a produção de álcoois superiores seria menor. Outra possível explicação seria o maior crescimento da levedura em pH mais elevado desviando os cetoácidos para a formação de aminoácidos.

A produção dos álcoois isobutílico e isoamílico foi reduzida e a do n-propflico sofreu aumento pela adição de 2-4 dinitrofenol (DNP) como pode ser visto na TABELA 4, para quase todas as leveduras, sendo que a redução é mais acentuada para o álcool isoamílico. Para a levedura M-300-A houve redução no isobutílico enquanto que para IZ-1904 ocorreu aumento. Essa diferença de comportamento entre leveduras em relação ao DNP já tinha sido relatada por NORDSTROM & CARLSSON (1965). Segundo AMIN et al. (1984) o inibidor DNP reduz a produção de ATP o que resulta em menor massa celular e maior formação de etanol. Com o crescimento inibido, seria menor a formação dos aminoácidos e dos cetoácidos precursores dos álcoois superiores podendo ocorrer acumulo de NH₄⁺, que em maior quantidade estimularia a formação de álcool n-propílico como pode ser visto na TABELA 5. Outro inibidor que também provocou redução no álcool isoamílico foi o sulfito, demonstrado por GUTIERREZ (1988).

Na TABELA 5 são apresentados os teores de álcoois superiores com a utilização de quatro fontes de nitrogênio. Com 420 ppm de nitrogênio seja na forma de uréia como na de sulfato de amônio, ocorreu maior produção de n-propílico do que com extrato de levedura. AYRAPAA (1971) também observou aumento desse álcool com o aumento da quantidade de nitrogênio no meio. A treonina desidratase, enzima responsável pela formação do ácido alfa-ceto-butírico, é estimulada por NH₄⁺ (HOLZER, 1968), assim em condições de excesso de nitrogênio poderíamos encontrar maior atividade dessa enzima o que resultaria na maior produção do n-propílico. Comparando-se uréia e sulfato de amônio pode-se observar diferenças entre as leveduras quanto a produção de álcoois superiores. Na M-300-A ocorreu maior formação de isoamílico com uréia do que com sulfato de amônio. Com o aumento da concentração de extrato de levedura pode-se observar aumento dos teores de álcool isobutílico para M-300-A e IZ-1904 enquanto para Fleishmann houve redução. Pode-se observar ainda redução nos teores de álcool isoamílico para as três leveduras estudadas.

Em todas as condições estudadas a levedura de panificação apresentou a maior produção de álcoois superiores do que as leveduras M-300-a e IZ-1904. Essa diferença entre leveduras também foi relatada por RANKINE (1967) e FAHRAS-MANE et al. (1985). A menor formação de álcoois superiores pela levedura IZ-1904 seria de grande interesse para a produção de etanol nas destilarias.

CONCLUSÕES

1) A levedura Saccharomyces uvarum IZ-1904 apresentou a menor produção de álcoois superiores em todas as condições estudadas enquanto a levedura de panificação apresentou teores mais elevados.

2) Com o aumento da temperatura e da concentação de sacarose ocorreu maior produção do álcool isoamílico nas 3 leveduras.

3) No pH 4,5 ocorreu menor produção de álcoois superiores do que em pH 3.0.

4) A adição de DNP provocou redução dos álcoois isobutílico e isoamílico e aumento do n-propílico.

5) Com adição de 420 ppm de N seja na forma de uréia como de sulfato de amônio ocorreu maior produção de álcool n-propílico.

Received in May 26, 1993

Accepted in July 16, 1993

Enviado para publicação em 26.05.93

Aceito para publicação em 16.07.93

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Ago 2005
• Data do Fascículo
  Dez 1993

Histórico

• Aceito
  16 Jul 1993
• Recebido
  26 Maio 1993