CARACTERIZAÇÃO DE LINHAGENS CELULARES: I - IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES POR ANÁLISE ISOENZIMÁTICARESUMO
A confirmação da espécie de 10 linhagens celulares, pertencentes a 6 espécies animais, foi feita através da análise das isoenzimas da lactato desidrogenase (LDH) e da glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PD). Todas as linhagens celulares exibiram uma única banda de G-6-PD. As cinco bandas de LDH foram obtidas nas linhagens celulares de origem suína, bovina e símia; quatro nas de leporina e equina; e uma banda nas de hamster. As células de diferentes espécies animais puderam ser distinguidas uma das outras através dos padrões comparativos das isoenzimas da G-6-PD e LDH.
PALAVRAS-CHAVE:
linhagens celulares; isoenzimas; lactato desidrogenase; glicose-6-fosfato desidrogenase
ABSTRACT
Isoenzyme analysis oflactate dehydrogenase (LDH) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G-6-PD) was employed for species-specific identification of 10 cell lines belonging to 6 different animal species. All cell lines exhibited a single G-6-PD band. Five LDH bands were obtained in cell lines derived from pig, cattle and monkey and a single band in hamster cell lines; cell lines derived from rabbit and horse exhibited four LDH bands. The cells of these animal species could be distinguished from each other by comparison ofboth the G-6-PD and LDH zymograms.
KEY WORDS:
cell lines; isoenzymes; lactate dehydrogenase; glucose-6-phosphate dehydrogenase
INTRODUÇÃO
A caracterização das linhagens celulares vale-se de um conjunto de dados relativos ao crescimento populacional, citogenética, presença ou ausência de agentes adventícios, suscetibilidade celular a diferentes amostras virais, identificação de espécies etc (HATT, 1975; LEIBOVITZ et al., 1979).
A identificação das espécies de origem das linhagens celulares pode ser feita através de testes imunológicos, cariótipo ou análise de isoenzimas (LEIBOVITZ et al., 1979; NELSON-REES et al., 1981; O'BRIEN et al., 1977).
A determinação eletroforética das isoenzimas mostra que padrões eletroforéticos característicos são obtidos de tecidos recém-isolados de diferentes espécies animais e de células cultivadas in vitro (MONTES DE OCA et al., 1969). Assim, a determinação da mobilidade eletroforética de 2 ou 3 sistemas de isoenzimas é suficiente para discriminar linhagens celulares derivadas de diferentes espécies. As diferenças encontradas servem como um parâmetro efetivo de identificação de espécies além de identificarpossíveis contaminações interespécies (O'BRIEN et al., 1981). Dentre as isoenzimas mais comumente utilizadas, estão a lactato desidrogenase (LDH) e a glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6-PD) (HATT, 1975; MONTES DE OCA et al., 1969).
O objetivo do presente trabalho é caracterizar as linhagens celulares utilizadas no Instituto Biológico através da análise das isoenzimas da LDH e G-6-PD para confirmação da espécie e/ou possíveis contaminações interespécies.
MATERIAL E MÉTODOS
Linhagens celulares: 10 linhagens celulares de 6 espécies animais (suína, bovina, símia, equina, leporina e hamster) foram utilizadas: IB-RS-2 clone D-10 (Instituto Biológico-rim suíno ATCC-CRL 1835); PK(15) (porcine kidney, Sus scrofa ATCCCCL 33 ); MDBK (Madin and Darby Bovine Kidney ATCC-CCL 22); RK13 (Rabbit Kidney - ATCC-CCL 37); Vero (Vero "ATCC"-African green monkey kidney-ATCC-CCL 81 e Vero "IAL"- proveniente da ATCC, porém cultivada durante 20 anos no IAL); E. derm (Equine Dermis, Equus caballus ATCC-CCL 57); BHK-21 clone 13 (Baby hamster kidney ATCC-CCL 10); RC-IAL (rim de coelho-Instituto Adolfo Lutz); V-79 (pulmão de hamster) e GBK (bovine kidney). As linhagens provenientes do American Type Culture Collection (ATCC), assim como as células RC-IAL e Vero-"IAL", provenientes da Seção de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz, foram mantidas no Centro de Cultivo Celular do Instituto Biológico. As células GBK e V-79, provenientes respectivamente do Instituto de Ciências Biomédicas e do Instituto de Química, da USP, foram mantidas na Seção de Biologia Celular deste Instituto. Todas as linhagens foram mantidas nas mesmas condições, em Meio Eagle Mínimo (MEM) acrescido de 8% de soro bovino.
Extração das enzimas: Foram utilizados 7 frascos com 6 x 106 células por frasco de vidro, com 40 cm" de área útil, por linhagem celular. Os extratos enzimáticos foram obtidos a partir do emprego de dois métodos distintos. No primeiro, rompimento celular por choque osmótico, cada frasco foi lavado duas vezes com PBS e as células foram coletadas após a raspagemcom bastão de vidro e centrifugadas sob refrigeração a 2.500 rpm por 10 minutos. A seguir, o sedimento foi lavado com tampão TNM pH 7,8 (0,01M Tris, 0,01 M NaCl e 0,0015 M MgCl2 ), ressuspenso em 1,0 mL de TNM e mantido por 10 minutos em gelo. As células foram homogeneizadas em homogeneizador tipo Dounce e centrifugadas a 2.500 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi coletado, distribuído em alíquotas e estocado a - 70 ºC (RODRIGUES, 1986). No segundo método, rompimento por congelamento/descongelamento, as células foram coletadas após a tripsinização e lavadas duas vezes com PBS por centrifugação (2.500 rpm por 10 min sob refrigeração). A seguir o sedimento foi lavado com tampão TNM pH 7,8 e ressuspenso em 1 mL de TNM. Esta suspensão foi mantida durante 15 minutos em banho de gelo, congelada -e descongelada em N2 líquido por três vezes e centrifugada. O sobrenadante foi coletado, distribuído em alíquotas e estocado a -70 ºC para posterior estudo das isoenzimas.
Eletroforese: A eletroforese, para ambas isoenzimas, foi feita horizontalmente em placa de gel de poliacrilamida a 5% com tampão fosfato. A concentração do tampão para a LDH foi 0,2 M na corrida e 0,01 M no preparo do gel. Para a G-6-PD, a concentração do tampão foi O,1 M na corrida e 0,01M no preparo do gel e ao tampão de corrida do cátodo foi adicionado 1 mL de NADP (10 mg/mL). Em cada orificio foi aplicado 10 µL de extrato celular submetido a corrida eletroforética realizada sob refrigeração a 20 mA por 6 horas.
Coloração: A atividade das isoenzimas foi visualizada nos géis pela coloração com sais de tetrazolium, como descrito por HARRIS & HOPKINSON (1976), por um período de tempo entre 1 a 2 horas dependendo da atividade dos extratos.
RESULTADOS
Os resultados da análise eletroforética comparativa das isoenzimas de LDH e G-6-PD, das linhagens celulares utilizadas (Tabela 1), estão esquematizados na figura 1. Todas as linhagehs celulares exibiram uma única banda de G-6-PD. Para a LDH, todas as cinco bandas foram obtidas nas linhagens celulares de origem suína, bovina e símia. As linhagens celulares de equino e leporino exibiram quatro bandas. Uma única banda foi obtida nas linhagens celulares derivadas de hamster.
Caracterização de linhagens celulares: I - Identificação de espécies por análise isoenzimática. 61
Linhagens celulares utilizadas na análise de isoenzimas para a identificação de espécies espécies linhagem celular ATCC teci_do de origem
A mobilidade das isoenzimas foi a mesma para cada espécie, independente do método empregado para o preparo dos extratos celulares.
DISCUSSÃO
A literatura descreve inúmeros métodos para a extração das enzimas das linhagens celulares. Pode ser por choque osmótico, sonicação ou etapas de congelamento e descongelamento (The Authentikit System, 1988; HATT, 1975). A escolha do método dependerá de equipamento disponível, da preferência do laboratório ou em alguns casos, da obtenção de extratos mais ativos e reproduzíveis (The Authentikit System, 1988). O segundo método, desenvolvido neste trabalho, combinando as técnicas utilizadas por outros autores (MONTES DE OCA et al., 1969; RODRIGUES, 1986; The Authentikit System, 1988), foi mais eficiente do que o primeiro método utilizado. Tendo em vista que o mesmo apresentou um rendimento ma10r de células e consequentemente de enzimas, foi estabelecido como o método a ser empregado no laboratório. A técnica de eletroforese horizontal em gel de poliacrilamida utilizada neste estudo também mostrou-se igualmente eficiente, prática e reproduzível para a análise das isoenzimas, inicialmente estudadas através da eletroforese vertical em gel de amido (HATT, 1975; MONTES DE OCA et al., 1969; O'BRIEN etal., 1981; RUDDLE & RAPOLA, 1970) e posteriormente em gel de agarose (The Authentikit System, 1988).
Como o número de bandas de isoenzimas LDH para algumas linhagens celulares foi inicialmente menor que o citado em literatura (dados não mostrados) e na possibilidade do tempo de corrida eletroforética não ter sido suficiente para migração e detecção destas isoenzimas, aumentou-se de 4 para 6 horas o tempo de corrida. Assim, após este período adicional de 2 horas, isoenzimas de algumas linhagens puderam então ser detectadas. As linhagens bovina e símia que inicialmente apresentaram quatro e três bandas respectivamente, passaram a apresentar as cinco bandas citadas em literatura (The Authentikit System, 1988; HATT, 1975; MONTES DE OCA et al., 1969). Por outro lado, na linhagem equina, apesar de ter sido detectado mais uma banda (passou de três para quatro), continuou diferindo da literatura, onde há trabalhos relatando cinco (The Authentikit System, 1988) ou três bandas (HATT, l975;MONTESDEOCA et al., 1969). As demais linhagens (suína, leporina e hamster) continuaram com o mesmo número inicial de bandas (cinco, quatro e um, respectivamente), compatível com The Authentikit System (1988) mas diferindo de outros trabalhos que relatam apenas uma banda para a espécie suína e três para leporina (HATT,1975; MONTES DE OCA et al., 1969). As diferenças que permaneceram, provavelmente devem-se ao fato que embora todas as cinco isoenzimas LDH sejam encontradas em todos os tecidos, de todas as espécies, não estão presentes nas mesmas concentrações (The Authentikit System, 1988); assim concentrações muito baixas de algumas isoenzimas não permitem a detecção sob as condições experimentais.
Os resultados para a G-6-PD também foram similares aos da literatura, com a detecção de apenas uma banda para cada espécie (The Authentikit System, 1988;HATT, 1975;MONTESDEOCA et al., 1969). Alguns trabalhos detectaram duas e três bandas para as espécies bovina e equina, respectivamente (HATT, 1975; MONTES DE OCA et al., 1969).
As linhagens de espécies diferentes e que exibiram o mesmo número de bandas da LDH, apresentaram mobilidades eletroforéticas diferentes nas bandas. A mobilidade eletroforética da única banda de G-6-PD para a maioria das linhagens também foi diferente. Desse modo, através dos padrões comparativos das isoenzimas da LDH e G-6-PD, as linhagens celulares de diferentes espécies puderam ser prontamente distinguíveis uma das outras e mostraram-se ausentes de contaminação interespécies. Assim a metodologia padronizada neste laboratório permite caracterizar as linhagens celulares como livres de contaminação entre espécies.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- AUTHENTIKIT SYSTEM. Handbook for cell authentication and identification. 2.ed. 1988.
- HARRIS, H. & HOPKINSON, D.A. Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics. Amsterdam: North-Holland, 1976.
- HATT, H.D. ATTC Quality contrai methodsfor cell tines. 1.ed. Rockville, Md: American Type Culture Collection, 1975.
- LEIBOVITZ, A.; WRIGHT, W.C.; PATHAK, S.; SICILIANO, M.J.; DANIELS, W.P.; FOGH, H.; FOGH, J. Detection and analysis ofa glucose-6-phosphate dehydrogenase phenotype B cell line contamination. J. Natl. Cancer Inst., v.63, n.3, p.635-643, sept., 1979.
- MONTES DE OCA, F.; MACY, M.L.; SHANNON, J.E. Isoenzyme characterization of animal cell cultures. Proc. Soe. Exp. Biol.Med. v.132,p.462-469, oct./dec., 1969.
- NELSON-REES, W.A.; DANIELS, D.W.; FLANDERMEYER, R.R. Cross-contamination of cells in culture. Science, v.212, p.446-452, april, 1981.
- O'BRIEN, S.J.; KLEINER, G.; OLSON, R.; SHANNON, J.E. Enzyme polymorphisms as genetic signatures in human cell cultures. Science, v.195, n. 4284, p.1345-1348; march, 1977.
- O'BRIEN, S.J.; SHANNON, J.E.; GAIL, M.H. A molecular approach to the identification and individualization of human and animal cells in culture: Isozyme and allozyme genetic signatures. In vitro, v.16, n.2, p.119-135, jan., 1981.
- RODRIGUES, M.A. La R. Doseamento da atividade da glicose-6-fosfato desidrogenase em células in vitro. Arq. Inst. Biai., São Paulo, v.53, n.1/4, p.85-86, jan/dez., 1986.
- RUDDLE, F.H. & RAPOLA, J. Changes in lactate dehydrogenase and esterase-specific activities, isozymic pattems, and cellular distribution during the growth cycle of PK cells. Exp. Cell Res., v.59, n.3, p.399-412, march, 1970.
