CAMPILOBACTERIOSE GENITAL: PROPOSTA DE DIAGNÓSTICO MAIS SENSÍVEL EM TOUROSRESUMO
Propõe-se uma nova rotina para diagnóstico da campilobacteriose em touros, empregando "swab" prepucial, condiçóes de transportes e processamento bacteriológico de fácil execução e baixo custo. Amostras de muco prepucial de 227 touros em serviço de monta natural em propriedades suspeitas e doadores de semem em centrais de inseminação artificial - foram coletadas através de swab (met. l) e da lavagem do prepúcio (met.2) e avaliadas bacteriologicamente. Pelo método 1 56,7% dos touros foram positivos para diferentes subspécies de Campylobacter, frente a 2,4% pelo método 2. Na monta natural, 63,5% foram positivos para o método I e 6,0% pelo método 2; enquanto nas centrais de inseminação 40,0% mostraram-se positivos pelo método proposto, mas todos negativos pelo met. 2. Na monta natural 42,3% dos isolamentos foram de estirpes patogênicas e nas centrais 37 ,8%.
Os autores sugerem uma urgente revisão da conduta ainda empregada no Brasil, principalmente à nível de Centrais de Inseminação
PALAVRAS-CHAVE
Campilobacateriose genital; diagnóstico laboratorial; touros; inseminação artificial; monta natural.
SUMMARY
A more sensitive practice for diagnosis of genital campylobacteriosis in bull using prepucial swab, economic transportation conditions and a simple bacteriological procedure (met. l) was proposed. Preputial mucus samples from a total of 227 bulls - on natural service in suspect farmers and semem donors in artificial insemination centers - were colected by swab (met. 1) and by prepucial washing (met. 2) and bacterilogicaly evaluated.
The met. I rendered 56,7% positive to Campylobacter spp and the met. 2 only 2,4%. The bulls on natural service submited to met. 1 63,5% were found positive, while met. 2 6%. In the IA centers, 40% were found positive by met. 1 and none ofthem by met. 2. It was discovered 42,3% pathogenic strains carriers from the farmers bulls and 37,8 from the IA centers. It was suggest a urgent review of tradicional procedure still used in Brasil, mainly at Insemination Center.
KEY-WORDS
Genital campylobacteriosis; laboratorial diagnosis; bull; insemination center; natural service.
INTRODUÇÃO
No Brasil, desde a constatação da campilobacteriose por D' APICE em 1956 (3), raros estudos foram desenvolvidos visando diminuir as dificuldades do seu diagnóstico; isto é, levando em consideração a forma de coleta e de transporte que sejam adequadas às grandes distancias, a eficiência no processamento bacteriológico e sobretudo o custo.
GENOVEZ et alii, (7) relataram a superioridade do swab prepucial (23 , 9%), frente a técnica convencional de lavado prepucial (4,3%), quando submetidos ao mesmo processamento bacteriológico. Contudo, fatores limitantes como contaminação excessiva e necessidade de provimento de condição ideal de microaerofilia, objetivou a continuidade desses estudos até a presente proposta.
Através de amostras de muco prepuciais de touros em serviço de monta natural e de doadores de semem em centrais de inseminação artificial, procurou-se avaliar a eficiência de uma proposta de coleta, transporte e exame bacteriológico, comporando-a ao diagnóstico convencional do lavado prepucial na forma que vem sendo praticado no país.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram examinadas amostras de muco prepucial de touros com idades variando entre 18 meses a 12 anos provenientes de propriedades que se utilizavam exclusivamente de monta natural e, que apresentavam baixos índices de fertilidade, com cerca de 50 a 60% de nascimentos, cujos sintomas principais compreendiam alta freqüência de repetição de cio e alguns abortamentos. O outro grupo estudado constituiu-se de touros em quarentena em centrais de inseminação, cujas idades variavam de 18 meses a 13 anos.
Os 227 animais foram divididos em 4 grupos:
Grupo 1 - Cinqüenta e dois animais em monta natural submetidos ao método proposto;
Grupo 2 - Quarenta e seis animais em monta natural submetidos ao método convencional;
Grupo 3 - Quarenta e cinco animais doadores de semem submetidos ao método proposto;
Grupo 4 - Oitenta e quatro animais doadores de semem submetidos ao método convencional.
Pelo método proposto (met. 1), após lavagem do óstio prepucial, procedia-se a introdução do "swab" na cavidade prepucial procurando-se obter o máximo de muco. O ' 'swab' ' embebido era imediatamente mergulhado em frasco contendo 3ml de caldo triptose e transportado sob refrigeração.
Parte do caldo era filtrado em Millipore 0,65» e cultivado em ágar brucella-saneue e em tubo contendo tioglicolato acrescido de 0, 16% de bacto-ágar. O restante era cultivado em ágar brucella-sangue acrescido de uma solução de antibióticos composta de 15.000 UI/I de Bacitracina 10.000 UI/I de Polimixina B; 0,005 g/l de Novobiocina e 0,02g/l de cicloheximida (4). Os cultivos eram incubados a 37 °C durante 4 dias em jarra adaptada para microaerofilia (Figura 1) , onde, previamente era obtido vácuo até - 600 mm Hg, seguido da injeção de mistura de 95% N2 e 5% CO2. O meio de tioglicolato era incubado em estufa bacteriológica a 37 °C.
Panela de pressão adaptada como jarra de anaerobiose, recebendo a mistura gasosa de 95% de N2 e 5% de CO2.
O método convencional (met. 2), constituía-se de coleta do muco através da lavagem interna do prepúcio com salina tamponada (pH 7.2), juntamente com massagem vigorosa. A suspensão obtida era transportada sob refrigeração ou vertida para frascos contendo Tranport Medium Stuart acrescido de 0,2% de pó de carvão vegetal ativado. O sobrenadante desse material era cultivado diretamente, sem filtração, nos mesmos meios acima e incubado a 37 °C, em microaerofilia gerada pela vela.
Para identificação seguiu-se os critérios contidos no BERGEY'S Manual (4), onde, as culturas suspeitas eram submetidas ao exame de motilidade em microscopia de campo escuro, à coloração pelo Gram, às provas de oxidase, de catalase, de tolerância à glicina 1% e I .5% (1) e de capacidade de produção de H2S em TSI.
Em pequenas alíquotas do caldo triptose e do lavado prepucial, era adicionado 0,01 ml da cultura de Campylobacter fetus subsp. venerealis (estirpe de referência de origem alemã), processada no laboratório segundo os métodos I e 2, respectivamente, com a finalidade de controle.
RESULTADOS
De acordo com os resultados bioquímicos, obteve-se no grupo l , 33/52 (63,5%) animais positivos, sendo 13 Campylobacter sputorum subsp. bubulus, 10 Campylobacter fetus subsp. feius com uma associação com Campylobacter sputorum subsp. bubulus ,8 Campylobacter fetus subsp. venerealis sendo um associado com Campylobacter fetus subsp. fetus e outro com Campylobacter sputorum subsp. bubulus e 2 Campylobacter fetus subsp. venerealis var. intermedius. O grupo 2 apresentou 3/46 (6,5%) animais positivos, sendo 2 Campylobacter sputorum subsp. bubulus e I Campylobacter fetus subsp. fetus.
No grupo 3, 18/45 (40%) animais foram positivos, sendo 12 Campylobacter fetus subsp. fetus com uma associação com Campylobacter sputorum subsp: bubulus, 5 Campylobacter fetus subsp. venerealis sendo 3 var. intermedius e I Campylobacter sputorum subsp. bubulus; enquanto que no grupo 4 todos animais foram negativos.
Dessa forma 56,7% dos touros foram positivos pelo método I frente a apenas 2,4% pelo método 2, como mostra a tabela 2, sendo essa diferença significativa. Na monta natural, 63,5% foram positivos pelo método l , frente a 6,5% do método 2 (x-= 34,1 para x crítico = 6,64, 0,01). Nos animais doadores de semem, 40% foram positivos pelo método I e todos negativos pelo método 2 ( 38,9 parax 2 crítico 6,64,p<0,01).
Freqüência de isolamentos de espécies de Campylobacter de muco prepucial de touros em monta natural e de doadores de semem, frente a dois métodos de diagnóstico.
Pelo método l , 33/52 animais em monta natural e 18/ 45 doadores de semem em centrais de inseminação artificial apresentaram-se como portadores de espécies de Campylobacter, sendo 42,3% isolamentos de estirpes patogênicas no primeiro e 37,8% no segundo.
Ainda pelo método 1, o grau de contaminação mostrou-se inferior através da filtração, sendo possível o isolamento de 45 , 2% das amostras em ágar-brucella sem atibióticos e 38, 1% em tioglicolato, frente a 9,5% obtidos em ágarbrucella com antibióticos. Os microrganismos contaminantes mais freqüentes foram Pseudomonas aeruginosa, Proteus SP. e coliformes.
O custo total do método proposto foi avaliado ao redor 1 dolar/exame.
As amostras controle de lavado prepucial transportadas sob refrigeração foram negativas quando a distância não permitiu seu processamento até três horas após a coleta, o que não ocorreu com o Transport Medium Stuart e com o método proposto.
DISCUSSÃO
Além da eficiência, uma proposta de diagnóstico deve apresentar baixo custo, isto é, estabelecer uma relação custo/benefício equilibrada.
O uso do ' ' swab' ' confirmou suas vantagens sobre o lavado, relatadas anteriormente por GENOVEZ et alii (7) e concordantes com TEDESCO et alii (10), sem ocasionar os inconvenientes traumáticos citados por GARCIA et alii (5) com o uso de aparelhos raspador de SUTKA e KATAI (9), cujos resultados diagnósticos são compatíveis com os do "swab".
Ainda que RAMOS et alii (8) concluíssem que a coleta do esmegma prepucial com pipeta de Bartlet fosse superior ao "swab" e ao lavado; mesmo este último coletado com meio de transporte, enfatizam as vantagens do "swab" por sua praticidade e por não proporcionar desconforto ao animal.
O Transport Medium Stuart modificado (SBL), proposto por GASTRIM et alii (6) e também empregado por GENOVEZ et alii (7), mostrou-se nos controles, adequado para manutenção da viabilidade do agente por até 72 horas após a coleta. Contudo, a impossibilidade de descontaminação por filtração por se tratar de meio semi-sólido, implicou na sua substituição pelo caldo triptose.
CLARK et alii (2) propuseram o Transport Enrichment Medium (TEM) para coleta e manutenção de Campylobacter de muco prepucial e relatam resultados bacteriológicos excelentes. Todavia, em decorrência do difícil preparo e estocagem, da falta de infra-estrutura laboratorial mínima da maioria das propriedades rurais do país, aliados ao seu custo elevado, contribuíram para que este meio não tivesse aqui, a repercussão esperada.
Embora o tempo de manutenção da viabilidade das espécies de Campylobacter nas condições apresentadas nesta proposta mereça maiores avaliações, contatou-se através do exame dos confroles, a possibilidade de isolamento após 24 horas da coleta, quando o material era mantido sob refrigeração. Neste ponto é importante mencionar que a eficiência de qualquer método de diagnóstico implica em condições adequadas de coleta, representada no caso da campilobacteriose, principalmente, pela higienização adequada da região prepucial.
A filtração em Millipore 0,65g, contestada por DUFTY (4), mostrou-se mais eficiente como forma seletiva do que a solução de antibióticos.
O mecanismo abrangente utilizado no método I , isto é: a retirada mecânica e a absorção do muco pelo "swab" aliadas às condições ideais de microaerofilia, foi o responsável pelos bons resultados apresentados. O emprego da mistura gasosa constituiu-se no segmento de maior custo no método proposto, mas essencial para O exito do diagnóstico, pois nem todas estirpes desenvolvemse nas condições geradas pela vela (7).
Segundo GARCIA et alii (5), somente com a adoção de técnicas mais eficientes, pode-se conhecer a real abrangência da infecção num plantel, principalmente em centrais de inseminação.
No Brasil, durante anos, animais de centrais de inseminação foram considerados negativos para campilobacteriose, o que demonstra a inadequação da metodologia usualmente utilizada quando se deparar com os resultados apresentados.
Dessa forma, conclui-se pela urgente revisão da metodologia empregada normalmente no monitoramento da campilobacteriose genital de touros, principalmente daqueles doadores de semem.
AGRADECIMENTO
Os autores agradecem a Arcangelo Nigro e Filhos Ltda. , pelo valiosa colaboração no presente trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- 1 BERGEY'S Manual of sistematic bacteriology. Eds. J .C. Hold, N.R. Krieg. Baltimore, Willians & Wilkins, 1984. V. 1., p. 111-8.
- 2 CLARK, B.L.; DUFTY , J .H.; MONSBOURGH, M.J. A method for maintaining the viability of Vibrio fetus var. venerealis in samples of prepucial secretions collected from carrier bulls. Austr. Vet. J., 48:462-4, 1972.
- 3 D' APICE, M. Ocorrência de aborto bovino no Estado de São Paulo devido ao Vibrio fetus. Biológico, São Paulo, 22:15-8, 1956.
- 4 DUffY, J.H. Diagnosis of vibriosis in the bull. Austr. Vet. 43:433-7, 1967.
- 5 GARCIA, M.M.; ROCKERBAUER, G.M.•, EAGLESOME, M.D. Detection of Campylobacter fetus in artificial insemination bulls with a Tranport Enrichment Medium. Can. J. Comp. Med. , 47:336-40, 1983.
- 6 GASTRIN, B.; KALLINGS, L.o.•, MARCETIC, A. The survival time for different bacteria in various transport media. Acta Pathol. Microbiol. Scand.,74371-80, 1968.
- 7 GENOVEZ, M.E.•, SCARCELLI, E.; PICONE, A.B.B. Avaliação de dois métodos de coleta no diagnóstico da campilobacteriose genital em touros. Biológico, São Paulo, 52:7-11, 1986.
- 8 RAMOS, A.A.; GUIDA, H.G.; ANDRADE, V.L.B. Comparação de três técnicas de coleta de amostra de material prepucial para diagnóstico da Campilobacteriose. Pesqui. Agropecu. Bras. ,21:303-9, 1986.
- 9 SUTKA, P. e KATAI, P.L. Rapid demonstration of bull frichomonnamsis in unstained smear preparations from prepucial scraping. Acta Vet. Acad. Sci. 19:385, 1969.
- 10 TEDESCO, L.F.•, ERRICO, F.; BAGLIVI, L.P. Comparison of three sampling methods for the diagnoses of genital vibriosis in the buli. Ausfr. Vet. 1., 53:470-2, 1977.
