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Arquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia

On-line version ISSN 1677-9487

Arq Bras Endocrinol Metab vol.53 no.7 São Paulo Oct. 2009

https://doi.org/10.1590/S0004-27302009000700003 

ARTIGO ORIGINAL

 

Contribuição da análise de textura do núcleo celular para o diagnóstico diferencial de lesões foliculares da tireoide: comparação com marcadores imunoistoquímicos

 

Contribution of nuclear texture analysis for the differential diagnosis of follicular lesions of the thyroid: comparison to immunohistochemical markers

 

 

Rita C. FerreiraI; Laura S. WardII; Randall L. AdamIII; Neucimar J. LeiteIII; Konradin MetzeI; Patrícia S. de MatosI

IDepartamento de Anatomia Patológica, Faculdade de Ciências Médicas (FCM), Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP, Brasil
IIDepartamento de Clínica Médica, FCM, Unicamp, Campinas, SP, Brasil
IIIInstituto de Computação, Unicamp, Campinas, SP, Brasil

Correspondência para

 

 


RESUMO

OBJETIVO E MÉTODOS: Com o propósito de investigar a contribuição do exame da cromatina nuclear no diagnóstico diferencial das lesões foliculares da glândula tireoide, foram estudadas 76 amostras previamente submetidas à análise de expressão proteica de HBME-1, CK-19 e galectina-3.
RESULTADOS: HBME-1 confirmou-se como o mais sensível marcador imunoistoquímico de malignidade. Uma série de variáveis morfométricas, densitométricas e de textura foram úteis na distinção entre os diferentes tipos de lesão folicular. Entre essas variáveis, o r2, parâmetro relacionado à granularidade do núcleo, apresentou a melhor acurácia, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo, diferenciando lesões benignas de malignas.
CONCLUSÃO: A morfometria analítica de imagem da cromatina nuclear pode acrescentar acurácia ao diagnóstico diferencial das lesões de padrão folicular.

Descritores: Tireoide; diagnóstico diferencial; imunoistoquímica; cromatina


ABSTRACT

OBJECTIVE AND METHODS: To investigate the utility of nuclear chromatin texture assessment in the differential diagnosis of follicular patterned lesions, by means of examining 76 samples previously submitted to the immunohistochemical protein analysis of HBME-1, CK-19 and galectina-3.
RESULTS: HBME-1 confirmed to be the most sensitive marker of malignancy. A series of morphometric, densitometric and texture variables were useful in the discrimination of the different types of follicular lesions. Among these variables, r2, a parameter related to the granularity of the nucleus presented the best accuracy, sensitivity, specificity and positive and negative predictive values, distinguishing benign from malignant lesions.
CONCLUSION: The morphometric analysis of nuclear chromatin images may add accuracy to the differential diagnosis of follicular patterned lesions.

Keywords: Thyroid; differential diagnosis; immunohistochemistry; chromatin


 

 

INTRODUÇÃO

O diagnóstico diferencial entre algumas lesões da tireoide é, muitas vezes, difícil, mesmo diante de amplas amostras do tecido. Em particular, o chamado "padrão folicular", um grupo que inclui nódulos adenomatosos ou hiperplásicos, adenomas foliculares, carcinomas foliculares e variantes foliculares dos carcinomas papilíferos, pode causar dificuldades diagnósticas mesmo aos patologistas mais experientes (1). Por outro lado, um diagnóstico histopatológico preciso é essencial para o planejamento clínico e cirúrgico e consequente prognóstico do paciente (2,3). Métodos diagnósticos adicionais podem diminuir a ampla variação inter e intraobservador do exame anatomopatológico, otimizando a decisão terapêutica (1).

Muitos marcadores de malignidade têm sido investigados, mas todos apresentam alguma desvantagem ou alguma limitação (4,5). Galectina-3, HBME-1 (Hector Battifora Mesothelial cell) e citoqueratina-19 (CK-19) são os mais frequentemente utilizados na prática. Galectina-3 foi descrito como o mais sensível marcador diagnóstico para identificação pré-operatória de carcinomas da tireoide, com alta sensibilidade e especificidade em amostras histológicas e citológicas (6). Infelizmente, vários estudos imunoistoquímicos e moleculares não foram capazes de provar a utilidade da galectina-3 no padrão folicular, já que foi demonstrada sua expressão em tecidos tireoideanos normais e também nas lesões benignas (7-9). O HBME-1 foi descrito como útil no diagnóstico de tumores foliculares (10-12). Infelizmente, o HBME-1 parece se expressar com menor intensidade em lesões com células de Hürthle ou alterações apócrinas, frequentes nas lesões foliculares (12). Um terceiro marcador, CK-19, também pode ser útil no diagnóstico da variante folicular do carcinoma papilífero por sua forte e difusa positividade citoplasmática (13). No entanto, nosso grupo, e outros, demonstrou que esses três marcadores têm sensibilidade e especificidade limitadas, mesmo quando usados em conjunto (14,15).

Estudos de morfometria nuclear vêm sendo empregados há mais de 20 anos no sentido de conferir maior precisão ao diagnóstico anatomopatológico quantificando objetivamente características morfológicas (16-18). Vários estudos morfonucleares por análise de imagem digital têm sido aplicados para análise do aspecto nuclear e do padrão de distribuição de cromatina em diversas neoplasias, incluindo tireoidianas (19-22). Como alterações do metabolismo celular influem diretamente na distribuição da cromatina, o estudo da textura nuclear permite detectar pequenas alterações que não são óbvias ao olho humano (23-26). Um estudo preliminar de nosso grupo sugeriu que alguns parâmetros morfométricos poderiam auxiliar no diagnóstico diferencial de lesões foliculares (16).

O presente estudo teve como objetivo ampliar o estudo anterior, verificando a utilidade da análise de imagem computadorizada na discriminação entre lesões foliculares benignas e malignas da tireoide e comparar os resultados àqueles obtidos por meio de estudo imunoistoquímico com os marcadores HBME-1, galectina-3 e CK-19.

 

MÉTODOS

Foram selecionados 76 blocos de lesões de padrão folicular da glândula tireoide incluindo 12 nódulos adenomatosos (NA), 18 adenomas foliculares (AF), 24 carcinomas foliculares minimamente invasores (CFMI) e 22 variantes foliculares do carcinoma papilífero (VFCP), todos previamente estudados por imunoistoquímica com galectina-3, HBME-1 e CK-19 (14).

A digitalização das imagens foi realizada com o auxílio do fotomicroscópio Axiophot para campo claro, contraste e epifluorescência (Carl Zeiss), com a objetiva de 100 aumentos Achroplan de imersão em óleo, acoplado ao sistema de câmara Axiophot e ao software para aquisição de imagens KS-300. A análise de imagem digitalizada foi realizada após a aquisição de 100 núcleos da periferia da lesão (somando um total de 7600 nú-cleos). Cada imagem nuclear foi submetida à segmentação semi-interativa. Foram adquiridos nú-cleos sem sobreposição de qualquer estrutura, por exemplo, de outros núcleos. As imagens foram capturadas no foco em que a maior parte dos contornos nucleares estava nítida e somente foram adquiridos núcleos de células identificadas como foliculares, desprezando-se quaisquer outras, como exemplificado nas figuras 1 e 2. Considerando-se que a imagem digital de um núcleo é composta por pixels com graus de cinza formando um padrão, a textura nuclear depende da relação espacial de cada pixel com os pixels vizinhos, podendo-se utilizar modelos matemáticos para a sua avaliação (21). Com auxílio de um software, os núcleos segmentados foram transformados em imagens com diferentes graus de cinza (0 a 255).

 

 

 

 

Avaliaram-se três grupos de variáveis na textura de cada núcleo: descritores morfométricos; densitométricos clássicos e descritores de matriz de coocorrência, incluindo a dimensão fractal e o seu "goodness of fit". Esses parâmetros foram comparados às expressões quantificadas de acordo com o número de células e a intensidade da coloração imunoistoquímica das proteínas HBME-1, CK-19 e galectina-3, conforme anteriormente descrito (14).

O equipamento utilizado e o software correspondente pertencem ao Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, local onde o trabalho foi realizado.

Variáveis morfométricas

Entre os descritores morfométricos, o fator de forma (FF) nos permite avaliar quão próxima a forma do contorno da imagem segmentada é da circunferência. Avalia a integridade do núcleo e, quanto mais próximo da forma arredondada, mais o FF se aproxima de 1. Quanto mais distante da forma arredondada (por alongamento ou irregularidade no contorno), mais o fator de forma se torna próximo de zero.

Entre as variáveis morfométricas obtidas da análise de imagem nuclear, utilizou-se o percentil 5 do fator de forma.

Variáveis densitométricas

Estas variáveis analisam quantitativamente a densidade da cromatina nuclear. A relação entre os graus de cinza em uma imagem digital demonstram áreas de baixa, média ou alta condensação da cromatina, o que nos permite avaliar a densidade.

A densidade óptica (DO) é uma variável que se refere à intensidade de luz que é transmitida após sua passagem pelo tecido em relação à intensidade de luz que incide sobre a imagem nuclear. A quantidade de cromatina em qualquer ponto da imagem nuclear é proporcional à densidade óptica.

As variáveis matemáticas utilizadas na análise de variáveis densitométricas incluem o grau de cinza mínimo (GLevMin) e a média da densidade óptica (mDO).

Variáveis de coocorrência

As variáveis derivadas da matriz de coocorrência são calculadas a partir da relação entre os pixels em uma imagem convertida em graus de cinza e descrevem o quanto uma dada possibilidade de relação entre os pixels se repete na imagem (15).

A energia ("Energy") é uma variável que designa regiões de intensa uniformidade nuclear em certos pontos da imagem com relação aos graus de cinza. Assim, quanto menor a uniformidade entre os graus de cinza, menor é a energia, enquanto grande homogeneidade entre os graus de cinza descreve alta energia. Calculou-se o percentil 5 da energia.

Entre os modelos matemáticos que permitiram obter dados das variáveis de coocorrência, utilizou-se o percentil 95 para cálculo da tonalidade (cluster shade) e da proeminência (cluster proeminence) dos agrupamentos. Essas variáveis representam medidas de condensação da cromatina nuclear.

O parâmetro "goodness-of-fit" ou r2, também denominado grau de aproximação da dimensão fractal de Minkowski-Bouligand, avalia o grau de granularidade da imagem nuclear.

Os dados foram comparados por análise de variância (nível de significância α < 0,05) com uso do software WinStat 3.1.

Este trabalho foi desenvolvido após aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas sob parecer n° 388/2005.

 

RESULTADOS

A tabela 1 resume os dados de positividade para os marcadores imunoistoquímicos empregados: HBME-1, CK-19 e galectina-3.

Os resultados mais relevantes selecionados da análise da imagem nuclear são descritos a seguir.

Variáveis morfométricas

A variável P5FF mostrou diferença significativa entre adenoma folicular (AF) e a variante folicular do carcinoma papilífero (VFCP), além de diferenciar o carcinoma folicular minimamente invasivo (CFMI) da VFCP (Gráfico 1).

 

 

Variáveis densitométricas

As variáveis densitométricas estudadas demonstraram diferenças significativas entre nódulo adenomatoso (NA) e AF; AF e CFMI, AF e VFCP, NA e CFMI e entre CFMI e VFCP. Entre todas as variáveis, a média do GLevMin (grau de cinza mínimo), representada no gráfico 2, distingue de forma clara os NA dos AF e os AF das VFCP.

 

 

A média da densidade óptica (mDO) diferenciou NA de AF, e AF de VFCP (Gráfico 3).

 

 

Variáveis de coocorrência

São apresentados, a seguir, gráficos das variáveis derivadas da matriz de coocorrência que melhor discriminaram os grupos de lesões foliculares estudadas. O quinto percentil da "energia" (P5Energy), apresentado no Gráfico 4, aponta diferença significativa entre todos os subgrupos, exceto NA e VFCP, mas representa a variável que obteve o melhor desempenho em discriminar os quatro grupos estudados. O percentil 95 da tonalidade dos agrupamentos (P95CluShade) mostrou diferença significante entre todas as lesões foliculares (Gráfico 5). Observou-se que o percentil 95 da proeminência dos grupamentos (P95CluProem) diferenciou NA e AF, NA e CFMI, AF e VFCP, e CFMI e VFCP (Gráfico 6). A variável r2 mostrou diferença significativa entre NA e CFMI, NA e VFCP, AF e CFMI e entre AF e VFCP (Gráfico 7).

 

 

 

 

 

 

 

 

Não houve relação entre os valores quantificados da imunoistoquímica para qualquer um dos marcadores estudados com as variáveis de textura nuclear analisadas.

A tabela 2 resume a utilidade clínica de todos os parâmetros estudados. Observou-se que os melhores resultados em termos de acurácia, sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e negativo foram obtidos com a marcação com HBME-1 e com a variável morfométrica r2.

 

 

DISCUSSÃO

A popularização da ultrassonografia e da punção aspirativa por agulha fina, métodos simples, de custo relativamente baixo, de ampla disponibilidade e grande sensibilidade, aumentou muito o número de casos suspeitos de câncer de tiroide encaminhados ao patologista (4,5,28). O câncer diferenciado da tiroide é o tumor cuja incidência mais cresceu entre os anos de 1992 e 2002 nos Estados Unidos, particularmente à custa de tumores pequenos, atingindo índice de 6,3% ao ano entre 1997 e 2003 [Surveillance, Epidemiology, and End Results Program (SEER); dados disponíveis no site da American Cancer Society]. Registros nacionais de câncer [Instituto Nacional de Câncer (Inca); dados dos registros de base populacional] e publicações brasileiras mostram que um fenômeno semelhante vem ocorrendo no Brasil.

O diagnóstico anatomopatológico preciso é fundamental para descartar malignidade e também para o planejamento terapêutico e consequente prognóstico do paciente com câncer da tiroide (3,4). Infelizmente, mesmo entre especialistas em patologia tireoidiana, o grau de concordância intra e interobservador beira os 20% nas lesões de padrão folicular (1,29). Assim, ferramentas auxiliares ao diagnóstico, como a imunoistoquímica e a morfometria (16), têm sido buscadas.

Usando lesões previamente estudadas com auxílio da galectina-3, HBME e CK-19, demonstrou-se, no presente estudo, que alguns parâmetros morfométricos que incluem variáveis morfométricas, densitométricas e de coocorrência podem acrescentar precisão ao diagnóstico histopatológico.

Entre as variáveis morfométricas, o FF conseguiu distinguir lesões benignas de malignas (AF e VFCP) e mostrou diferença entre lesões malignas de padrão folicular, como o CFMI e a VFCP. Realmente, o FF se correlaciona com o tamanho e a variação de forma dos núcleos, características essenciais que também podem auxiliar no diagnóstico citológico obtido por punção aspirativa realizada com agulha fina (30).

As variáveis densitométricas foram úteis na distinção entre lesões benignas e malignas, como AF de VFCP. A variável densitométrica mGLevMin (média do grau de cinza mínimo) apresentou diferenças significativas entre lesões benignas e malignas, o que também era esperado, já que essa variável ressalta os aspectos nucleares de distribuição periférica e irregular da cromatina nuclear observados em casos de VFCP, quando se comparam aos núcleos hipercromáticos com cromatina mais densa e uniforme dos AF (30). Outra variável que se destacou nessa análise foi o P5Energy, que se mostrou menor na VFCP, demonstrando que nesta lesão o núcleo tem uma menor organização da cromatina. Pode-se fazer um paralelo com os aspectos identificados à microscopia óptica, na qual a cromatina é "salpicada" e periférica, colaborando para o aspecto nuclear claro da VFCP (14).

Entre as viáveis de coocorrência, observamos que o r2 diferencia lesões benignas de malignas, confirmando nossos dados preliminares anteriormente publicados e sugerindo que quanto maior a granularidade da cromatina, maiores as alterações observadas em células neoplásicas malignas (16).

A comparação de acurácia dos parâmetros utilizados na morfometria com os imunoistoquímicos já rotineiramente empregados na caracterização das lesões de padrão folicular e no diagnóstico de malignidade em nosso serviço indica que a técnica de análise de imagem pode ser muito útil. Na verdade, essa técnica poderá ser ainda mais útil em células obtidas por punção aspirativa com agulha fina, cujo núcleo é mais facilmente isolado do que em tecido, pois as células estão mais esparsas no esfregaço.

Conclui-se que a análise morfométrica, que depende de simples incorporação de um software à análise digital de imagem já realizada em laboratórios de patologia, pode acrescentar acurácia à análise morfológica clássica e à imunoistoquímica na avaliação de lesões de padrão folicular.

Agradecimentos: os autores L.S.W e K.M são pesquisadores do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Este trabalho recebeu apoio financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), do Fundo de Apoio ao Ensino, à da Pesquisa e à Extensão (Faepex), da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp) e do CNPq.

Declaração: os autores declaram não haver conflitos de interesse científico neste estudo.

 

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Correspondência para:
Patrícia S. de Matos
Departamento de Anatomia Patológica, Unicamp
Rua Tessália Viera de Camargo, 126
Caixa postal 6111, Barão Geraldo
13083-970 - Campinas, SP, Brasil
pasmatos@fcm.unicamp.br

Recebido em 3/Fev/2009
Aceito em 12/Jul/2009

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