Determinação da concentração de beta-glucano em cogumelo Agaricus blazei Murill por método enzimático

Determination of beta-glucan concentration in Agaricus blazei Murill mushroom by enzymatic method

Resumos

Cogumelos comestíveis contêm importantes propriedades funcionais. Em particular, beta-glucanos, homo- e hetero-glucanos com ligações glicosídicas beta(1->3), beta(1->4) e beta(1->6), supostamente responsáveis por algumas propriedades benéficas à saúde humana, como atividade imunomodulatória, antioxidante, antiinflamatória e anticancerígena. Neste trabalho, a quantidade de beta-glucano presente em cogumelo Agaricus blazei Murill, coletados de três diferentes locais, foi analisada utilizando-se método enzimático. As amostras (em base seca) foram tratadas com alfa-amilase, protease bacteriana e com glicoamilase fúngica. beta-glucano foi quantificado após hidrólise ácida e determinação da glicose liberada. Foi verificado que amostras de A. blazei Murill cultivadas em estufas apresentaram menor concentração de b-glucano (8,4±0,9 e 7,6±2,8g/100g) quando comparado com amostras cultivadas em campo aberto (10,1±2,1g/100g). Observou-se ainda que, mesmo sendo cultivado em condições semelhantes, porém em locais diferentes, as amostras apresentaram diferenças significativas (7,6±2,8 e 8,4±0,9g/100g).

beta-glucano; determinação enzimática; Agaricus blazei Murill

Edible mushrooms contains a very interesting functional properties. Among them, the beta-glucans, polysaccharides with beta-1,3; b-1,4 and beta-1,6glucosidic linkages, they are responsible to a series of properties to human health, such as immunomodulatory, antioxidant, antiinflammatory and, antitumoral activities. In the present work, the Agaricus blazei Murill beta-glucan concentrations from three locations, were determined through the enzymatic method. Samples were treated with alpha-amylase, bacterial protease and fungal glucoamylase. beta-glucans were quantified after acid hydrolysis and, the glucose determined for spectrophotometric method. It was verified that samples cultivated inside stoves presented smaller beta-glucan concentration (8.4±0.9 and 7.6±2.8g/100g), when compared with samples cultivated in open field (10.1±2.1g/100g). It was also observed that the samples cultivated in similar conditions, even so in different place, presented significant differences (7.6±2.8 and 8.4±0.9g/100g).

beta-glucan; enzymatic determination; Agaricus blazei Murill

Determinação da concentração de b-glucano em cogumelo Agaricus blazei Murill por método enzimático

Determination of b-glucan concentration in Agaricus blazei Murill mushroom by enzymatic method

Yong K. Park^*; Masaharu Ikegaki; Severino M. Alencar; Claudio L. Aguiar

Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Laboratório de Bioquímica, Caixa Postal, 6177, CEP. 13083-970, Campinas/SP, Brasil. E-mail: [e-mail]. br

RESUMO

Cogumelos comestíveis contêm importantes propriedades funcionais. Em particular, b-glucanos, homo- e hetero-glucanos com ligações glicosídicas b(1®3), b(1®4) e b(1®6), supostamente responsáveis por algumas propriedades benéficas à saúde humana, como atividade imunomodulatória, antioxidante, antiinflamatória e anticancerígena. Neste trabalho, a quantidade de b-glucano presente em cogumelo Agaricus blazei Murill, coletados de três diferentes locais, foi analisada utilizando-se método enzimático. As amostras (em base seca) foram tratadas com a-amilase, protease bacteriana e com glicoamilase fúngica. b-glucano foi quantificado após hidrólise ácida e determinação da glicose liberada. Foi verificado que amostras de A. blazei Murill cultivadas em estufas apresentaram menor concentração de b-glucano (8,4±0,9 e 7,6±2,8g/100g) quando comparado com amostras cultivadas em campo aberto (10,1±2,1g/100g). Observou-se ainda que, mesmo sendo cultivado em condições semelhantes, porém em locais diferentes, as amostras apresentaram diferenças significativas (7,6±2,8 e 8,4±0,9g/100g).

Palavras-chave: b-glucano; determinação enzimática; Agaricus blazei Murill.

SUMMARY

Edible mushrooms contains a very interesting functional properties. Among them, the b-glucans, polysaccharides with b-1,3; b-1,4 and b-1,6glucosidic linkages, they are responsible to a series of properties to human health, such as immunomodulatory, antioxidant, antiinflammatory and, antitumoral activities. In the present work, the Agaricus blazei Murill b-glucan concentrations from three locations, were determined through the enzymatic method. Samples were treated with a-amylase, bacterial protease and fungal glucoamylase. b-glucans were quantified after acid hydrolysis and, the glucose determined for spectrophotometric method. It was verified that samples cultivated inside stoves presented smaller b-glucan concentration (8.4±0.9 and 7.6±2.8g/100g), when compared with samples cultivated in open field (10.1±2.1g/100g). It was also observed that the samples cultivated in similar conditions, even so in different place, presented significant differences (7.6±2.8 and 8.4±0.9g/100g).

Keywords: b-glucan; enzymatic determination; Agaricus blazei Murill.

1 — INTRODUÇÃO

A maioria dos cereais contém quantidades variáveis de b-(1®3) e b-(1®4)-D-glucanos. Esses polissacarídeos são comuns entre os cereais e ocorrem em grande quantidade no endosperma e na parede celular de cevada, trigo e aveia [2, 11]. A importância metabólica do b-glucano na saúde e na nutrição humana foi recentemente revisada por KLOPFENSTEIN [15]. Alimentos à base de aveia, ricos em fibras solúveis em água têm sido descritos como produtos hipocolesterotêmicos em humanos e, tem despertado interesse crescente junto à comunidade médica [1, 27]. O b-glucano (Figura 1) é encontrado em todos cereais, mas as concentrações são maiores em aveia e cevada, com valores na faixa de 2 a 6% [10]. Os cogumelos comestíveis também apresentam compostos que têm propriedades funcionais, em particular os homo e hetero-glucanos com ligações glicosídicas do tipo b(1®3) e b(1®6) [16]. No entanto, além das propriedades farmacológicas encontradas nos polissacarídeos de origem vegetal, os polissacarídeos de origem fúngica apresentam várias outras propriedades tais como atividades antitumoral, imunomodulatória, antiviral, antimicrobiana e antiparasitária [3, 9, 34]. Entre as atividades farmacológicas relacionadas a diversas espécies de cogumelos que contém (1®3) e (1®6)-b-D-glucano, está a atividade antitumoral [3, 9, 14, 16, 19, 20, 21]. De acordo com KAWAGISH et al. [13, 14] a fração de polissacarídeo estraído de Agaricus blazei, que apresenta atividade antitumoral é composta de um complexo de b-(1®6)-D-glucano e proteínas.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a concentração de b-glucano em cogumelos Agaricus blazei Murill cultivados no Brasil e no Japão em duas condições distintas (estufa e campo) através de método descrito por PROSKY et al. [29] e modificado pela "Foundation of Japanese Food Analysis Center" [8], pela quantificação de glicose liberada após sucessivas hidrólises enzimática e química.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 - Amostras

As amostras de cogumelos foram cultivadas no Brasil e no Japão, e em duas condições distintas de acordo com a Tabela 1. O cogumelo foi cultivado em estufa a 25±0,2ºC e umidade relativa (U.R.) superior a 90%, por 6 dias, sobre composto orgânico produzido a partir de bagaço de cana-de-açúcar, farelo de arroz, esterco de gado e galinha, contidos em sacos plásticos de 60 quilos. Para a amostra cultivada no campo, a incubação foi feita em composto orgânico coberto com terra estéril, em valas, a temperatura ambiente, a temperatura de 25±2ºC e U.R. aproximada de 60%.

2.2 - Preparo do cogumelo

As amostras foram coletadas, lavadas e imediatamente colocadas em estufa com circulação forçada a 60°C por 24h, para a secagem do cogumelo. Terminado o processo de desidratação, as amostras foram acondicionadas em dessecador e armazenadas em freezer (-10ºC) até o momento de sua análise. As amostras foram pulverizadas utilizando um triturador LI-5 (capacidade de 5L e motor de 3/4 Hp, Reimse Co.), peneiradas (0,3mm) e imediatamente analisadas.

2.3 - Determinação do b-glucano

A determinação de b-glucano foi realizada em triplicata, conforme a metodologia descrita por PROSKY et al. [29] e modificada pela "Foundation of Japanese Food Analysis Center" [8]. Esse método consiste em hidrólises enzimáticas e químicas, e constitui o método analítico oficial japonês para determinação de b-glucano. Alíquotas de 1g das amostras desidratadas e trituradas, foram acondicionadas em frascos de Erlenmeyer (500mL) com 50mL de tampão fosfato 80mM e pH 6,0. Em seguida, foram tratadas com: (a) a-amilase termostável Termamyl 120L (Novo Nordisk; 0,1mL de enzima, incubada por 30min em banho-maria em ebulição), (b) protease neutra bacteriana (Novo Nordisk; 0,1mL de enzima, pH 7,5; ajustado com NaOH 25mM, incubado por 30 min a 60°C) e (c) amiloglicosidase AMG 200L (Novo Nordisk; 0,3mL de enzima, pH 4,0-4,5, ajustado com HCl 75mM, incubado por 30 min a 60°C). Após os tratamentos enzimáticos, foram adicionados 200mL de solução 95% de álcool etílico, e os frascos foram mantidos a 60°C por 60 minutos. Em seguida, as fibras solúveis precipitadas com etanol e fibras insolúveis foram separadas por centrifugação a 20000g por 10 minutos. Os precipitados lavados com solução 80% de álcool etílico e acetona, continham sais insolúveis, proteínas não-digeridas e fibras insolúveis, como descrito por MANZI & PIZZOFERRATO [16]. O procedimento de lavagem dos precipitados foi repetido por 3 vezes. Após evaporação do etanol e da acetona excedentes foram adicionados 10mL de solução 72% de H₂SO₄ e os frascos foram incubados a 20°C por 4h, para hidrólise das fibras, compostas basicamente de b-glucanos. Em seguida, foram adicionados 140mL de água destilada, sendo os frascos incubados em banho-maria em ebulição por 2h. Após este período, o pH das misturas foi ajustado até a neutralidade utilizando NaOH 5M, e o volume final completado para 300mL. Em seguida as amostras foram filtradas em papel de filtro Whatman n^o5B Advantec e a quantidade de glicose foi determinada pelo método enzimático utilizando-se 4-aminofenazona (0,025 mol/L) e fenol (0,055 mol/L) na presença de glicose oxidase (1 U/mL) e peroxidase (0,15 U/mL) (LaborLab Ltda., Guarulhos/SP). A concentração de b-glucano (g/100g), presente nos cogumelos em base seca, foi calculada através da equação:

2.4 - Análise estatística

O delineamento empregado foi inteiramente casualizado, sendo que a análise estatística dos resultados obtidos de 3 repetições. Os dados obtidos da concentração de b-glucano foram analisados pelo programa MSTAT-C [22] para a determinação da análise da variância e comparação de médias através do teste de Tukey com um nível de confiança de 95%.

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Utilizando-se a metodologia da determinação de b-Glucano proposta por PROSKY et al. [29] e modificada pela "Foundation of Japanese Food Analysis Center" [8], as amostras de cogumelos foram submetidas a tratamento com a-amilase bacteriana Termamyl, para a hidrólise do amido seguidas com protease e com amiloglicosidase para hidrólise de olissácarídeos residuais para remoção de proteínas digeríveis. O resíduo obtido foi lavado para a remoção de sais insolúveis, proteínas não digeridas e fibras insolúveis. As amostras de b-glucano foram hidrolisadas com ácido e a quantidade de glicose formada foi determinada pelo método enzimático com glicose oxidase e peroxidase. O uso de enzimas altamente purificadas é requerido na análise de b-glucano em alimentos, pois a contaminação das preparações enzimáticas com enzimas que hidrolisam o amido, pode resultar na produção de açúcares livres, como glicose de outra fonte que não seja do b-glucano, e isto poderia superestimar o conteúdo de b-glucano. A glicose oxidase e peroxidase usadas na determinação da glicose devem ser essencialmente livres de catalase e a- e b-glicosidase [18]. Por este motivo, as preparações enzimáticas utilizadas neste trabalho foram obtidas de fornecedores que garantissem a pureza requerida. Além disto, a metodologia utilizada foi inicialmente elaborada para determinação do conteúdo de b-glucano em cereais, onde o teor das fontes potenciais de glicose, como amido ou celulose/hemicelulose, são consideravelmente inúmeras. O cogumelo Agaricus blazei, possui teor reduzido, senão inexistente destes polissacarídeos; e neste trabalho foram utilizadas enzimas puras no tratamento enzimático das amostras trituradas de A. blazei. Como sugerido por McCLEARY [17] o método proposto por McCLEARY para análise de b-glucanos, tem sido aplicado pelo Sub-Comitê do "Cereal Chemistry Division of the Royal Australian Chemical Institute", e atualmente é recomendado como método australiano [33]. DALIES et al. [6] afirmam que a parede celular de fungos e leveduras, são compostas principalmente, de b-glucanos, que hidrolisados levariam à formação de glicose, e de mananas e quitina (Figura 2), que hidrolisados levariam a formação de outras hexoses, como manose, e N-acetilglicosamina. A composição da parede celular de Fusarium oxysporum foi analisada por SCHOFFELMEER et al. [32], sendo encontrados principalmente, quitina, a- e b-glucanos, e a análise de açúcares destes polissacarídeos mostrou não somente a presença de glicose e N-acetilglicosamina, mas também de manose, galactose e ácido urônico. Algumas algas e oomicetos possuem ainda celulose em suas paredes celulares, que poderiam, após tratamento enzimático, formar um excedente de glicose que acarretaria em valores superestimados de b-glucanos.

Em geral, os métodos descritos na literatura para determinação de b-glucanos, foram desenvolvidos para análise de b-glucanos de cereais com ligações do tipo b(1®3)(1®6) [18]. De fato, cereais contêm essencialmente b-glucanos com ligações mistas de b(1®3)(1®6), enquanto cogumelos apresentam maiores quantidades de b(1®4)(1®6) que b(1®3)(1®4) e diferentes ligações simples como b(1®3), b(1®4) e b(1®6) [23]. Na Tabela 2, são apresentados os teores de b-glucano presentes nas amostras de cogumelo A. blazei em duas condições de cultivo. Os teores de b-glucano representam os valores médios de três avaliações e a comparação entre as médias foi feita considerando-se 5% de significância.

As amostras cultivadas em estufa, tanto no Brasil como no Japão, apresentaram menor concentração de b-glucano quando comparadas com a amostra cultivada em campo e, observou-se ainda que, houve diferença significativa no teor de b-glucano entre as duas amostras cultivadas em estufa.

Esta diferença pode ter sido causada devido à variação na qualidade do composto utilizado para o cultivo do cogumelo bem como alterações nas condições ambientais dentro das estufas. Verificou-se ainda que comparando as amostras C e R, cultivadas em estufa e no campo, respectivamente, houve diferença significativa no teor de b-glucano entre as duas formas de cultivo, levando a concluir que a melhor concentração deste polissacarídeo pode ser obtida se o cogumelo for cultivado no campo. Nesse caso existem alguns fatores como chuva, variação brusca de temperatura, pragas, etc, que podem afetar de forma negativa o cultivo dos cogumelos. Estes fatores agrícolas, têm afetado o teor de b-glucano, quando se trata de cultivo de cereais, porém o efeito destes fatores agrícolas nã foram analisados para o cultivo de cogumelos em campo. Algum estudo neste sentido poderia ser feito, para que se possa elaborar um protocolo de produção destes cogumelos com um teor de b-glucano que seja maior e invariável.

MANZI & PIZZOFERRATO [16] utilizaram método analítico similar ao empregado neste trabalho e encontraram teores de b-glucano em cogumelos comestíveis Pleurotus ostreatus, P. pulmunarius, P. eryngii e Lentinula edodes na faixa de 0,21 e 0,53g/100g de cogumelo seco. Outros autores, como DALLIES et al. [6] por sua vez, avaliaram teores de b-glucanos em Saccharomyces cerevisiae, enquanto SANDULA et al. [31] avaliaram a presença de b(1®3)-glucano nas paredes celulares de Saccharomyces cerevisiae e de Aspergillus niger. NGUYEN et al. [24] afirmaram que a parede celular de leveduras como Kluyveromyces marxianus, Kloeckera apiculata, Debaryomyces hansenii, Zygosaccharomyces bailii e Saccharomyces cerevisiae, representa de 26-32% da massa seca do organismo, e que as manoproteínas representam 25-34% da parede celular, os glucanos insolúveis em álcali, de 15-48%, e por último, os glucanos solúveis em álcali, de 10-48%. CHEUNG & LEE [4] analisaram Pleurotus tuber e encontraram concentrações de fibras totais solúveis em álcali de 126 e 293g/kg de cogumelo, sendo que destas fibras foram encontrados principalmente b-glucano (ligações do tipo b-1,3, b-1,4 e b-1,6) e quitina. No método proposto por OHNO et al. [25] para extração de b-(1®3)-glucano solúvel de Candida spp. pela oxidação com hipoclorito de sódio e subseqüente extração com dimetilsulfóxido, foi obtido 9,6% de b-glucano, que continha principalmente ligações do tipo b-1,3 e b-1,6.

Em termos comparativos, em grãos, diferentes trabalhos apresentam teores variáveis para o teor de b-glucano em grãos de cereais, como aveia e cevada. SAASTAMOINEN et al. [30] encontraram teores médios de b-glucano em aveia variando de 1,9 a 5,1% (p/v). CHO & WHITE [5] relataram que o conteúdo de b-glucano em grãos de 243 amostras de aveia, mostraram uma distribuição normal com a maioria das amostras em torno de 4,5-5,5% de b-glucano por 100g de aveia seca. Os autores verificaram que a variabilidade genética dos cultivares afetou o conteúdo de b-glucano. O mesmo foi observado por PETERSON et al. [28] e OUARNIER et al. [26], que também verificaram que o conteúdo de b-glucano em aveia (Avena sativa) variou com a época de colheita entre outros fatores agrícolas. Um conteúdo maior foi encontrado por WELCH et al. [35], quando analisaram Avena atlantica, a qual apresentou teores de 2,2 a 11,3g de b-glucano por 100g do grão. Em grãos de cevada, estes valores podem chegar a 3,5-4,8% [7]. Estas variações segundo HUBIK & TICHY [12], estão associadas ao genótipo e local em que o cereal foi cultivado. Fatores como a fertilização do solo não mostraram ter efeito significativo no aumento de b-glucano em cereais.

4 — CONCLUSÕES

A concentração de b-glucano em cogumelo Agaricus blaze variou significativamente conforme a forma de cultivo, sendo que os cogumelos cultivados em São Paulo, em estufa apresentavam menor concentração de b-glucano (8,4±0,9g/100g de cogumelo em base seca), quando comparado com amostras cultivadas no campo (10,1±21g/100g de cogumelo em base seca).

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Recebido para publicação em 21/12/2000

Aceito para publicação em 23/04/2003 (000557)

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A quem a correspondência deve ser enviada.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Abr 2004
• Data do Fascículo
  Dez 2003

Histórico

• Aceito
  23 Abr 2003
• Recebido
  21 Dez 2000