Crescimento in vitro de progênies de Eucalyptus camaldulensis Dehn. sob condições de deficiência hídrica

In vitro growth of Eucalyptus camaldulensis Dehn. progenies under water deficit conditions

Crescimento in vitro de progênies de Eucalyptus camaldulensis Dehn. sob condições de deficiência hídrica

Gustavo Maia Souza^1*; Antonio Natal Gonçalves¹; Nelson Barbosa Machado Neto²

¹Depto. de Ciências Florestais - ESALQ/USP, C.P. 09 - CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.

²Laboratório de Biotecnologia - UNOESTE, C.P. 976 - CEP: 19050-900 - Presidente Prudente, SP.

*e-mail: [e-mail]

RESUMO: Três procedências de Eucalyptus camaldulensis foram submetidas a deficiência hídrica induzida in vitro através da adição de 100, 400 e 1000 mM de sorbitol ao meio de cultura. As gemas foram avaliadas de acordo com seu crescimento em altura, produção de matéria seca, porcentagem de umidade e proteínas totais em eletroforese de gel de poliacrilamida. Observou-se uma relação inversa entre o crescimento em altura, que sofreu redução com o aumento do deficit hídrico, e a produção de matéria seca. Houve um aumento geral do conteúdo de proteínas totais em relação a redução do potencial osmótico do meio de cultura e a expressão diferenciada de duas proteínas de 36 e 45 quilodaltons (kDa).

Palavras-chave:Eucalyptus camaldulensis, deficiência hídrica, crescimento, proteínas, cultura de tecidos

In vitro Growth of Eucalyptus camaldulensis Dehn. progentes under water deficit conditions

ABSTRACT: Three Eucalyptus camaldulensis provenances were submitted to water deficit induced in vitro through the addition of 100, 400 and 1000 mM of sorbitol to the growth medium. Shoots were evaluated for growth in height, production of dry matter, moisture content and total proteins in SDS-PAGE (sodium dodecil sulphate-poliacrylamide gel electrophoresis). An inverse relationship was observed between the growth in height, that decreased with the increase of water deficit, and the production of dry matter. There was a general increase in content of total protein in relation to the reduction of the osmotic potential of the growth medium, and the diferenciation of two proteins (36 and 45 kDa).

Key words:Eucalyptus camaldulensis, water deficit, growth, proteins, tissue culture

INTRODUÇÃO

O E. camaldulensis possui um alto consumo de água, fator este que pode ser limitante ao seu crescimento (Sinha, 1993). Sands (1981) e Moezel et al. (1988) apontam a sensibilidade do E. camaldulensis à condições de salinidade inibindo seu desenvolvimento, devido à sua baixa capacidade de excluir Na e Cl de suas células.

Segundo Façanha et al. (1983), o E. camaldulensis apresenta as melhores relações de germinação/crescimento, dentre outras espécies de seu gênero, sob condições de deficiência hídrica, apresentando as menores reduções em parâmetros como altura do caule, diâmetro do colo e produção de matéria seca.

Gibson et al. (1994), relatam que o E. camaldulensis possui diferentes estratégias para sua sobrevivência dependendo de seus sítios de origem. Árvores oriundas de regiões mais secas quando submetidas à limitação de água reduzem seu crescimento apical, as folhas tornam-se mais estreitas e espessas, e há um aumento da concentração de clorofila. Em contraste, árvores oriundas de regiões mais úmidas respondem à limitação da água através de redução da condutância estomática e das trocas gasosas e um aumento da eficiência do uso da água. Estas diferenças devem ser atribuidas a diferentes mecanismos de adaptação aos ambientes próprios.

Plântulas de E. camaldulensis de diferentes procedências mostram o mesmo padrão de comportamento que ávores jovens e adultas em relação à deficiência hídrica. Plântulas de regiões mais secas apresentam maior redução da área foliar e maior acúmulo de clorofila em relação às plântulas de locações mais úmidas, entretanto estas últimas apresentam maiores reduções das taxas de transpiração. Em condições de calor e falta d'água, as plântulas de clima mais seco tendem a aumentar a formação de raízes e deslocar a alocação de carbono para o caule principal, reduzindo a relação folha/caule. Plântulas de regiões mais úmidas não alteram sua morfologia ou a alocação de carbono em resposta às limitações de água. Elas continuam o crescimento apical e iniciam a formação de gemas axilares nos nós superiores (Gibson et al., 1995).

Dentre os vários mecanismos de resposta ao estresse hídrico estão as alterações do metabolismo celular. Isto parece ser o resultado do acúmulo de solutos e de proteínas que podem ser rapidamente induzidas pelo estresse osmótico para prevenir a perda de água e reestabelecer a turgescência das células (Rhodes, 1987). Singh et al.(1989) identificaram uma proteína de 24 quilodaltons (kDa) em tabaco, denominada osmotina, relacionada à adaptação ao estresse osmótico. Pelah et al. (1995) identificaram uma nova proteína de 66 kDa em Populus tremula, estável à ebulição, que se expressava em resposta a um gradual estresse hídrico.

Desta forma, o presente trabalho visa fornecer subsídios e incrementar o processo de seleção e propagação vegetativa através de novas informações, obtidas com o emprego da tecnologia da cultura de tecidos a respeito do comportamento morfológico e fisiológico da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS

Para o início do cultivo in vitro, utilizou-se sementes de 6 progênies (p1...p6) de E. camaldulensis provenientes de matrizes da Estação Experimental de Anhembi - SP, com distintas procedências australianas que variam num gradiente climático de umidade: Gilbert River, p1 e p2, (semi-árido, latitude 17.10' e longitude 141.45'), S. Katherine, p3 e p4, (tropical seco, lat. 14.30' e long. 132.15') e Petford, p5 e p6, (tropical úmido, lat. 17.20'e long. 144.58').

• Ensaios realizados :

a) Avaliação da taxa de germinação sob estresse hídrico

Sementes aleatoriamente escolhidas de uma amostra foram dispostas em placas de petri para germinar com soluções aquosas de sorbitol apresentando potenciais osmóticos de: 0; -0,5; -0,75; -1,5 e -3,0 MPa, em fotoperíodo de 16h. Para cada situação, foram avaliadas 100 sementes distribuidas em 5 placas de petri, onde se calculou a porcentagem de germinação.

b) Obtenção de gemas assépticas

Sementes foram desinfestadas em solução de 2% NaOCl comercial por 20 minutos e lavadas em água destilada estéril, sendo inoculadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962). Hipocótilos de plantas com 28 dias foram inoculados em meio de cultura MS suplementado com 2mg/l de BA (6-benzilaminopurina) para o início da propagação vegetativa via indução de gemas. Após 60 dias de cultura à temperatura de 25°C, intensidade luminosa de 1600 lux e fotoperíodo de 16h, o material foi transferido para o meio de cultura JADS (Correia, 1993) pois apresentava sintomas de deficiência nutricional, permanecendo cerca de mais 60 dias em meio de multiplicação com repicagens a cada 20 dias aproximadamente.

c) Teste de resistência ao estresse hídrico in vitro

Cerca de 15 gemas de 0,5-1,0 cm de comprimento, formando um nó epicórmico, foram inoculadas em meio de cultura MS com 30g de sacarose em diferentes potenciais osmóticos obtidos a partir da adição de diferentes concentrações de sorbitol (100 mM, 400 mM e 1000 mM) atingindo potenciais em torno de -0,75; -1,5 e -3,0 MPa, sendo a testemunha submetida ao potencial osmótico de - 0,5 MPa, sem adição de sorbitol. A alteração do potencial osmótico (p) do meio de cultura foi determinado através do método de Volume Constante (Salisbury & Ross, 1969). O material permaneceu durante 20 dias nestas condições, sendo a seguir avaliado através da variação de altura, peso da matéria seca produzida e porcentagem de matéria seca.

d) Avaliação de proteínas totais

Para a análise de proteínas totais 300 mg de material de cada tratamento foram macerados numa solução de extração na proporção 1:10 contendo 4 mL de TRIS-HCl pH 6-8, 1.6 mL de 2-mercaptoetanol, 6.4 mL de SDS 10%, 3.2 mL de DMSO 2%, 3.5 g de PVPP, 0.35 g de PMSF, 6.4 mL de glicerina, 10.4 mL de água deionizada. A mistura permaneceu em repouso por 1 h a temperatura ambiente, a seguir mantida em ponto de ebulição por 3 minutos. A mistura foi centrifugada a 10.000 rpm, o sobrenadante foi recolhido para a quatificação de proteínas de acordo com Bradford (1976) e para a eletroforese.

O extrato de proteínas foi separado em um gel de poliacrilamida (PAGE) com 20% de SDS durante 3 horas a 35 mA. Foram utilizados 50 mg de proteína por faixa de corrida.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

a) Avaliação do crescimento

Os resultados sobre as porcentagens de germinação das sementes, sob condições de estresse hídrico, mostram uma inibição da germinação a partir do potencial osmótico - 0.75 MPa, sendo totalmente inibida em - 1.5 MPa (TABELA 1).

Nas TABELAS 2, 3 e 4, pode-se observar os resultados obtidos com a variação do potencial osmótico do meio de cultura em relação a porcentagem de água na planta, peso da matéria seca produzida e altura entre as diferentes progênies.

Estes resultados sugerem que a estratégia inicial de resistência ao estresse hídrico se encontra nos estágios de desenvolvimento e crescimento das plântulas, uma vez que as sementes tem sua germinação inibida.

O crescimento das gemas, em geral, apresentou um gradiente de vigor inverso ao aumento da deficiência hídrica, constatando-se também uma maior liberação de fenóis nos meios com maior deficiência hídrica, apontado pelo nítido escurecimento do meio (Figura 1).

Figura 1
- Fotografia de um gradiente padrão de ramos epicórmicos de E. camaldulensis sob estresse hídrico in vitro aos 20 dias de cultivo.

Apesar das diferentes progênies apresentarem variações nas respostas em relação a porcentagem de água nas plantas, não ficou claro se houve ou não influência das condições ambientais para as distintas procedências em relação a capacidade de respostas ao estresse hídrico induzido in vitro . O mesmo aconteceu em relação ao peso da matéria seca produzida pelas diferentes progênies. Entretanto, pode-se observar uma nítida tendência à redução do conteúdo de água nas plantas, que foi acompanhada pelo aumento do peso da matéria seca produzida até o potencial osmótico de -1,5 MPa.

A redução constante da porcentagem de água nas plantas é naturalmente explicada pela retirada de água dos tecidos, em função da redução do potencial osmótico do meio de cultura, isto é, ocorre uma inversão da direção do fluxo de água. Em relação ao aumento do peso seco das gemas, como resposta inicial ao estresse hídrico, Tanguilig et al. (1987) apontam este aumento como um possível mecanismo adaptativo ao estresse hídrico. Já em relação ao crescimento em altura, houve uma nítida redução em função da diminuição do potencial osmótico no meio de cultura.

Com os resultados apresentados, pode-se considerar a redução da porcentagem de água nas plantas, bem como a diminuição da dominância apical, em função da diminuição do comprimento das plântulas, como respostas constantes ao estresse hídrico. Já o peso da matéria seca produzida, de forma geral, sofre uma redução em situações mais desfavoráveis, apesar do aumento inicial como resposta à deficiência hídrica.

Deve-se destacar neste trabalho, que em nenhuma situação as gemas possuiam sistema radicular desenvolvido, desta forma, os resultados apresentados restringen-se a situação de cultivo in vitro, porém indicando claras formas de resposta à deficiência hídrica.

b) Avaliação das proteínas totais

Foram identificadas duas proteínas de resposta de 45 e 36 kDa sensíveis ao gradiente de deficiência hídrica nas três procedências. Entretanto, a expressão destas proteínas se dá de forma diferenciada entre as procedências (Figura 2).

Figura 2
- Esquema do SDS-PAGE do E. camaldulensis sob deficiência hídrica (MPa) in vitro após 20 dias de cultivo.

As proteínas expressaram-se de forma mais intensa primeiramente na procedência de Gilbert River logo no potencial osmótico de -0.75 MPa, o que pode corresponder a uma resposta adaptativa mais rápida uma vez que esta procedência é original de uma região onde a deficiência hídrica é frequente. Tal expressão se dá de forma mais clara nas procedências de Petford e St. Katherine apenas a partir do potencial osmótico de - 1.5 MPa. A expressão das proteínas tende a aumentar nos potenciais menores em Gilbert River e St. Katherine, enquanto que em Petford pode-se observar uma redução no potencial osmótico de -3.0 MPa.

De acordo com a quantificação das amostras de proteínas segundo o método Bradford (1976), a quantidade de proteínas totais sintetizadas mostrou uma tendência a aumentar em função da redução do potencial osmótico entre as três procedências, ao contrário do observado na literatura (Levitt, 1972; Rhodes, 1987). Este dado está relacionado com o aumento observado de matéria seca das gemas em função do aumento de deficiência hídrica no meio de cultura.

CONCLUSÕES

A técnica de cultura de tecidos como instrumento para avaliação do crescimento incial e pré-seleção das plântulas mostrou-se eficiente pela detecção de padrões gerais de comportamento ao estresse hídrico, como o aumento da produção de matéria seca e a redução da dominância apical em relacão a redução do potencial osmótico do meio de cultura.

Em geral, não foi possível fazer uma nítida distinção do comportamento de cada procedência nas diferentes condições de estresse hídrico, exceto para as procedências submetidas ao teste de autotrofia. Por outro lado, estas distinções foram claras em observações de plantas de maior idade no campo, como relatam Barros et al (1990), Gibson et al. (1994;1995).

Os resultados indicam que uma redução do potencial osmótico do meio de cultura (-0.75 a -1.5 MPa) pode favorecer a multiplicação do material in vitro, uma vez que estas condições desfavoreceram a dominância apical e aumentaram a produção de matéria seca, e que, o meio de cultura JADS (Correia, 1993) forneceu em suprimento nutricional mais adequado.

Como indica a literatura (Barros et al., 1990), a estratégia comum de resistência à deficiência hídrica é a parada do crescimento, porém, como apontaram os resultados deste trabalho, a parada do crescimento em altura não foi acompanhada pela parada da produção de matéria seca até um certo limite, principalmente para determinadas progênies.

Os resultados obtidos evidenciaram que ocorrem variações no metabolismo entre distintas procedências de E. camaldulensis em relação aos difrentes níveis de deficiência hídrica, embora ocorra a presença das mesmas proteínas de resposta nas três procedências.

AGRADECIMENTO

Este trabalho recebeu apoio da FAPESP- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.

Recebido para publicação em 11.05.98

Aceito para publicação em 18.08.98

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Set 1999
• Data do Fascículo
  Jul 1999

Histórico

• Aceito
  18 Ago 1998
• Recebido
  11 Maio 1998