Fungos associados à podridão pós-colheita pertencentes à família Botryosphaeriaceae em abacate

Fungi associated with post-harvest rot belonging to Botryosphaeriaceae family in avocado

RESUMO

O presente trabalho teve o objetivo de identificar espécies de Botryosphaeriaceae associadas à podridão pós-colheita em abacates ‘Hass’ provenientes dos Estados de São Paulo e Minas Gerais. Quarenta isolados foram submetidos à caracterizações: cultural, morfológica, patogênica e filogenética. A caracterização cultural e morfológica foi avaliada em meio de cultura, sob temperatura de 25ºC; a patogenicidade foi avaliada através do diâmetro de lesões em abacates inoculados com discos de micélio; e a caracterização filogenética se deu a partir das regiões ITS e Alfa elongase. Todos os isolados apresentaram colônias com micélio aéreo, cotonoso e de coloração preta a partir do nono dia de crescimento. Os conídios apresentaram formato fusiforme, colocação hialina, parede fina, geralmente asseptados ou pendendo a apresentar septos quando maduros. Diferenças entre os isolados foram observadas para os parâmetros crescimento micelial, tamanho dos conídios e diâmetro de lesões em frutos inoculados. Na caracterização filogenética foram identificadas três espécies pertencentes ao gênero Neofusicoccum: trinta e oito isolados pertencentes a espécie N. parvum, um de N. ribis e um de N. umdonicola, sendo este último a primeira vez sendo relatado em abacate no Brasil. Estas informações podem colaborar no processo de quarentena e nas estratégias de manejo destes patógenos.

Palavras-chave
identificação; fungos; Neofusicoccum ; Persea americana

ABSTRACT

The present study aimed to identify Botryosphaeriaceae species associated with post-harvest rot in ‘Hass’ avocados from São Paulo and Minas Gerais States, Brazil. Forty isolates underwent the following types of characterization: cultural, morphological, pathogenic and phylogenetic. Cultural and morphological characterization was evaluated on culture medium, at a temperature of 25ºC; pathogencity was assessed based on the diameter of lesions in avocados inoculated with mycelial disks, and phylogenetic characterization was carried out from ITS and alpha-elongase regions. All isolates showed colonies with aerial, cottony mycelium of black coloration from the ninth day of growth. Conidia were fusiform, hyaline, of thin wall, generally aseptate, or tending to be septate when mature. There were differences between isolates for the parameters mycelial growth, conidial size and lesion diameter in inoculated fruits. In the phylogenetic characterization, three species belonging to the genus Neofusicoccum were identified: thirtyeight isolates belonging to the species N. parvum, one to N. ribis and one to N. umdonicola, the latter being reported for the first time in avocado in Brazil. These data can collaborate with the quarantine process and with the management strategies for such pathogens.

Palavras-chave
identificação; fungos; Neofusicoccum ; Persea americana

O cultivo de abacate (Persea americana Mill.) tem sido impulsionado nos últimos anos por conta do ritmo crescente da sua exportação. Atualmente, é considerado um nicho de mercado que auxilia no déficit da produção de outras frutíferas (¹). Devido a isso, houve um aumento expressivo na produção nacional de abacate, que em 2013, era de 94.294 toneladas passando para 180.636 toneladas em 2016, demonstrando um crescente aumento dos investimentos nesse ramo de produção (¹, ⁷). A região sudeste do país é a maior produtora e responsável por quase toda a produção nacional, tendo o estado de São Paulo o maior destaque (¹).

Os frutos de abacate são altamente perecíveis e podem ter sua qualidade comprometida pela ocorrência de pragas, doenças e por ferimentos decorrentes do manejo inadequado na colheita, transporte e armazenamento, dificultando a sua comercialização (⁴). Neste contexto as doenças pós-colheita são importantes e inviabilizam a venda do produto final (¹⁷). Dentre os patógenos pós-colheita do abacate, encontram-se os fungos da família Botryosphaeriaceae, responsáveis pelas podridões pedunculares. Em estudo com abacates ‘Hass’ produzidos em São Paulo, a incidência de frutos com podridões pedunculares por Botryosphaeriaceae alcançou 18,4% (⁹). Esses fungos portam uma característica particular que dificulta o seu controle: são micro-organismos endofíticos que podem se tornar fitopatogênicos caso o hospedeiro seja submetido à condição de estresse (⁹, ²⁴). Além de possuírem uma ampla distribuição geográfica e vasta gama de hospedeiros, esses micro-organismos têm capacidade de infectar múltiplas espécies de plantas, aumentando a possibilidade de invasão a novas áreas do globo, o que pode gerar incontáveis prejuízos econômicos e ecológicos (¹¹, ²⁴).

Portanto, o entendimento da biologia, dispersão e diversidade desse grupo é de fundamental valia somado ao desenvolvimento de técnicas capazes de identificar espécies de Botryosphaeriaceae. Esses dados podem auxiliar no processo de quarentena, impedindo sua dispersão e, possivelmente, estratégias de manejo poderão ser desenvolvidas no combate a esse patógeno (²⁵).

Diante do que foi exposto, o presente trabalho teve como objetivo identificar as espécies de Botryosphaeriaceae associadas à podridão peduncular do abacate a partir de isolados oriundos de plantações de abacate localizadas nos estados de São Paulo e Minas Gerais.

MATERIAL E MÉTODOS

Os frutos de abacate “Hass” foram obtidos de um “packinghouse” comercial, localizado na cidade de Bauru-SP. Quarenta isolados de fungos da família Botryosphaeriaceae foram provenientes de onze cidades: Bauru-SP (⁶), Bernardino de Campos-SP (⁷), Itaberá-SP (³), Ipaussu-SP (³), Jardinópolis-SP (²), Jaú-SP (⁷), Olímpia-SP (²), Piraju-SP (²), Rio Paranaíba-MG (²), Timburi-SP (⁵) e Tupã-SP (¹) (Figura 1).

Figura 1
Identificação e local de origem dos isolados de espécies de Botryosphaeriaceae de abacate.

Para o isolamento dos fungos os abacates previamente coletados foram submetidos a câmara úmida durante 24 horas, posteriormente permaneceram durante 14 dias a 25 ºC em umidade relativa (UR) entre 70 – 75% até que os sintomas fossem evidentes, posteriormente foi realizado o isolamento dos fungos relacionados aos sintomas de podridões de abacates em meio de cultura Batata Dextrose Ágar (BDA).

Na caracterização cultural foram avaliadas: crescimento micelial diário e coloração micelial baseando-se na metodologia descrita por Phillips (¹⁶) e Slippers et al. (²¹).

Além disso, foi avaliada a morfologia de 50 conídios por isolado e, para tal determinou-se o tamanho, formato e cor dos esporos que se desenvolveram em placas contendo o meio Extrato de Malte Ágar (EMA) e mantidas a 25 ºC durante 60 dias.

A patogenicidade dos isolados foi determinada por meio de inoculação de discos de micélios cultivados em meio BDA, durante cinco dias a 25±1 ºC, em frutos sadios de abacate ‘Hass’ que foram lavados e desinfestados com hipoclorito de sódio (1%) e secos a temperatura ambiente. A incubação dos frutos foi realizada no escuro com UR de 70-75% durante 4 dias e, ao final do experimento, foram mensurados os diâmetros perpendiculares das lesões.

Na identificação dos isolados, foi realizada a extração de DNA seguida da reação em cadeia da polimerase (PCR) e, por fim, o sequenciamento dos fragmentos previamente obtidos.

Para a extração de DNA, massas miceliais de cada isolado foram raspadas da superfície de meio de cultura BDA mantido durante cinco dias a 25 ºC em fotoperíodo alternado de 12 horas. A extração de DNA seguiu o protocolo proposto por Murray & Thompson (¹²) com algumas modificações.

O DNA genômico extraído foi utilizado como molde para a amplificação de partes de duas regiões: ITS-5.8S rDNA (ITS), utilizando oligonucleotídeos iniciadores ITS1 e ITS4 (27) e a região gênica alfa-elongase por meio do par de primers TEF1-728F e TEF1-986R (³).

Os fragmentos de DNA amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2,0% contendo tris borato EDTA 1X, corado com brometo de etídio e observados sob luz UV. As análises de sequenciamento foram realizadas no Centro de Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP) com 100µL do produto da PCR previamente purificado com o kit “SV Gel and PCR Clean UP system” (Promega^®).

As sequências obtidas foram editadas por meio do software BioEdit Sequence Aligment Editor (1997-2017) sendo utilizadas como moldes na procura de sequências similares pelo software Blastn pertencente ao NCBI (National Center for Biotechnological Information).

As sequências previamente editadas foram alinhadas no software Mega 5.05 (26). Somado a respectivamente 24 e 26 sequências, ITS e Alfa elongase, de espécies pertencentes à família Botryosphaeriaceae previamente depositadas no GenBank também foram incluídas nas avaliações filogenéticas (¹²)

A filogenia foi realizada por meio do método “Neighbor-Joining” (²⁰). A árvore consenso foi inferida a partir de 10.000 repetições de “bootstrap”, tendo as suas distâncias evolutivas calculadas utilizando o método Jukes-Cantor (¹⁰).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na caracterização cultural todas as colônias apresentaram micélio aéreo, cotonoso e, inicialmente, de coloração branca. A partir do terceiro dia de crescimento houve mudança de cor se tornando acinzentada. No nono dia foi possível observar uma nova alteração na coloração da colônia, que passou de cinza para preta. Os isolados apresentaram diferenças significativas quanto ao crescimento micelial, sendo separados em quatro grupos (Figura 2). Comparando as amostras que resultaram no menor crescimento houve um predomínio das originárias de Bauru (FUS4, FUS 5, FUS 33, FUS 3, FUS 1, FUS 24 e FUS 36). Para as amostras que apresentaram maior crescimento, notou-se que aquelas provenientes de Jaú foram maioria (FUS 65, FUS 68 e FUS 72).

Figura 2
Crescimento micelial (cm/dia*) dos isolados de espécies de Botryosphaeriaceae de abacate.

No tocante a morfologia, somente os isolados FUS 68 e FUS 72 não esporularam sobre o meio de cultura MEA. Os outros isolados produziram conídios hialinos, de parede fina, geralmente asseptados ou pendendo a apresentar septos quando maduros e fusiformes. Quanto ao tamanho foi observada ampla variação entre os isolados, com o comprimento médio variando de 9,56 μm a 13,83 μm; a largura média entre 6,43 μm a 12,48 μm e a relação comprimento e largura entre 0,85 μm a 1,73 μm. A ocorrência de picnídios em meio de cultura foi observada em 53% dos isolados (Tabela 1).

Tabela 1
Dimensões dos conídios dos isolados de dos isolados de espécies de Botryosphaeriaceae.

Isolado	Dimensões (µm)				Picnídeos
	Comprimento		Largura
CV	10,45		18,88		-
FUS 1	11,13	b	8,78	b	ausente
FUS 2	9,56	a	6,43	a	ausente
FUS 3	10,74	b	8,00	b	presente
FUS 4	10,34	a	11,13	d	ausente
FUS 5	11,13	b	11,03	d	ausente
FUS 6	9,95	a	8,39	b	ausente
FUS 13	11,13	b	10,05	c	presente
FUS 15	10,34	b	9,96	c	ausente
FUS 17	11,13	b	9,17	c	presente
FUS 20	11,67	b	10,35	c	presente
FUS 21	11,40	b	10,23	c	presente
FUS 23	11,67	b	10,35	c	ausente
FUS 24	11,13	b	9,96	c	ausente
FUS 25	11,94	b	11,64	d	presente
FUS 26	11,13	b	9,96	c	ausente
FUS 27	11,40	b	11,13	d	ausente
FUS 28	13,29	d	10,74	d	presente
FUS 29	9,57	b	11,28	c	presente
FUS 31	11,13	b	9,17	b	ausente
FUS 32	11,29	d	10,74	d	presente
FUS 33	11,13	b	6,82	a	presente
FUS 34	11,13	b	11,13	d	ausente
FUS 35	11,13	b	9,57	c	presente
FUS 36	11,13	b	8,39	b	presente
FUS 37	11,40	b	11,13	d	presente
FUS 38	11,40	b	9,57	c	presente
FUS 39	11,40	b	8,00	b	presente
FUS 40	12,21	c	11,13	d	presente
FUS 41	13,51	d	12,48	d	presente
FUS 42	11,13	b	11,13	d	ausente
FUS 43	11,13	b	8,00	b	ausente
FUS 45	12,63	c	11,13	d	ausente
FUS 46	11,67	b	7,60	b	ausente
FUS 51	13,14	d	9,74	c	ausente
FUS 52	13,83	d	11,13	d	presente
FUS 65	13,29	d	11,67	d	presente
FUS 76	11,40	b	9,96	c	ausente
FUS 79	11,13	b	6,43	a	presente

• ^*
  As medias seguidas pelas mesmas letras na coluna não diferem entre si, pelo teste Scott Knott 5%.

Os isolados FUS 34, FUS 68 e FUS 72, não causaram lesão quando inoculados nos frutos de abacate, isso pode ter ocorrido devido à variedade dos frutos usados no teste. Todos os outros isolados se mostraram patogênicos (Figura 3) e, assim como o crescimento micelial e o tamanho dos conídios, foram observadas diferenças no diâmetro de lesões entre isolados. Entretanto, percebe-se que o isolado FUS 37, oriundo de Jaú-SP, ocasionou menor lesão. Em todos os casos, um dia após a inoculação dos micro-organismos já se observava o desenvolvimento de lesão, sendo que, no quarto dia, o fruto estava tomado pelo fungo.

Figura 3
Diâmetro de lesões (cm/dia*) dos isolados de espécies de Botryosphaeriaceae de abacate quatro dias após a inoculação em abacate.

A partir do sequenciamento da região ITS de 38 isolados foi possível verificar que 95% das amostras pertenciam à espécie N. parvum. Neste sentido, a amostra FUS 29 foi identificada como N. ribis e a FUS 4 como N. umdonicola. Salienta-se que esse foi o primeiro relato de N. umdonicola como agente causal de podridão pós-colheita em abacate no Brasil. Outras espécies de Neofusicoccum já foram relatadas causando podridão em abacate, como N. luteum na Califórnia (¹⁹) e N. mangiferae em Taiwan (¹⁴). O sequenciamento desta região somente não possibilitou a identificação do isolado FUS 52, possivelmente devido a qualidade do DNA deste. Porém, este isolado foi identificado posteriormente pelo sequencimento de parte da região da α-elongase.

Com base na árvore filogenética da região ITS houve a formação de 12 clados com agrupamento dos isolados de acordo com a espécie. Por isso, dos 40 isolados obtidos a partir desse estudo, 38 foram agrupados no clado (I), como N. parvum; 1 isolado (FUS04) reside no clado (II), identificado como N. umdonicola (Figura 4) e outro isolado (FUS29) foi posicionado no clado (III), como N. ribis, contudo, quando suas sequências foram comparadas no programa Blast do NCBI, a similaridade gerada foi de 99% para Neofusicoccum sp., N. umdonicola e N. ribis, justificando sua posição na árvore.

Figura 4
Árvore filogenética dos isolados de Botryosphaeriaceae (FUS) com base na região ITS-5.8S rDNA.

Somente sete isolados não foram amplificados com os oligonucleotídeos utilizados para a região da α-elongase. Deste modo, com base nos 33 isolados, as analises filogenéticas desta região mostram a formação de três clados: (I) N. umdonicola (FUS 04); (II) N. parvum (31 isolados) e (III) N. ribis (FUS 29). Os dados da árvore filogenética dessa região (Figura 5) corroboraram com os dados da filogenia realizada com base na região do ITS (Figura 4). As análises moleculares das regiões ITS e alfa elongase foram suficientes para o distanciamento de espécies do complexo N. parvum do complexo N. ribis. Apesar de muitos autores utilizarem até cinco genes para a completa separação dessas espécies, existem trabalhos que afirmaram que com o uso da região ITS já ocorre uma clara separação entre as espécies encontradas na presente pesquisa (¹⁶, ²¹).

Figura 5
Árvore filogenética dos isolados de Botryosphaeriaceae (FUS) com base na região da α- elongase

Em função do predomínio de N. parvum, com a detecção de apenas um isolado das espécies N. umdonicola e N. ribis, oriundos de Bauru e Jardinópolis-SP, respectivamente, não se pode correlacionar as variáveis localização geográfica, crescimento micelial, tamanho dos conídios, diâmetro de lesões e a filogenia entre as três espécies encontradas. Em adição, trata-se de um complexo de espécies com morfologias dificilmente distinguíveis. Segundo Crous et al. (⁵), alguns desses complexos são considerados sem distinção morfológica dependendo unicamente de dados baseados na região ITS sozinhos ou associados com outros loci para a identificação inequívoca das espécies. Atualmente, as características morfológicas não têm mais credibilidade na distinção entre essas espécies devido à similaridade entre elas (²⁵). Sendo assim, os conídios não apresentaram diferenças nas suas características, assim como em suas dimensões, não permitindo conclusões relacionadas às espécies encontradas. No entanto, o tempo de cultivo foi muito maior se confrontado com trabalho anterior (¹²). Se comparadas a outros estudos, as dimensões conidiais se mostraram menores. Esse fato que pode ser relacionado ao tempo de desenvolvimento dessa estrutura que em um mesmo isolado variaram consideravelmente (²²). Além disso, os dois isolados caracterizados com uma espécie diferente de N. parvum (FUS 4, FUS 29) entremeiam as taxas de crescimento que agrupam estatisticamente os indivíduos representados.

A variação no comprimento das lesões de N. parvum refletem um alto grau na variabilidade genética desses organismos, que somado a grande pressão ambiental sofrida pela comunidade de plantas resultam em estresse e maior facilidade no desenvolvimento da doença. Sendo a variação genética intrinsecamente ligada ao controle do patógeno em campo.

O estudo filogenético demonstrou superioridade de N. parvum dentro do gênero e indo de encontro a especiação de N. ribis e N. umdonicola. Essa dominância pode ser ocasionada por ser um patógeno adaptado a diferentes condições ambientais e hospedeiros, com ampla dispersão e alta variabilidade genética, inibindo a disseminação de outras espécies. N. parvum foi classificado como patógeno generalista, presente em diferentes climas e com aproximadamente 90 espécies hospedeiras conhecidas (²¹). Alem disso, é frequentemente relacionado em áreas ambientalmente degradadas e dificilmente são encontradas em ambientes não afetados, onde outras espécies desse complexo têm predominância (¹¹, ¹⁶).

Casos de variabilidade genética já foram relatados em isolados de N. parvum em vinhedos localizados na Nova Zelândia, tendo sugerido estudos específicos que correlacionem a diversidade genética à virulência desse gênero. Além disso, a relação das condições ambientais no desenvolvimento de áreas infectadas é amplamente discutida pela comunidade cientifica (², ⁵, ²⁵). Dá-se então que o seu padrão de distribuição está relacionado a múltiplas introduções devido às atividades humanas via transferência de germoplasma por meio de práticas agrícolas e de horticultura (²¹).

Apesar do padrão de distribuição desses micro-organismos serem amplamente estudado pouco se sabe sobre a biologia do patógeno e introdução da doença em campo.

Por isso, a relação entre planta – patógeno, a patogenicidade sob condições de estresse e o reconhecimento do fungo no seu estado endofítico precisam ser respondidas para que o manejo ou até mesmo o controle da doença em campo possam ser aperfeiçoados (²⁵).

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer a FAPESP (Proc. 2014/11897-4) pelo suporte financeiro e a compania Jaguacy Brasil Comercio de Frutas Ltda pela colaboração para que esses experimentos se tornassem possíveis.

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Editado por

• Editor associado para este artigo:
  Rita de Cassia Panizzi

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Jul 2025
• Data do Fascículo
  2025

Histórico

• Recebido
  04 Maio 2021
• Aceito
  20 Abr 2023