ESTUDO COMPARATIVO DE DIVERSAS CULTURAS DE COLLETOTRICHUM ISOLADAS DE CACAUEIROS (THEOBROMA CACAO L.) NO ESTADO DE SÃO PAULO.RESUMO
No presente trabalho foi realizado um levantamento das populações de Colletotrichum spp. presentes em cacaueiros de 17 municípios do Estado de São Paulo. visando um estudo das características Inortológicas. fiS10lógicas e de patogenicidade. Foram obtidos 202 isolados do fungo, de rallios, folhas e frutos de cacaueiro apresentando sintomas de "antracnose". Tomando por base a presença de variações, textura e coloração do micélio, as culturas foram examinadas para verificação da presença de conidios, setas e peritécios do estado ascógeno (Glomerella sp.). Quanto a morfologia dos conidios foram determinados os tipos fusiforme, fusiforme alongado e cilíndrico. Os resultados das inoculações foram positivos com diferentes graus de patogenicidade. Os resultados dos ensaios de crescimento em 5 temperaturas revelaram cepas de crescimento rápido, médio e lento sendo o ponto ótimo a 27oc para todas as cepas estudadas.
PALAVRAS-CHAVE
- Colletotrichum; Theobroma cacao L.; antracnose.
SUMMARY
Morphological, physiological and pathogenic characteristics of Colletotrichum populations in cacao from 17 locations of São Paulo state were studied. 202 isolates of the fungus were obtained from stems, leaves and fruits with "anthracnosis" symptoms. The isolates were separated in 4 groups according to cultural variations, appearance and colour of the mycelium. Representative isolates from each group were examined to observe setae, perithecia of the ascogenous stage (Glomerella SP.) and conidia. Fusiform, elongated and cylindric conidia forms were considered. The results of inoculations were positive in different degrees of pathogenicity. Assays at 5 temperatures showed growth variations among the isolates and an optimum temperature of 27°C for all the isolates studied.
KEY WORDS
- Colletotrichum; Theobroma cacao L.; antracnosis.
INTRODUÇÃO
O ataque de fungos do gênero Colletotrichum em cacaueiros, não era considerado problema grave no Estado de São Paulo até recentemente. No entanto, com a expansão da cultura cacaueira em nosso Estado, esse fungo passou a merecer atenção pois sua incidência tem sido observada tanto em plantas adultas como em mudas enviveiradas, constituindo-se nessas, um sério problema (15).
O fungo afeta folhas, pecíolos, ramos terminais e frutos de cacaueiro de todas as idades sendo, porém, nas folhas onde causa maiores prejuízos. Nestas, observam-se inicialmente pequenos traços ou pequenas manchas arredondadas, de coloração café, com 2 a 5mm de comprimento por 1 a 2mm de largura, localizadas nas nervuras. Com o progresso da infecção, essas manchas tornam-se angulares, alcançam toda a nervura e o limbo, causando necrose nos tecidos, podendo atingir as bordas e ponta das folhas. As folhas jovens e os brotos são os mais atacados, podendo ocorrer desfolha quando o ataque é severo.
Nos frutos o ataque do fungo tem ação pouco pronunciada, podendo aparecer em qualquer ponto da sua superfície, ocorrendo em geral quando estão na fase de amadurecimento. Os sintomas se manifestam em forma de manchas escuras, deprimidas, as quais posteriormente se fundem, podendo alcançar toda a casca do fruto. Quando este estágio de infecção é atingido, pode advir o apodrecimento das sementes.
Nos ramos manifesta-se como manchas longas de cor marrom.
E na folhagem, como já referido anteriormente, que a doença adquire maior importância, devido a desfolha prematura e intensa, muitas vezes comprometendo o estado geral da planta que, enfraquecida, tem a sua produção afetada (3). Além disso a planta torna-se mais suscetível ao ataque de outros patógenos. As mudas no viveiro quando atacadas, não conseguem se desenvolver normalmente.
ROMBOUTS (17) fez uma revisão na literatura mundial sobre enfermidades do cacaueiro e cita diferentes espécies de Colletotrichum causando "antracnose": C. theobroma Appel & Strunk, C. luxificum Jong et Drost, .C. incarnatum Zimm, C. gloesporioides Penz; C. cradwickii Bancroft e C.brachitrichum Delacroix.NEWHALL (13) e SMALL (19), presumem que a espécie de Colletotrichum causadora da antracnose nas mudas de cacaueiro, seja a mesma que afeta plantas de cafeeiro. DAKWA & DANQUAH (3) relatam uma desfolha de cacaueiros em Ghana, causada por C.gloesporioides. Além das espécies mencionadas, RAM et alii (16) citam C.crassipes (Speg.) v. Arx, associado ao murchamento de cacaueiros na Bahia e SANCHEZ (18), cita C.theobromicola Delacroix como o causador da antracnose foliar de cacaueiros.
A antracnose do cacaueiro, também chamada de "die-back" e "podridão rosada dos frutos" é uma enfermidade com distribuição mundial, referida em muitos países produtores de cacau como uma doença esporádica, de difícil controle, causando leves danos nos frutos, não chegando a causar prejuízos econômicos significantes (17).
Nos países das Américas Central e do Sul a antracnose foi observada causando podridão nos frutos, manchas e secamento das folhas (8,13) e causando "die-back" na Costa Rica (2); segundo SANCHEZ (18), no Vale do Cauca (Peru) não existem cacaueiros livres de antracnose.
No Brasil a antracnose foi constatada no Estado do Espírito Santo (12), na Bahia, onde foi relatada grave incidência em cultivares de cacau Catongo (11) e no Estado de São Paulo onde foi observada sobre folhas, principalmente em condições de viveiro (15), ramos e frutos.
As observações de campo parecem evidenciar que esse fungo é o que, no momento, acarreta maiores dificuldades aos cacauicultores do Estado de São Paulo, motivo pelo qual se fazem necessários maiores estudos sobre as populações desse patógeno.
O objetivo do presente trabalho foi o estudo das populações de Colletotrichum que causam sintomas de antracnose em plantações de cacaueiros em diversos municípios do Estado de São Paulo. Trata-se de um levantamento sobre esse fungo em cacaueiro realizado pela primeira vez no Estado de São Paulo.
Dada a grande variabilidade de suas características morfológicas e fisiológicas, existe a possibilidade de haver várias espécies deste fungo causando esta doença. A classificação das espécies será objeto de trabalho a ser realizado brevemente dando continuidade ao projeto de estudo de fungos de cacaueiro que se encontra em andamento.
MATERIAL E MÉTODOS
1 - Isolamento - Periodicamente, durante 4 anos, de 1979 a 1983, foram coletados frutos, ramos e principalmente folhas de cacaueiros com sintomas típicos de antracnose, nos seguintes municípios do litoral e do Planalto do Estado de São Paulo: Caraguatatuba, Eldorado, Itanhaém, PariqueraAçu, Registro, Ubatuba, Campinas, Gália, Jaú, Mococa, Olímpia, Onda Verde, Pindorama, Ribeirão Preto, Sete Barras, Severina e Tanabi.
O material coletado nesses municípios foi transportado para os laboratórios da Seção de Micologia Fitopatológica do Instituto Biológico para ser utilizado nos isolamentos.
Os isolamentos foram realizados seguindo-se a técnica usual, ou seja: o material apresentando a lesão foi lavado, desinfectado com álcool e sublimado corrosivo a l : 1000 e colocado sobre papel de filtro esterilizado para secar. Pequenos segmentos contendo a lesão foram recortados e colocados em placas de Petri com meio de ágar-água. Logo que o fungo apresentou início de crescimento foi repicado para tubos de ensaio com meio de BDA, obtendo-se assim culturas puras.
2 - Observações das características macroscópicas. Para melhor observação do aspecto macroscópico "in vitro", as culturas puras obtidas foram transferidas para tubos de ensaio contendo meio de malte-ágar (6,14). Após 15 dias os isolados foram examinados e separados em 4 grupos, de acordo com a coloração do micélio das culturas. Foram então escolhidas 8 cepas mais representativas de cada grupo, num total de 32, para verificação das outras características macroscópicas como: aspecto do micélio, ocorrência de variações (saltações) e esporulação visível em forma de massas conidiais (1).
3 - Observações das características microscópicas. Das 32 cepas empregadas nas observações das características macroscópicas foram selecionadas duas mais representativas de cada grupo, num total de 8, para serem utilizadas nas observações das características microscópicas; foram repicadas para tubos de ensaio contendo malte-agar e após 8 dias foram preparadas lâminas para exame microscópico das culturas. O tamanho dos conídios foi determinado medindo-se o seu comprimento e a largura, usando-se uma ocular micrométrica. Foram medidos 100 conídios de cada uma das cepas escolhidas para estudo. Foi calculada a média do comprimento, largura e a respectiva relação comprimento médio/largura média para cada cepa. A forma dos conídios foi determinada com base nessa relação.
4 - Testes de patogenicidade. As mesmas 8 cepas empregadas nas observações das características microscópicas foram utilizadas nos ensaios de patogenicidade. a) preparo do inóculo - As culturas foram repicadas para placas de Petri contendo meio de BDA e mantidas à temperatura ambiente. Após 8 dias, foi preparada uma suspensão de conídios em água estéril obtida por meio de raspagem da superfície das culturas com o auxílio de uma alça de Drigalski. A concentração da suspensão foi ajustada para 106 conídios por ml, com o auxílio de um Hematocitômetro (14). b)lnoculações em folhas. De acordo com os resultados de uma análise estatística prévia para verificação do número ideal de plantas e folhas a serem inoculadas, para cada cepa a ser testada foram escolhidas IO mudas de cacau da variedade "Comum da Bahia" com 3 meses de idade. Antes das inoculações essas mudas tiveram suas folhas cuidadosamente examinadas eliminando-se as que apresentavam manchas, a fim de não prejudicar os resultados. De cada planta foram escolhidas duas folhas do 3 oe 4? pares, para serem inoculadas. A suspensão de esporos foi pulverizada nas páginas superiores e inferiores dessas folhas, com o auxílio de um pequeno pulverizador manual (10). As folhas das plantas testemunhas, em número de 5, foram pulverizadas com água destilada estéril. Tanto as plantas inoculadas quanto as testemunhas foram protegidas por sacos plásticos e mantidas em cubículos de casas-de-vegetação, com temperatura ao redor de 26 °C, durante 36 horas. Após esse tempo os sacos plásticos foram retirados e as plantas foram removidas dos cubículos para balcões no centro das casas-de-vegetação, onde permanecerem durante 15 dias, quando então foi feita a verificação dos sintomas.
A avaliação dos resultados foi realizada atribuindo-se o sinal (+) para as folhas que apresentaram infecção moderada, ou seja, manchas de cor café espalhadas nas nervuras e no limbo, e o sinal (++) às folhas apresentando infecção severa, ou seja, necrose dos tecidos acompanhada de secamento total ou parcial, alcançando os bordos e a ponta das folhas.
5 - Ensaios de crescimento a várias temperaturas - Para os ensaios de crescimento foram escolhidas 4 cepas entre as 8 utilizadas para os ensaios anteriores, sendo uma representativa de cada grupo; foram repicadas para placas de plástico de 90mm de diâmetro por 5mm de altura, contendo 15ml de B DA (4). As placas assim preparadas, sendo 5 repetições para cada cepa, foram colocadas a 18,21,24,27 e 30°C, onde permaneceram durante 5 dias. Diariamente, a partir de 24h, foram medidos 2 diâmetros perpendiculares entre si.
Foi realizada análise estatística para os dados referentes à medidas dos conídios e ao crescimento a diferentes temperaturas. O delineamento foi inteiramente casualizado com 8 tratamentos, no caso de conídios e 4 no caso dos diâmetros, utilizando-se o teste de Tukey a 5% de probabili-
RESULTADOS
1 - Isolamentos - Foram obtidos 202 isolados de Colletotrichum procedentes de cacaueiros cultivados em 17 municípios do Estado de São Paulo, assim distribuídos: 19 cepas de Campinas, 36 de Caraguatatuba, 3 de Eldorado, 4 de Gália, 3 de Itanhaém, 9 de Jaú, 6 de Mococa, 8 de Olímpia, 4 de Onda Verde, 41 de Pariquera-Açu, 6 de Pindorama, 3 de Registro, 14 de Ribeirão Preto, 5 de Sete Barras, 11 de Severinia, 5 de Tanabi e 25 de Ubatuba. Dessas, 153 foram isoladas de lesões de folhas, 35 de frutos atacados e 14 de ramos infectados.
2 - Observações das características macroscópicas - Tomando-se por base as características macroscópicas observadas em meio de malte-ágar, tais como coloração, aspecto do talo miceliano, esporulação visível sob a forma de massa conidial, e a ocorrência de variações, as cepas isoladas foram separadas em 4 grupos a saber: Grupo 1 - Cepas apresentando micélio de coloração cinza escuro, cotonoso, com esporulação visível de cor laranja escura. Somente uma cultura apresentou variação. Foram incluídas neste grupo 107 cepas. Grupo 2 - Cepas apresentando micélio de coloração cinza claro, cotonoso, com esporulação escassa e sem variação. Foram incluídas neste grupo 46 cepas. Grupo 3 - Cepas apresentando micélio de coloração cinza esverdeado, não cotonoso, sem esporulação visível; 50% das cepas apresentavam variações. Foram incluídas neste grupo 33 isolados. Grupo 4 - Cepas apresentando micélio de coloração creme, cotonoso, com abundante esporulação visível de coloração roseo-alaranjado; só uma cultura apresentou variação. Foram incluídas neste grupo 16 cepas.
Das 202 cepas isoladas foram selecionadas 32, sendo 8 mais representativas de cada grupo. Na tabela l, estão relacionadas essas 32 cepas escolhidas; constam desta tabela o grupo ao qual pertencem as cepas, o número do isolamento, a procedência do material, a coloração e o aspecto do micélio, a esporulação visível e a ocorrência de variações.
Características culturais em meio de malte-ágar de 32 cepas de Colletotrichum isoladas de cacaueiros no Estado de São Paulo.
3 - Observação das características microscópicas - A tabela 2 apresenta os resultados das observações microscópicas das 8 cepas escolhidas, sendo duas representativas de cada grupo, quanto à presença de con ídios, setas e peritécios da forma perfeita Glomerella SP. Nas cepas do grupo 1 foi verificada a presença de conídios, ausência de setas e de peritécios; nas do grupo 2 a presença de conídios abundantes, setas e ausência de peritécios; nas do grupo 3 a presença de conídios e setas e ausência de peritécios; nas do grupo 4 a presença de conídios abundantes, ausência de setas e formação de peritécios.
Na tabela 3 encontram-se as médias da relação comprimento/largura e amplitude de variação dos conídios das 8 cepas utilizadas nas observações microscópicas. A análise estatística aplicada aos dados das medidas dos conídios revelou resultados significativos para comprimento e largura com relação as 8 cepas empregadas nos ensaios.
Resultados das observações microscópicas das 8 cepas de Colletotrichum isoladas de cacaueiro e utilizadas nos ensaios de patogenicidade.
Amplitude de variação (comprimento e largura), relação comprimento/largura e forma dos conídos das 8 cepas de Colletotrichum isoladas de cacaueiro e utilizadas nos ensaios de patogenicidade e nas observações macroscópicas e microscópicas - Dados em gm.
A cepa 16 (grupo 1) apresentou os conídios de maior largura e maior comprimento. A cepa 19 (grupo 1) apresentou os conídios de menor comprimento e menor largura. As cêpas 55 (grupo 2) e 72 (grupo 3) apresentaram os conídios de largura intermediária e de menor comprimento. As cepas 81 (grupo 3), 94 (grupo 2), 129 e 149 (grupo 4) apresentaram os conídios de maior largura e comprimento intermediário.
De acordo com a relação comprimento médio-largura média, foi determinada a forma dos conídios: fusiforme (cepas 19, 55, 94, 72 e 129), fusiforme alongada (cepa 16) e cilíndrica (cepas 81 e 149).
4 - Patogenicidade - A tabela 4 mostra os resultados dos testes de patogenicidade realizados com 8 cepas, sendo duas representativas de cada um dos 4 grupos. Todas as cepas testadas apresentaram certo grau de patogenicidade, de acordo com os sintomas observados nas folhas das mudas inoculadas.
Resultados dos ensaios de patogenicidade, realizados por inoculações em folhas de mudas de cacaueiro, com 8 cepas de Colletotrichum isoladas de cacaueiros no Estado de São Paulo
5 - Observação do crescimento a várias temperaturas - Na tabela 5 encontram-se os dados referentes às diferenças entre a primeira e a última medida do diâmetro médio das colônias, realizadas respectivamente a 24 e 120 horas (5 dias).
As culturas utilizadas neste ensaio foram as de número 19, 55, 72 e 149, respectivamente, pertencentes aos grupos 1, 2, 3 e 4. A análise estatística do crescimento radial revelou que não existem diferenças significativas entre as 4 cepas em relação às temperaturas. A figura 1 apresenta gráfico relativo ao crescimento das 4 cepas as 5 temperaturas. O gráfico foi executado tomando-se como base a média dos diâmetros do talo miceliano medidas ao 5 0 dia de crescimento. A análise estatística da velocidade de crescimento revelou que a cepa 149 é considerada de crescimento rápido .e a 72 de crescimento médio; as cepas 5 e 19 são consideradas de crescimento lento.
DISCUSSÃO
Os estudos realizados com as culturas de Colletotrichum spp. isoladas de cacaueiro, levando-se em consideração as características macro e microscópicas, a patogenicidade e o crescimento em xii versas temperaturas, mostraram a grande variabilidade do fungo. Essa variabilidade foi observada de uma maneira geral, sem ter sido relacionada com as diferentes regiões de procedência do material nem com os diferentes órgãos dos quais foram isoladas as culturas.
Com relação à coloração do talo miceliano, a grande maioria das culturas, ou seja, 117 culturas apresentaram-no com coloração cinza-escuro; duas tonalidades de cinza-claro foram observadas em 69 culturas e a coloração creme em 16 culturas.
Crescimento radial de 4 cepas de Colletotrichum em 5 temperaturas. Diâmetro médio em milímetros - Cinco dias em BDA.
O micélio apresentou-se cotonoso na grande maioria das culturas, ou seja, em 179 e não cotonoso em 23.
A separação das culturas em grupos facilitou a observação das características macroscópicas (16); com a finalidade de evitar acúmulo e repetição de ensaios semelhantes, as culturas mais representativas de cada grupo foram escolhidas para os ensaios seguintes, ou seja, características microscópicas, patogenicidade e crescimento em várias temperaturas.
Es sa separação das c ulturas de Colletotrichum, isoladas de vários hospedeiros ou de um só hospedeiro, em grupos, de acordo com as semelhanças entre as culturas foi utilizado por diversos autores (1 , 3, 4, 5 e 9), com a finalidade de facilitar o trabalho e proporcionar dados para a sistemática dentro do gênero e muitas vezes dentro da mesma espécie.
A técnica empregada nos ensaios de patogenicidade foi basicamente a preconizada por MAZORRA (10), ou seja, a inoculação de folhas jovens de mudas de cacau, por proporcionar rápido aparecimento das lesões e facilitar as observações sobre patogenicidade.
Há muitas décadas vem sendo verificada a grande variabilidade entre as culturas de Colletotrichum isoladas de cacaueiro, causando os mais diversos sintomas em vários órgãos desta planta. RAM et alii (7) comparando as espécies C. crassipes e C. gloeosporioides do cacau notaram variabilidade cultural não só entre as duas espécies como em diferentes culturas de C gloeosporioides no que se refere a coloração, aspecto do talo miceliano e velocidade de crescimento. Estas observações são importantes não só para separação entre espécies como para verificação das diferenças culturais em uma mesma espécie, talvez para futuros estudos sobre raças. Nesse aspecto, foi determinada, por resultados de pesquisas em um relatório do Centro Interamericano de Cacau (9), a grande variabilidade de culturas de Colletotrichum em meio de malte-ágar, tendo sido também separadas as culturas em grupos baseando-se nas diferenças de aspecto do micélio, esporulação e crescimento micelial.
Influência da temperatura no crescimento de 4 cepas de Colletotrichum sp., isolados de cacaueiros. Delineamento - inteiramente casualizado Dados - Diferenças entre a e a última leitura (em milímetros de diâmetro médio)
Segundo LOURD (9), a principal característica do gênero Colletotrichum, e de seu estágio perfeito do gênero Glomerella, além do grande número de hospedeiros, é a grande variabilidade morfológica. A constituição do conjunto de características variáveis é flutuante e torna muitas vezes difícil sua caracterização e inclusão nas várias espécies existentes.
Com relação às medições dos conídios foi interessante observar a presença de três formas: fusiforme, em 5 cepas, cilíndricas em duas cepas e fusiforme alongada cm somente uma cepa, das 8 empregadas nesse estudo.
Dentro do gênero Colletotrichum, as dimensões dos esporos, segundo LOURD (2), são extremamente variáveis e as diferenças entre as espécies com esporos não curvos são pouco marcadas no que concerne a essa característica. A importância da delimitação entre os valores extremos leva inevitavelmente a delimitação específica.
As diferentes temperaturas proporcionaram crescimento diferentes, em meio de BDA, verificando-se que os melhores crescimentos ocorreram, nas 4 cepas empregadas, à temperatura de 27°C. A interação cepas x temperatura não significativa indica que a variação de crescimento em função da temperatura segue o mesmo padrão para as 4 cepas, não havendo portanto diferença quanto às temperaturas para o seu crescimento. DIAZ (9) concluiu que para estudos de velocidade de crescimento de cepas de Colletotrichum SP. o meio de BDA é mais favorável que o meio de malte. Segundo LOURD (7) o cálculo da velocidade de Crescimento de C. gloeosporioides é importante para caracterizar as cepas ou grupos de cepas e a melhor temperatura foi também a de 27 oc.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Dra. V. Victoria Rossetti pela sugestões apresentadas para a redação do presente trabalho.
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