CONIDIOGÊNESE DE ZOOPHTHORA RADICANS (BREFELD) BATKO SOBRE EMPOASCA KRAEMERI (ROSS & MOORE), À DIFERENTES TEMPERATURASRESUMO
Foi analisada a conidiogênese do fungo Zoophthora radicans (Brefeld) Batko (isolado ARS-1590) sobre diferentes ínstares de Empoasca kraemeri (Ross & Moore) a 20ºC e 100% de UR, e sobre ninfas de 5ºínstar à diferentes temperaturas e 100% de UR. A produção de conídios foi diretamente proporcional à idade do hospedei_ro, na fase de ninfa. A faixa ótima de temperatura para o patógeno foi de 20 a 25ºC, sendo a faixa de 15 a 20ºC favorável.
PALAVRAS-CHAVE:
Empoasca kraemeri, cigarrinha verde; Zoophthora radicans, controle biológico.
ABSTRACT
Sporulation of Zoophthora radicans (ARS-1590 isolate) on Empoasca kraemeri of differents ·ages, at 20ºC and 100% RH, and on fifth-instar of the insect, at differents temperatures and 100% RH, were investigated. The conidial production was directly related with the leafhopper age, on the nymph phase. The optimal temperature to Z. radicans ranged from 20 to 25ºC, although adequate sporulation also occured from 15 to 20ºC.
KEY WORDS:
Empoasca kraemeri, leafhopper; Zoophthora radicans, biological control.
INTRODUÇÃO
Os estudos dos fatores que podem afetar o desenvolvimento epizoótico deentomopatógenos são importantes para o sucesso dos programas de controle biológico de pragas, principalmente quando envolve um fungo como'Zoophthora radicans (Brefeld) Batko, capaz de se estabelecer na população do inseto, desde que seja aplicado para a formação de focos primários da doença. A conidiogênese desse fungo pode ser afetada por diferentes fatores, dentre os quais a temperatura e idade do hospedeiro.
A temperatura é considerada importante para a ocorrência de epizootias de fungos, especialmente de Entomophthorales, em virtude de afetar, segundo CARRUTHERS & SOPER (1987), três estágios de desenvolvimentodos patógenos: formação edescarga de conídios; germinação do conídio e penetração do tubo germinativo no inseto; e crescimento vegetativo dentro do hospedeiro.
MILNER&LUTTON(l983)verificarammaior · produção do fungo Z. radicans sobre Therioaphis trifollii maculata, quando incubado a 25ºC, tendo a conidiogênese iniciado 4 horas após o patógeno ser exposto à condição favorável de umidade, com a produção de conídios atingindo o pico 4 a 8 horas após o início da conidiogênese. SOPER (1985) constatou um mesmo período para o fungo iniciar a conidiogênese sobre Choristoneura fumiferana, após a exposição do patógeno em condição favorável dê úmidade e a 20ºC. Em temperaturas de 15, 10 e 5 ºC, o tempo para iniciar aconidiogênese aumentou progressivamente para 6, 10 e 16 horas respectivamente, e a produção de esporos decresceu, caindo bruscamente para temperaturas abaixo de 15ºC. Assim, a ocorrência das epizootias de Z. radicans tem sido relacionada com temperaturas superiôres a 15ºC (MILNER & BOURNE, 1983; WRAIGHT & ROBERTS, 1987).
McGUIRE et al. (1987) constataram que os conídios primários de Z. radicans, inoculados sobre Empoasea fabae, causaram maior porcentagem de infecção quando incubados a 20ºC. Os conídios resultaram em infecção do inseto mesmo quando incubados a lOºC, sendo inibidos a 32ºC. Na temperatura de 20ºC, a infecção ocorreu após 3 a 4 horas da inoculação do fungo (WRAIGHT et al., 1990), podendo o mesmo levar até 16 horas para infectar a espécie Acyrthosiphon kondoi, quando incubados à lOºC (MILNER & BOURNE, 1983).
A temperatura ótima para o crescimento vegetativo de uma raça de Z. radicans, estudada "in vitro" por BEN-ZE'EV (1980), foi de 27ºC, .sendo a máxima de 33ºC. McGUIRE et al. (1987) verificaram que o fungo pode colonizar o inseto mésmo quando submetido à temperatura de 32ºC durante um período de até 24 horas. O tempo para o fungo se desenvolver dentro do inseto e causar a sua morte, na temperatura de 20ºC, tem sido em torno de 2 a 5 dias conforme o hospedeiro (MILNER & LUTTON, 1983; SOPER, 1985; GALAINI-WRAIGHTet al., 1991), podendo levar de 12 a 15 dias para matar a espécieAcyrthosiphon kondoi a 8ºC (MILNER & BOURNE, 1983).
A idade do hospedeiro, predominante na população, pode limitar ou contribuir para o desenvolvimento epizoótico desse fungo. Tornase limitante quando o hospedeiro encontra-se em sua fase inicial, acarretando em uma baixa produção de inóculo do patógeno. A contribuição se dá em função do avanço na fase do inseto, permitindo um aumento na produção de inóculo conforme, se expande o corpo do hospedeiro, e melhor disseminação .do patógeno quando o hospedeiro atínge a fase alada.
O fu,ngo Z. rqdicans é um importante inimigo nat4ral da cigarrinha verde do feijão, Empoasca sp.
O objetivo deste trabalho é estudar a conidiogênese desse fungo em diferentes temperaturas e diferentes ínstares de E. kraemeri .
MATERIAL E MÉTODOS
No Laboratório de patologia de insetos do Centro Nacional de Pesquisa de Arroz e Feijão (CNPAF), da EMBRAPA, estudou-se a conidiogênese do isolado ARS-1590, originado de Empoasca sp. do Estado de Goiás, Brasil, sobre insetos do 5º ínstar, nas temperaturas de 5, 10, 15, 20 e 25ºC, e sobre insetos do 1º ao 5° ínstar e adultos, na temperatura de 20ºC. Os insetos utilizados foram obtidos de criação em laboratório, utilizando-se plantas· de caupi, Vigna unguiculata. O fungo foi produzido na superfície de meio de cultura líquido à base de dextrose (1%) e extrato de levedura (1%) e utilizado na forma de micélio fresco. Para a instalação do experimento, o fungo foi previamente filtrado, pulverizado com maltose a 10% e transferidos para uma câmara úmida formada dentro de uma placa de Petri, contendo papel de filtro umedecido com a mesma solução. Em seguida, a placa de Petri, contendo o micélio fresco do patógeno, foi acondicionada dentro de geladeira e mantida por aproximadamente 15 horas, visando estimular a conidiogênese.
O fungo foi inoculado sobre os insetos mediante a utilização de pequenas gaiolas. Cada gaiola era constituída de uma placa de plástico de 4,0 cm de diâmetro e de fundo aberto, contendo apenas um segmento de 0,5 cm de largura, ligado entre as duas extremidades laterais opostas. A placa foi colocada sobre a face inferior de uma folha de caupi, que por sua vez foi estendida com a face superior sobre uma chapa de acrílico (15,5 x 10 cm). O conjunto foi fixado com um parafuso ligando o segmento do fundo da placa com a chapa de acrílico. Na parte de dentro da tampa da gaiola foi colocada uma camada de agar-água com antibiótico. Para a inoculação dos insetos, pequenos círculos de micélio fresco foram distribuídos sobre a camada de agar-água da tampa, e acondicionados dentro de uma câmara úmida (saco plástico contendo papel de filtro umedecido), no interior de uma incubadora regulada a 20 ± 0,5ºC, visando aumentar a conidiogênese do fungo.
Após quatro horas, as gaiolas. e as superfícies expostas das folhas foram umedecidas com uma fina névoa de água destilada, para simular o orvalho natural. Os insetos foram anestesiados com CO2 e colocados na superfície úmida da folha em cada gaiola. As tampas das gaiolas, contendo o fungo em conidiogênese, foram colocadas sobre os insetos e mantidas por aproximadamente 5 minutos (período de duraçãodaanestesia),expondo-osà"chuva" deconídios. Durante o período de exposição, as tampas contendo o fungo eram constantemente giradas para assegurar uma distribuição uniforme dos conídios. Foram utilizados cerca de 25 insetos por gaiola de inoculação.
As gaiolas contendo os insetos inoculados foram colocadas dentro de sacos plásticos contendo umidade saturada (produzida através de papel toalha umedecido), e mantidas a 20 ± 0,5ºC por doze horas no esruro, para simular as condições naturais da noite. Após esse período os insetos foram transferidos para outras gaiolas maiores, acondicionadas em incubadoras, também reguladas a 20 ± 0,5ºC e doze horas de fotofase, onde foram feitas as avaliações de mortalidade. Estas gaiolas eram constituídas de tubos de acn1ico, sustentados. por uma plataforma com 13 x 15 x 18 cm, também de acn1ico, contendo um recipiente (200 mL) com água na parte inferior. Um folíolo de caupi foi mantido dentro do tubo, tendo o seu pecíolo atravessado pela plataforma e mergulhado dentro do recipiente com água. Na parte lateral do tubo haviam duas fileiras de dois furos cada (1,5 cm de diâmetro por furo), sendo uma oposta a outra, visando facilitar a coleta dos insetos mortos. Estas aberturas permaneceram fechadas com rolha quando não utilizadas. Na tampa do tubo foi feito um orifício de 4,0 cm de diâmetro, o qual foi tampado com "filó".
Logo após a morte do inseto cada cadáver foi colocado individualmente sobre uma camada de agar-água (1,5%) depositada no fundo de uma pequena placa de Petri, que por sua vez foi invertida sobre a tampa. Uma camada contendo 1,5 mL de gelatina (10%) com 1% de triton x-100 foi depositada sobre a parte interna da tampa, abaixo do cadáver. Foram utilizados 10, 13, 15, 21 e 17 cadáveres para as temperaturas de 5 a 25ºC respectivamente, e 4, 14, 13, 14, 21 e 9 parà as fases do 1º ínstar a adulto, respectivamente. Os conídios descarregados do fungo caíam sobre a superfície gelatinosa e morriam aderidos. A gelatina sobre as tampas foram observadas em intervalos de duas horas antes do início da conidiogênese, sendo coletadas e substituídas a cada 6 horas, após o início, até o final de produção de conídios. Os experimentos foram conduzidos na ausência de luz, dentro de incubadoras reguladas com as diferentes temperaturas e a 100% de Umidade Relativa (UR).
As camadas gelatinosas contendo o fungo foram secas e estocadas até que os conídios pudessem ser contados. Para a contagem, cada camada foi colocada dentro de um tubo de ensaio contendo 1,5 mL de água destilada mais TWEEN-80 (0,1%), o qual foi mantido em banho-maria. Após o derretimento da gelatina, o conteúdo foi agitado em um agitador de tubos de ensaio e vertido. dentro de uma pequena placa de Petri, demarcada na face inferior com duas faixas perpendiculares de 1 mm de largura cada uma. A contagem dos esporos foi feita com o auxílio de um microscópio óptico, percorrendo as faixas demarcadas nas placas e, em seguida, extrapolando para a área total da placa.
Nos cálculos dos tempos para ocorrer diferentes níveis da conidiogênese de Z. radicans sobre o inseto, após a morte do hospedeiro, foram utJ.lizadas as médias de· tempos estimados pelos logaritmos das curvas ajustadas aos dados da conidiogênese de cada cadáver.
RESULTADOS
O número total de conídios do fungo, produzidos em função da idade do inseto, aumentou progressivamente do 1º ínstar ao 5º ínstar, variando de 2,2 x 103 a 26,4 x 103 conídios/inseto (Tabela 1). O aumento verificado está relacionado à expansão do volume do corpo do inseto do 1º para o 5º ínstar. A produção de conídios na fase adulta do inseto, de 20,7 x 103 , foi levemente inferior à do 5º ínstar.
O tempo para o início da produção de conídios do fungo, após a morte do inseto, foi de 6 horas para ninfa do 1º ínstar, aumentando gradativamente para 6,1; 6,2; 7,0; 9,1 e 13,5 horas para ninfas de 2°, 3º, 4° e 5º ínstar e adulto, respectivamente.
Os tempos para atingir o acme da conidiogênese aumentaram progressivamente do 1º ao 5º ínstar e adulto, variando de 11,8 a 22,1 horas. Da mesma forma, para atingir 50% da conidiogênese, variou de 15,1 a 24,3 horas. Os tempos para ocorrer 97,5% da produção de esporos ficaram dentro da faixa de 40,0 a 48,0 horas, independente do ínstar do inseto. Estes resultados mostram que a idade do inseto não interfere na duração da conidiogênese do fungo sobre o hospedeiro.
Produção total de conídios e tempo (horas) para ocorrer diferentes níveis de conidiogênese de Zoophthora radicans sobre diferentes ínstares de Empoasca kraemeri, após a morte do hospedeiro, a 20º C.
Com relação à temperatura, o aumento da mesma de 5ºC para 10, 15 e 20ºC proporcionou um acréscimo gradativo na produção do fungo, que variou de 12,6 x 103 a 26,4 x 103 conídios por inseto. Na temperatura de 25ºC a produção de conídios foi um pouco inferior à produção obtida a 20ºC (Tabela 2).
Com relação ao tempo para iniciar a conidiogênese (2,5%), este aumentou de 9,1 horas a 20ºC para 9,5 a 25ºC e para 17,9, 26,7 e 39,1 horas, conforme se diminuiu a temperatura para 15, 10 e 5ºC, respectivamente.
Os tempos para ocorrer o pico da produção de conídios, após a morte do inseto, foram de 16,1; 16,6; 29,0; 43,7 e 70,6 horas, nas temperaturas de 25, 20, 15, 10 e5ºC, respectivamente, enquanto que· os tempos para atingir 50% da produção de conídios foram de 18,0; 19,4; 32,4; 55,0 e 81,6 horas nas respectivas temperaturas. Os tempos para ocorrer o pico da produção de conídios de E. . planchoniana sobre o afídeo A. kondoi, após o patógeno ser exposto à condição favorável de umidade, foram de 4 a 8 horas a 20ºC, 12 a 16 horas a 15ºC e 12 a 20 horas a 10ºC. Ocorreu um aumento do tempo de duração da conidiogênese de 34,4 para 42,6, 62,4, 116,4 e 171,8, provocado pelo decréscimo da temperatura de 25ºC para 20, 15, 10 e 5ºC, respectivamente. GLARE et al. (1986) constataram efeito semelhante das quatro maiores temperaturas e 4ºC, na conidiogênese do fungo Z. radicans sobre o afídeo Mysus persicae, tendo provocado um aumento na duração em torno de 32, 60, 72, 112 e 288 horas, respectivamente.
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
De acordo com a Tabela 1, pode-se afirmar que a ocorrência de epizootia pode ser influênciada pela idade dapopulação dohospedeiro, devendo os estágios mais avançados do inseto possibilitar um maior fornecimento de inóculo e contribuir para uma maior progressão epizoótica do patógeno. A fase adulta do inseto pode apresentar maior importância na epizootia do que insetos do quinto ínstar, uma vez que, sendo alada, contribui para uma maior dispersão do fungo, disseminando-o para locais mais distantes no campo infestado (GALAINI-WRAIGHT et al., 1991). A importância dos adultos nas epizootias já foi relatada para a cigarrinha da cana-de-açúcar por ALVES (1986), o qual considerou que os adultos do inseto são os responsáveis pela formação dos focos primários da doença provocada por Metarhizium anisopliae.
O período de tempo para o fungo iniciar a conidiogênese sobre insetos adultos de Empoasca sp., em condições de campo, é de aproximadamente 6 horas após a queda do orvalho (Wraight, informação pessoal). O aumento desproporcional no período de tempo para Z. radicans iniciar a conidiogênese sobre insetos de ínstares finais, conforme verificado nesta pesquisa (Tabela 1), pode ser considerado uma anomalia, provocada provavelmente pela falta de umidade nas condições do experimento e, consequentemente, pelo maior retardamento na absorção de umidade pelo fungo quanto maior o volume do corpo do inseto.
Produç_ão total de conídios e tempo (horas) para ocorrer diferentes níveis de conidiogênese de Zoophthora radicans sobre ninfa do 5º ínstar de Empoasca kraemeri, após a morte do hospedeiro, em diferentes temperaturas.
MILNER et al. (1984) mencionaram que o fungo Entomophthora planchoniana, incubado no afídeo A.kondoi, e submetido à temperatura ótima, necessita de 8 horas, após a morte do hospedeiro, para amadurecer e iniciar a produção de conídios. Segundo os autores, o fungo apresenta-se, principalmente, na forma de protoplastos pouco tempo antes da morte do hospedeiro, sendo necessário este período de tempo após a morte para ocorrer a formação da parede celular do patógeno dentro do hospedeiro e iniciar a conidiogênese. Assim, o sincronismo na mortalidade dos insetos no perído da tarde, conforme mencionado pelos mesmos autores, pode permitir que o patógeno amadureça ou inicie o amadurecimento dentro do hospedeiro, antes da queda do orvalho. Este fato provavelmente explica a habilidade que Z. radicans tem de iniciar a conidiogênese dentro do período de 4 a 8 horas após ser submetido às condições favoráveis de umidade (GALAINIWRAIGHT et al., 1991).
As temperaturas entre 20 e 25ºC podem ser consideradas ótimas ao fungo (Tabela 2), visto que a temperatura maior proporcionou uma redução de apenas 3,8% na produção de conídios e um tempo para iniciar a conidiogênese semelhante, em relação à temperatura de 20ºC. As temperaturas abaixo de 20ºC podem ser consideradas favoráveis até 15ºC, na qual verificou-se uma redução de 3,8% na produção de conídios e um aumento de duas vezes no tempo para iniciar a conidiogênese, em relação à temperatura de 20ºC. As temperaturas de 5 e10ºC proporcionaram reduções na produção de conídios de 53,8 e 50,0%, respectivamente, e aumentaram os tempos para iniciar a conidiogênese em aproximadamente 4 e 3 vezes, respectivamente, em relação à temperatura de 20ºC. Estes resultados confirmam as observações feitas por SOPER (1985) de que temperaturas abaixo de 15ºC são desfavoráveis ao desenvolvimento epizoótico do fungo. MILNER & LUTTON (1983) verificaram que Z. radicans apresentou maior produção de conídios na temperatura de 25ºC, enquanto que GLARE et al. (1986) constataram maior produção a 20ºC para Z. phalloides, com alta inibição da conidiogênese na temperatura maior. Estudando o efeito de temperaturas na conidiogênese de E. obscurus, E. planchoniana e E. exitialis sobre o afíceo A. kondoi,MILNER (1981) verificou que as faixas de temperaturas favoráveis para o desenvolvimento epizoótico pode ser de 5 a 25ºC para a primeira espécie, de 10 a 20ºC para a segunda espécie e de 15 a 25ºC para a terceira espécie.
Os resultados, em geral, indicam que Z. radicans e, provavelmente, outras espécies de Entomophthorales, preferem temperaturas mais amenas, em relação à grande parte dos fungos Hifomicetos. Os fungos M. anisopliae, Beauveria bassianaeNomuraea rileyi apresentam faixas de temperatura favoráveis para o desenvolvimento, de 24 a 30ºC, 22 a 26º e 20 a 30ºC, respectivamente, sendo que os dois últimos patógenos podem suportar temperaturas de até 45 e 35ºC, respectivamente(ALVES, 1986). O fungoVerticilliumlecanii desenvolve-se bem na faixa de 20 à 25ºC, podendo suportar uma temperatura de até 36ºC (HALL, 1981). HALL & PAPIEROK (1982) relataram que os fungos Entomophthorales são organismos predominante de clima temperado e apresentam temperaturas ótimas para o desenvolvimento em torno de 20ºC ou abaixo.
Os períodos com temperatura em tomo de 20ºC podem contribuir para uma maior eficiência de Z. radicans no controle da cigarrinha-verde, tanto por favorecer o patógeno, como por atrasar o ciclo da praga. Segundo KOUSKOLEKAS & DECKER (1966) a taxa de desenvolvimento deE.fabae atingiu o máximo na temperatura de 30ºC. Considerando-se que ociclo deE. kraemeri a 27ºC é de cerca de 19 dias (LEITE FILHO & RAMALHO, 1979), estima se que a 20ºC podem ocorrer mais de quatro ciclos do patógeno para uma geração da praga.
A produção de conídios de Z. radicans sobre E. kraemeri é diretamente proporcional a idade do hospedeiro; na fase de ninfa. A faixa de temperatura de 20 a 25ºC é ótima para o patógeno, sendo a faixa de 15 a 20ºC favorável.
AGRADECIMENTOS
Ao convênio EMBRAPNCNPAF - BOYCE THOMPSON INSTITUTE pelo apoio para a reali:zação dessa pesquisa.
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