TAXONOMIA, VARIABILIDADE E PATOGENICIDADE DO VERTICILLIUM CAUSADOR DE DOENÇA NO COGUMELO COMESTÍVEL (AGAR/CUS BISPORUS) NO ESTADO DE SÃO PAULO1RESUMO
O presente trabalho foi efetuado visando caracterizar taxonomicamente os isolados de Vertícillíum obtidos a partir de cultivos comerciais de cogumelos da região de Moji das Cruzes, SP, e verificar sua patogenicidade. Verificou-se que a principal doença do cogumelo comestível (Agarícus bísporus) é causada por Vertícíllíumfungícola do qual foi feita uma descrição sumária. A temperatura ótima para o crescimento micelial de 12 isolados de V.fungícola esteve entre 21-27ºC, em meios de Batata Dextrose Ágar e Meio de Aveia Ágar. Estas diferenças no ótimo de crescimento são uma indicação de variabilidade populacional. O ponto térmico letal dos conídios esteve entre 39-40ºC. Quando uma suspensão de conídios foi inoculada por aspersão no solo de cobertura todos os isolados foram patogênicos para o cogumelo comestível (A.bísporus), causando manchas, rachaduras, depreciando o valor comercial do produto e resultando em sintomas típicos de "bolha seca" que consiste na produção de corpos de frutificação disformes.
PALAVRAS-CHAVE:
Vertícillíum, cogumelo; taxonomia.
ABSTRACT
In the present papei Vertícillíum samples obtained from diseased mushrooms collected in several producing properties in the region ofMoji das Cruzes, SP, were taxonomically, morphologically, physiologically and pathologically studied in order to characterize the involved species. Twelve Vertícíllíum isolates were studied and identified as Vertícíllíum fungícola (Preuss) Hassebrauk. A brief description of the fungus based in the collected material was done. A species of Glíocladíum, probably a nematode trapping fungus, was also identified. The best micelial growth temperature for all the Vertícillíum fungícola isolates in potato dextrose agar and in oat agar was determine to be around 21-27 ºC, but most of them had the best growth at 24 ºC. The differences in the optimum micelial growth temperature js an indication of populational variation. The conidia thermal death-point is 39-40ºC. Pathogenicity assays of V. fungícola showed that all the 12 isolates were pathogenic to A bísporus causing cinnamon-brown and irregular discolored spóts on the surface of the cap. Many spots of a varying size and outline may occl.Ír. Under moist conditions, the enlarging spots may coalesce to form a large blotch. Later the spot may become depressed and sunken. These mushroom are edible, but are of reduced quality and commercial value. The parasite can also invade the tissue of the stem thus causing a splitting and splitering, often producing a tilted and dwarfed cap. When such mushrooms are cut open, a hollow cavity is frequently seen, the walls of which are covered with a whitish growth. The mushroom becomes dry, shrunken, distorted and unfit for sale. Finally the "bubble" formation is indicative of heavy contamination of the casing soil and it was more present in the end of the cultures. In this case the newly forming buttons are infected ata very early stage. The invading hyphae of the parasite arrest development leading to pileo malformations. The stem becomes swollen into a puffball-like stucture which do not decay but remain dry and leathery. In this disease stage the mushroom production is severly damaged.
KEY WORDS:
Vertícíllíum, mushroom; taxonomy.
INTRODUÇÃO
Os cogumelos comestíveis, apreciados em muitas dietas européias e orientais, vêm crescendo de importância nos últimos anos, já que o cultivo dos mesmos possibilita reciclar economicamente certos resíduos agrícolas e agro-industriais. Sob o ponto de vista nutricional, considerando o elevado conteúdo proteico dos cogumelos comestíveis, seu cultivo tem sido apontado como uma alternativa para incrementar a oferta de proteínas às populações de países em desenvolvimento e com alto índice de desnutrição EIRA & MINHONI (1992). A cultura é considerada uma atividade de meio ambiente protegido e tem mostrado um notável incremento em diversos países. Em 1950 a produção mundial era estimada em 50.000 toneladas, enquanto que em 1979 foi de 500.000 toneladas, ou seja, dez vezes maior. Os maiores países produtores foram EUA e França com cerca de 110.000 toneladas anuais, Taiwan com 80.000 tonela::las e Holanda com 40.000 toneladas. Na Inglaterra a produção foi, nessa época, de 60.000 toneladas com um valor comercial de 26 milhões de libras esterlinas, quase igual ao do tomate com 26,1 milhões por ano (SPENCER 1979).
No Brasil, no Estado de São Paulo, conforme informações de BONONI1 (1992), os dados sobre a produção de cogumelos não são precisos porque não existe um controle permanente e nem estatísticas da quantidade diária dos cogumelos que entram para a comercialização na Companhia de Entrepostos e Armazéns Gerais do Estado de São Paulo (CEAGESP). Estima-se, entretanto, que esteja ao redor de 6.000 toneladas/ano. No Estado de São Paulo, alguns municípios não muito distantes da capital como ltú, Atibaia, Mairinque, São Bernardo do Campo, Jaguariúna, Jarinú, Cabreúva, Itupeva e principalmente Moji das Cruzes, possuem as áreas produtoras mais importantes. ·
O cultivo de cogumelos é, portanto, um processo biotecnológico que utiliza materiais residuários da agricultura, pecuária e agro-indústria tais como, esterco bovino, equino, de aves, porcos e outros animais domésticos, palhas e outros incluindo os resíduos de trigo, arroz, milho, algodão, madeÍra e bagaço de cana para produzir alimentos saborosos e de alto valor nutritivo. O gênero Agaricus representa 70% da produção mundial e Lentinus cerca de 14%.
De acordo com os dados na escassa literatura nacional, o inicio do cultivo em escala comercial parece datar dos anos 50. Não existe uma documentação segura quepermita localizar , no tempo, o inicio do cultivo dessa espécie no Brasil, sendo certo, no entanto, que a popularização de seu hábito_ alimentar na região Centro Sul data de uns 40 anos.
Ao que tudo indica, quem primeiro deu início a estudos sobre o assunto no âmbito da Secretaria da Agricultura do Estado de São Paulo, tratando principalmente de adaptar a tecnologia estrangeira às nossas condições foi Júlio Franco do Amaral que trabalhou no Instituto Biológico (AMARAL, 1954/64). Entretanto, algumas informações sobre o cultivo de cogumelos já haviam sido publicadas pelo padre francês Camille Torrend que veio para o Brasil em 1914 e foi professor de Botânica na Bahia (TORREND, 1951). Embora recentemente a farta divulgação tenha despertado grande interesse pelo cogumelo comestível e já existam cultivas altamente especializados nos quais são empregados equipamentos sofisticados, no Estado de São Paulo, a maior parte dos cultivas é, ainda hoje, conduzida por famílias chinesas provenientes de Formosa. Os métodos de plantio mais frequentemente utilizados são resultado de uma experiência herdada por muitas gerações, porém destituídos de aprimoramento técnico em decorrência da falta de conhecimentos científicos mais aprofundados.
Relativamente às tecnologias de cultivo comercial, de fungos comestíveis no Brasil, pode-se afirmar que as mesmas restringem-se ao Agaricus bisporus, e mais recentemente ao Pleurotus spp e ao Lentinus edodes (Berk.)Singer, popularmente conhecido como "Shiitake". Mais recentemente, foi também introduzido em nosso meio a espécie Agaricus bitorquis (Quel.) Sacc. cuja tecnologia de cultivo é praticamente a mesma empregada para A.bisporus.
Adicionalmente também são raros os relatos de pesquisas brasileiras no assunto. Dessa forma, os produtores brasileiros tem-se limitado à importação e adaptação empírica de técnicas desenvolvidas na Europa, Ásia e América do Norte, principalmente pelo cultivo de linhagens importadas, e pouco aclimatadas às condições brasileiras.
Em um levantamento realizado de 1981 a 1986 na Região de Moji das Cruzes, SP, MUCCI & FIGUEIREDO (1981), FIGUEIREDO & MUCCI (1985) e COUTINHO et al. (1987) verificaram que a mais importante doença que afeta a cultura de A.bisporus é causada porVerticillium sp. Esta doença foi constatada em praticamente todas as propriedades visitadas e é a responsável pela queda da produção e qualidade do produto.
Segundo SPENCER (1979) a espécie V.fungicola é ainda hoje considerada como o mais importante patógeno deA.bisporus desenvolvendo-se onde quer que se cultive o cogumelo. Em se tratando dos mais importantes patógenos para o cogumelo comestível os fungos do gênero Verticillium que ocorrem sobre essa cultura necessitam de um estudo mais aprofundado. Há ainda necessidade de pesquisas sobre as diferentes espécies que possam ocorrer e melhores estudos sobre a sintomatologia, fisiologia e finalmente sobre a variabilidade genética que é o fator determinante do grau de patogenicidade bem como dodesenvolvimentode resistência àfungicidas, das diferentes populacões existentes em nosso meio.
O propósito dos estudos desenvolvidos neste trabalho foram os seguintes: 1) Estudar e identificar as populações de Verticillium existentes nos cultivas de Agaricus bisporus através de analise dos isolados obtidos em diferentes propriedades de cultivo comercial; 2) Caracterizaçãotaxonômica dos isolados comparando-se suas características morfológicas e fisiológicas; 3) Verificação da patogenicidade e dos sintomas pr9duzidos pelos isolados representativos de cada grupo morfológico a nível de microscopia e aspécto da cultura em meios de ágar.
Em uma breve revisão da literatura pertinente segundo SMITH (1924), a mais importante doença que afeta a cultura do cogumelo comestíve1Agaricus bisporus, conhecida atualmente por "bolha seca" (dry bubble), tem sido relatada cientificamente desde o final do século passado por pesquisadores como Costantin & Dufour na França em 1892 e posteriormente por Veihmeyer em 1914 na América. A doença foi também denominada de "La mole" pelos franceses e havia, naocasião, uma certa confusão sobre a real identidade do agente etiológico causador das anormalidades presentes nos cultivos de cogumelos. Os diversos estudos realizados por Costantin & Dufour e por Veihmeyer sobre a doença, procurando um maior esclarecimento sobre a mesma, chegaram a conclusão errônea de tratar-se de Mycogone perniciosa Magnus. Entretanto, foi SMITH (1924) o primeiro autor que conseguiu elucidar o problema da identidade etiológica, tão conflitante no passado. Ele conseguiu esclarecer que, embora as doenças apresentassem sintomatologia muito semelhantes, não poderiam ser atribuídas a apenas um agente etiológico como se pensava no inicio. No começo deste século, tendo em vista problemas crescentes em muitos cultivos, cujos cogumelos apresentavam deformações que foram observadas em propriedades na Inglaterra, o autor deu início a uma detalhada investigação sobre o verdadeiro agente causal da doença. Suspeitava-se que poderiam estar envolvidos mais de um agente etiológico. Este autor dedicou-se intensamente ao problema e, através de estudos comparativos e baseado em dados obtidos por outros autores, chegou a conclusão de que o problema envolvia três agentes etiológicos distintos: Mycogone perniciosa Magnus, Cephalosporium costantini Smith (=V.fungicola) e Cephalosporium lamellaecola Smith. Estas duas últimas espécies, foram minuciosamente descritas pelo autor.
WARE (1933) trabalhou com a mesma doença a partir de materiais de alguns focos encontrados em propriedades produtoras de cogumelos na Inglaterra apresentando a mesma sintomatologia descrita por outros pesquisadores.O autor fez um intensivo estudo sobre a doença, empregando vários métodos de inoculação em diferentes. formas de cultivo do cogumelo. Através de estudos morfológicos, estabeleceu um novo agente etiológico a que denominou Verticillium malthousei Ware.
HASSEBRAUK (1936), realizando estudos sobre fungos hiperparasitas de várias ferrugens dos cereais, identificouAcrostalagmus fungicola Preuss que havia sido descrito em 1851. O mesmo autor considerando que várias espécies do gênero Acrostalagmus, por possuírem características comuns, tinham sido transpostas para o gênero Verticillium, entre os quais se incluía Acrostalagmus fungicola, sugeriu a combinação V.fungicola (Preuss) Hassebrauk que é o nome hoje válido para a espécie do patógeno do cogumelo comestível .
TRESCHOW (1941), na Dinamarca, estu_dando uma doença observada em propriedades deprodutores de cogumelos, realizou estudos comparativos entre as espécies estabelecidas por SMITH (1924) e por WARE (1933) e também comMycogone perniciosa, chegando a conclusão, através de estudos dos caracteres morfológicos, sobre a existência de uma outra espécie de Verticillium patógeno para o cogumelo comestível a que denominou Verticillium psalliotae Treschow. A diferença mais marcante seria de caráter ontogênico, no mecanismo de formação dos conídios que resultam na forma característica côncavo-convexa dos esporos.
FASSATIÔVA (1965) estudou 10 isolados de Verticillium provenientes da Holanda, da Inglaterra, da Rússia e um isolado identificado como Cephalosporium costantini Smith proveniente de Budapeste (Hungria). Segundo a autora todas as espécies estudadas pertenceriam a uma mesma espécie V.malthousei, concluindo que V.psalliotae e C.costantini seriam .sinônimos da espécie descrita . por WARE (1933). Todavia, vários isolados foram obtidos de materiais outros que cogumelos doentes, e na descrição dos conídios das espécies estudadas ela referiu-se apenas a esporos lunatos ou fusiformes com extremidades ponteagudas em ambos os lados, características de V.psalliotae.
Segundo os conceitos do Commonwealth Mycological Institute, Kew, Inglaterra, citados por BRADY & WALLER(1976) eBRADY & GIBSON (1976), duas espécies distintas de Verticillium são consideradas serem parasitas de A.bisporus ou seja, V.fungicola e V.psalliotae. Segundo esses autores, elas são diferentes entre si em características morfológicas e fisiológicas.
Popee (1972), citado por ZAAYEN (1981), relatou que Agaricus bitorquis seria mais tolerante a Verticilliumfungicola queA.bisporus. Ainda, segundo a autora, a "bolha seca" causada por V jungicola, tão comum sobre A.bisporus, raramente infectaria A.bitorquis. A espécie relatada seria adaptada à temperaturas mais elevadas, desfavoráveis à Vjungicola.
A mais recente rev1sao sobre a taxonomia e patogenicidade de fungos do gênero Verticillium foi feitarespectivamenteporGAMS & ZAAYEN (1982) e ZAAYEN & GAMS (1982). Com referência aos aspectos taxonómicos eles sugeriram a divisão do gênero em 4 Secções e um grupo com características comuns pouco definidas a que denominaram Grupo Residual. Analisaram para isso os aspectos morfológicos e fisiológicos de culturas puras dos diferentes isolados crescidos em meio padronizado de Extrato de Malte Ágar à 2% (EMA) à temperatura de 20º C. Com essa metodologia estabeleceram uma chave dicotômicabaseada nos parâmetros: a)características do micélio somático; b)presença ou ausência de clamidospóros e microesclerócios; c)hábitos e morfologia dos conidióforos; d)fiálides; e)coloração das colônias e liberação de pigmentos em meio de cultura; f)velocidade de crescimento do talo somático etc, e estabeleceram as seguintes secções: 1) Secção Verticillium (hábitos variados); 2) Secção Nigrenscentia (patógenos vegetais causadores de murchas com estruturas negras de resistência, 3) Secção Prostrata (hiperparasitas fungícolas e nematófagos com Conidióforos decumbentes, 4) Secção Albo-erecta (espécies principalmente fungícolas, com conidióforos eretos, e 5) Grupo Residual (hábitos e características comuns pouco definidas). Nesta classificação, os fungos parasitas dos cogumelos comestíveis 'foram colocados nas Secções Prostrata (V.psalliotae) e Albo-erecta-(V.fungicola) . Com relação a estes grupos de fungos fungícolas foram estudadas as relações de temperatura, velocidade e limites termais de crescimento somático de diversos isolados, aspéctos morfológicos e determinaram as características de 3 espécies e 3 variedades de Verticillium, ou seja, V.fungicola var. fungicola (V.f.f.); V.fungicola var. aleophilum W. Gams & Van Zaayen (V.f.a.); V.fungicola var. flavidum (V.f.fl.) W. Gams & Van Zaayen;V.biguttatum W. Gams & Van Zaayen (V.b.) e V.psalliotae (V.p.).
Com respeito a patogenicidade das espécies de Verticillium que atacam o cogumelo, ZAAYEN & GAMS (1982) realizaram diversos estudos e verificaram queVerticilliumfungicola var.fungicola, o agente causal da "bolha seca", é responsável por prejuízos consideráveis nas colheitas de A.bisporus mas dificilmente prejudica culturas de A.bitorquis (=Psalliota edulis Vitt.).
Na Índia, DADWAL & JAMALUDDIN.(1984) relataram pela primeira vez uma doença causada por Gliocladium virens Miller, Giddens & Poster cujos sintomas característicos são: formação de uma lesão marrom necrótica nas margens do píleo que depois migra profundamente até o ponto de intersecção do estípe, no qual ·-também causa necrose· e fendilhamentos. Não há producão de qualquer odor diferente mas a aparência dos espóroforos é péssima. A doença foi reproduzida por inoculações artificiais. COUTINHO (1988) referindo-se a importância dos fungos do gênero Verticillium para o cogumelo comestível na região de Moji das Cruzes, SP estudou a suscetibilidade de Agaricus em três fases do seu desenvolvimento. Verificou que os efeitos foram mais danosos, como deformações nos píleos, quando as inoculações de uma suspensão de esporos foi feita no solo de cobertura, antes do aparecimento dos corpos de frutificação. Quando as inoculações foram feitas na época da manifestação dos primeiros botões, as deformações foram menores e depois das frutificações desenvolvidas houve o aparecimento de manchas marrons nos píleos e, mais raramente, rachaduras no estípe.
MATERIAL E MÉTODOS
Isolados utilizados: Os isolados de Verticillium utilizados nos ensaios foram obtidos em um levantamento realizado na região de Moji das Cruzes em 1987 e são apresentados na Tabela 1. Detalhes da metodologia empregada no isolamento das culturas foram minuciosamente descritas por COUTINHO (1994).
Estudos morfológicos: Para os estudos de microscopia, considerando que as estruturas reprodutivas de fungos do gênero Verticillium são muito delicadas e fáceis de serem destruídas pelo simples manuseio no preparo de lâminas comuns · para microscopia, houve a necessidade do preparo de micro culturas. Esse método permite que os especímens possam ser estudados "in situ" com uma melhor visualização das diferentes estruturas possibilitando estudos morfológicos mais detalhados como: disposiçãoe inserção dos conidióforos, maneira como os esporos são produzidos (ontogenia), contagem dos verticílios, dimensionamento das fiálides etc. As micro culturas foram preparadas conforme preconizado por HAWKSWORTH (1974) com pequenas modificações (COUTINHO 1994).
As medições foram feitas com o auxílio de uma ocular micrométrica, tendo sido feitas observações sobre a disposição e hábito dos conidióforos, número de verticílios ("whrols"), medições das fiálides (comprimento e largura) da base e do topo e observação sobre o hábito (maneira como ficam agrupados) dos conídios, sua morfologia e dimensões (comprimento e largura). Assim, foram tomadas amostras de 20 (vinte) exemplares de cada tipo de estrutura para cada isolado, visando obtenção dos dados morfológicos e cálculo médio das medidas efetuadas. As lâminas foram preparadas em lactofenol e coradas com azul de algodão. As observações e medições foram feitas a nível de microscopia ótica em magnitudes de 100 e 400X.
Relação dos isolados obtidos no levantamento de doenças do cogumelo comestível (A. bisporus) de 1985 a 1989 na região de Moji das Cruzes, SP.
As características morfológicas das linhagens ou isolados de Verticillium spp foram estudadas e os dados obtidos comparados com as desérições relatadas na literatura internacional pertinente (WARE, 1933; BRADY & GIBSON, 1976; BRADY & WALLER, 1976; GAMS & ZAAYEN, 1982) com o propósito de identificá-los a nível de espécie. Com esta finalidade foram preparadas micro culturas de todos os isolados.
A documentação cientifica foi realizada com o auxílio deuma câmara Nikon modêlo M 35-S adaptada a um microscópio Standard da Zeiss
Estudos fisiológicos: Quanto aos aspectos fisiológicos foram realizados estudos paradeterminar: 1-A temperatura ótima para o crescimento vegetativo, 2- O ponto térmico letal dos conídios, 3- A patogenicidade dos isolados.
Para determinação da temperatura ótima para o desenvolvimento vegetativo dos isolados de Verticillium, discos de meio de cultura (BOA) contendo micélio, de 7 mm de diâmetro, foram recortados dos bordos de colonias com cerca de 15 dias de idade com o auxílio de um furador de rolhas e transferidos para o centro de placas de Petri de 90x 20 mm contendo 20 mL de meio de cultura. Foram utilizados 3 meios de cultura Batata-Dextrose-Ágar (BOA), Meio de Aveia Ágar (MAA) e Meio de Malte Ágar (EMA), 13 isolados, 8 temperaturas e 4 repetições por tratamento num total de 384 placas para cc:,da meio de cultura. As temperaturas utilizadas foram 12º, 15º, 18º, 21º, 24º, 27º, 30º e 33ºC com precisão de ± 1ºC. As culturas foram mantidas nas câmaras de temperatura controlada até que aquelas mantidas à temperatura de melhor crescimento atingissem desenvolvimento equivalente ao diâmetro da placa de Petri o que ocorreu depois de 10 dias quando procedeu-se a leitura do diâmetro médio das culturas. Com os dados obtidos foram construídos os gráficos e determinadas as curvas de crescimento e os ótimos de temperatura para o crescimento micelial. O meio de Extrato de Malte (EMA) foi empregado com a finalidade de utilizar a técnica e os parâmetros usados por ZAAYEN & GAMS (1982) na separação de espécies e variedades de fungos do gênero Verticillium patógenos de cogumelos cultivados, através do ótimo de temperatura.
Para determinação do ponto letal térmico dos conídios, parâmetro também utilizados por ZAAYEN & GAMS (1982), foram preparadas suspensões de esporos de diversos isolados na concentração aproximada de 105 conídios. mL -•1. Depois 0,5 mL de cada uma delas foram pipetadas para tubos de ensaio de 15 x 1,5 cm com tampa rosqueada. Utilizando-se um aparelho de banho-maria FANEN, 110 V e 2000 Kw, modelo 120 E, os tubos de ensaio contendo as suspensões foram imersos em banho-maria com temperaturas reguladas para 36-37ºC, 38-39ºC, 40-41ºC e 41-42ºC por um período aproximado de 30 minutos. Foram acrescidos 5 minutos a esse tempo, que é o período necessário para equilibrar a temperatura inicial da alíquota da suspensão contida nos tubos com a temperatura dobanho maria conforme. indicação de ensaios preliminares. Depois dos 30 minutos os tubos foram retirados do banho-maria e uma gota de cada uma das suspensões foi colocada sobre discos de Ágar-Água de 2 cm de diâmetro, dispostos sobre lâminas para microscópio. As lâminas contendo os discos foram colocadas no interior de um cristalizador de vidro de 20 cm de diâmetro por 4 cm de altura e incubadas a 24ºC por 12 horas. As leituras foram feitas sob o microscópio ótico (x 400) avaliando-se a germinação.
Para ensaiar apatogenicidadedosdiversos isolados re Verticillium foi providenciado o cultivo de Agaricus bisporus. O substrato utilizado para o desenvolvimento foi o composto a base de bagaço de cana-de-açúcar + esterco de cavalo + Hp (75% umidade), segundoBONONI & TRUFEN (1986). O composto preparado foi distribuído em sacos plásticos de polietileno com capacidade para 2,5 Kg e "semeado" com a linhagem 006/2 de Agaricus bisporus que nos foi gentilmente cedida pela Seção de Micologia e Liquenologia do Instituto de Botânica da Secretaria de Meio Ambiente do Estado de São Paulo. Após o desenvolvimento do micélio os sacos plásticos semeados receberam o solo de cobertura e foram mantidos em uma câmara de temperatura para 18ºC. O solo de cobertura ou "casing soil", como é conhecido nos países de língua inglesa, trata-se de uma camada de 2-3 cm de espessura de solo leve, geralmente terra de textura arenosa que é colocada sobre o composto semeado . O solo foi previamente submetido àpasteurização. Esta práticaé fundamental na fase de pré frutificação de A.bisporus sem a qual não há formação dos basidiocarpos.
Para os testes de patogenicidade foram preparadas suspensões aquosas dos diferentes isolados a partir de culturas puras desenvolvidas em placas de Petri contendo meio de BDA. A idade aproximada das culturas utilizadas foi de 12-15 dias e a concentração das suspensões ajustadas para 105 conídios. mL- 1.
Conforme sugerido por COUTINHO (1988) as inoculações foram efetuadas 7 dias após a colocação do solo de cobertura borrifando-se sobre ela 10 mL das suspensões de conídios por saco de cultivo, empregando-se para isso, um aspersor de plástico acionado manualmente. Todos os isolados foram ensaiados inoculando-se 4 sacos por isolado, sendo que 4 sacos serviram como testemunha não inoculada num total de 56 sacos . No caso dos sacos controle o solo de cobertura foi aspergido com a mesma quantidade de água estéril.
A avaliação da patogenicidade e da manifestação da "bolha seca" foi feita diariamente a partir do dia em que começaram a aparecer os primeiros cogumelos, pela observação das manchas no píleo, rachaduras nos estípes e deformações das frutificações.
RESULTADOS
Estudos morfológicos: O crescimento e as características morfológicas e fisiológicas dos fungos foram estudadas em 3 meios de cultura, (BDA),_ (EMA) e (MAA) .O meio de EMA foi aquele utilizado para o cultivo das micro culturas de Verticillium para fins de identificação, descrição da espécie e estudos fisiológicos com o propósito de empregar a mesma metodologia e parâmetros utilizados por GAMS & ZAAYEN (1982).
Quanto ao aspecto das culturas em placas de Petri foram observadas alterações ou mutações setoriais em vários isolados (Fig. 1-A).
O preparo de micro culturas foi bastante útil para os estudos morfológicos permitindo uma perfeita visualização de todos os isolados estudados. Possibilitou também, uma ideia bastante clara da ontogenia das estruturas, isto é, a forma, a maneira, e a sequência de eventos que originam as diversas estruturas morfológicas e de reprodução, ou seja, conidióforos e conídios.
Os resultados obtidos nos estudos morfológicos e as medições das diversas estruturas de reprodução e posterior comparação com a literatura pertinente (BRADY & GIBSON, 1976; BRADY & WALLER, 1976; GAMS & ZAAYEN, 1982} permitiram a identificação dos isolados : 1B 280-H, 1B 281-H, 1B 290-H, 1B 293-H, IB-295-H, 1B 297-H, 1B 299-H, 1B 300-H, 1B 301-H, 1B 302-H, 1B 304-H e 1B 367-H obtidos na Região de Moji das Cruzes-SP, como sendo Verticillium fungicola incluído na Secção Albo-erecta erigida por Gams em 1982 (GAMS & ZAAYEN, 1982) e cuja sinonímia, descrição baseada nos especímens estudados é apresentada a seguir.
VERTICILLIUM FUNGICOLA (Preuss) Hassebrauk Phytopath. Z.(9):514, 1936.
= Acrostalagmus fungicola Preuss, Linnaea 24: 926, 1851.
= Cephalosporium costantini F.E.V. Smith, Trans. Br. Mycol. Soe. 10: 90, 1924.
= Verticillium malthousei Ware, Ann. Bot. 47: 781, 1933.
Colônias em placas de Petri com meio de Extrato de Malte-Ágar à 2%(EMA) brancas a creme-claras, de aspécto pulverulento, cotonosas ou aveludadas. Incolores ou pálido-amareladas quando observadas pelo verso da placa. Odor indistinto. Rifas vegetativas variando de 0,7 a 2,5 µm de espessura. Esporulação abundante e variável para muito abundante conforme o isolado. Conidióforos erguendo-se tipicamente de hifas imersas no meio de cultura, eretos e depois também decumbentes medindo de 130 a 442 µm de comprimento, contendo de 1 a 12 verticílios ("whrols") mas predominantemente de 6-7 e que formam um ângulo obtuso com o eixo do conidióforo. Fiálides medindo de 16 a 36 µm de comprimento e 1,8 a 2,0µm de largura na base, afinando nas extremidades distais (topo) para 1,2 a 0,6 µm. Conídios agrupados e imersos em substância viscosa formando estruturas globosas nas extremidades das fiálides. São longamente elipsoidais a quase cilíndricos, frequentemente afinando mas arredondados na extremidades distal. Lado da base indistintamente truncado e algumas vezes encurvados ao longo do eixo longitudinal; assimetricamente biconvexos a côncavo-convexos, paredes lisas mostrando frequentemente 1-2 ou mais gútulas inconspícuas; dimensões: (2,4) 4-6 (-12,0) x 1,5-1,8 (2,5) µm. Clamidospóros ausentes. Forma teleomórfica desconhecida. Temperatura ótima de crescimento 21-24 ºC e ausência de crescimento à 33 ºC. Temperatura letal para os conídios de 39-40ºC .
Trata-se, portanto, do organismo conhecido como o agente causal da "bolha-seca" e presente em praticamente todos os países onde o cogumelo comestível, Agaricus bisporus, é economicamente cultivado. A cultura e as estruturas características de V jungicola foram documentadas e são apresentadas na Figura 1-B, C, D, E, F e G.
O meio utilizado para a descrição foi o EMA. Observações realizadas em micro culturas empregando os meios de EMA, BOA e MAA demonstraram que em meios mais ricos há uma nítida tendência ao aumento do número de verticílios ("whrols") que também reflete no comprimento dos con dióforos. Também há um aumento na quantidade de conidióforos produzidos e do número de fiálides por verticílio
O isolado 296-H, embora semelhante, apresentou algumas diferenças em relação aos demais em várias característicàs quanto ao aspécto da cultura em EMA e estruturas de reprodução (Fig. l-H e 1). Nos testes de inoculação mostrou-se não patogênico aAgaricus bisporus. O isolado apresentou várias características de espécies nematófagas sendo identificado através de suas estruturas morfológicas como uma espécie do gênero Gliocladium (COUTINHO & CARVALHO JUNIOR (1990).
Os resultados dos ensaios para a determinação das curvas de crescimento encontram-se expressas nas Figuras 2. Essas figuras representam as curvas de crescimento dos isolados em meio de EMA. Nessas curvas pode ser verificado queo ótimo de crescimento vegetativo.ocorre em temperaturas ao redor de 24ºC. À 33ºC não houve qualquer crescimento vegetativo para a maioria dos isolados. O isolado 367-H não cresceu à 30ºC (Fig. 2). Apenas o isolado 296-H, que foi identificado taxonomicamente comoGliocladium, apresentou crescimento totalmente diferente, com desenvolvimentovegetativo ainda bastante apreciável (30 mm) à 33ºC (Fig. 3). Ensaios similares realizados em meio de BOA e MAA não mostraram diferenças significativas em relação aos realizados em meio de EMA e por isso os resultados obtidos deixaram de ser apresentados para evitar redundância .
O ponto térmico letal dos conídios para todas as linhagens de V jungicola isoladas no levantamento realizado na região de Moji das Cruzes esteve entre 39-40ºC. Para grande maioria dos isolados a temperatura de 39ºC foi letal para a maioria dos conídios, exceto para as linhagens 299-H e 302-H que, surpreendentemente, apresentaram germinação de 21 e 8% demonstrando haver uma variabilidade de comportamento nas diferentes populações dessa espécie fúngica.
Testes de patogenicidade: Após 7 dias da data da inoculação começaram a surgir os primeiros cogumelos que apresentavam manchas características no píleo. Depois de 14 dias manifestaram-se cogumelos com amplas manchas no píleo e que apresentavam rachaduras no estípe. A partir do 22º diada inoculação dos conídios, começaram a aparecer cogumelos stiolados e/ou deformados que são os sintomas mais característicos da "bolha seca". Esse tipo de manifestação manteve-se até o final do ciclo da cultura prejudicando de forma intensa a qualidade comercial e a produtividade de cogumelos. O fungo pode ser recuperado de material colhido a partir de todos os sacos inoculados. Com diferentes graus variáveis de infectividade todos os isolados foram patogênicos exceto o 296-H.
É dada a. seguir uma descrição detalhada dos diversos aspectos da sintomatologia decorrente da infecção de Vjungicola em A.bisporus a partir do cultivo inoculado artificialmente na época da distribuição do solo de cobertura e também da experiência adquirida em visitas a propriedades comerciais da região de Moji das Cruzes onde o problema se manifestava.
Os sintomas variam de acordo com a fase de desenvolvimento em que o cogumelo é infectado. Quanto a infecção é tardia, ou seja, aparece quando os cogumelos apresentam-se desenvolvidos ou em fase de colheita, ocorre o aparecimento de manchas escuras de tonalidade castanha, bordos irregulares e não definidos na superfície do píleo. Essa manchas são comumente pouco profundas e os tecidos situados logo abaixo da camada superficial são em aparência sadios (Fig. 4-A e B). Podem ocorrer também rachaduras, fendilhamentos e consequente descascamento do estípe; sintoma indicativo de que houve invasão dos tecidos do mesmo. Quando tais cogumelos são cortados longitudinalmenteé frequente observar-se uma cavidad interna também escurecida. Em virtude disto os cogumelos tornam se secos, enrugados e inadequados para o consumo (Fig. 4-C). Um segundo tipo de sintoma ocorre em uma fase intermediária do cultivo, quando em fase de botão, ou seja, quando começam a frutificar. Nesse caso observa-se uma espécie de estiolamento, isto é, o corpo defrutificação não mais se desenvolve e adquire uma coloração amarelada (Fig. 4-C). Finalmente, o terceiro tipo de sintoma é indicativo de infecções· precoces e mais severas e que significa uma pesada contaminação do composto ou do solo de cobertura. A sintomatologia é característica e bem mais marcante. Neste caso, como o micélio do Agarícus está se desenvolvendo no composto e o parasita apresentando a sua fase vegetativa bem desenvolvida, ambos os micélios se entrelaçam. Quando oAgarícus frutifica, dá origem a corpos de frutificação bastante ou totalmente deformados. Comumente não há diferenciação entre o estípe e o píleo formando uma massa disforme e de contornos arredondados que mais se assemelha a frutificação de um Gasteromiceto. As vezes aparecem cogumelos com estipe e píleo diferenciados mas apresentando tamanho reduzido. Outras vezes o estipe mostra-se entumecido edisforme dando origem a cogumelos enrrigecidos e com textura coriácea. O produto obtido é totalmente impróprio para comercialização (Fig. 4-D).
DISCUSSÃO
O isolamento de Vertícillíum nas diversas propriedades visitadas demonstra que esse patógeno do cogumelo comestível está largamente disseminado em toda a região produtora de cogumelos de Moji das Cruzes. Embora não hajam dados estatísticos oficiais, trata-se, provavelmente, do patógeno que mais prejuízos causa aos produtores. Pelo que foi observado durante o período de coleta de amostras, salvo poucas exceções, a doença por ele causada está presente na grande maioria dos cultivos, especialmente nos fluxos de produção do terço final da cultura. Estes dados concordam com àqueles obtidos por FIGUEIREDO & MUCCI (1985) em levantamento realizado nos municípios de Atibaia e Moji das Cruzes, SP no ano de 1981.
Um dos fatores que historicamente dificultam os estudos taxonômicos mais acurados das espécies de Vertícillíum fungícolas é o fato de não existirem amostras dos isolados obtidos pelos autores mais antigos (Costantin & Dufour, Veihmeyer, Smith etc) nas coleções dos centros de referência depositários de culturas fúngicas (CBS, ATCC, CMI etc)2 • Isto impossibilita estudos micológicos comparativos.
Nos estudos realizados por PASSATIÔVA (1965) com o propósito de estudar as espécies de Vertícillíum que ocorrem sobre o cogumelo comestível, entre os 11 isolados estudados, a autora incluiu a linhagem 90.861 identificada como V.psallíotae no CMI deixando de utilizar a linhagem 96.000, de mesma procedência, que havia sido isolada de A.bísporus por Manson em 1962 conforme catálogo de culturas do CMI, em 1975 (CMI 1975). Embora, entre os 11 isolados, ela tenha empregado um isolado identificado como V.malthouseí (=V.fungícola) proveniente do CBS que teria sido isolado por Ware, de acordo com o catálogo do CBS publicado em 1936 (CBS \936), as descrições apresentadas pela autora o encaixam perfeitamente, e somente nas descrições de V. psallíotae. Também a ontogenia ou morfogenese das descrições de PASSATIÔVA (1965) coincidem com àquelas de V.psallíotae parecendo que a autora trabalhou somente com isolados desta ultima espécie e não com V.malthouseí (= V.fungícola).
O emprego da técnica de micro culturas foi bastante útil para os estudos micológicos. Facilitou sobremaneira o exame, as medições, os estudos de ontogenia e a documentação fotomicrográfica dos achados. Nas preparações habituais, onde uma pequena parcela do meio de cultura contendo o fungo é transferida para uma lâmina com corante e coberta com lamínula, o arranjo dos conidióforos, das fiálides, e a disposição dos conídios são perturbados, impossibilitando o exame e a documentação fotomicrográfica. Também a elevada capacidade de esporulação e a delicadeza das estruturas dos espécimes estudados são fatores que dificultam uma boa visualização, tornando impraticável os estudos micológicos. O método das micro culturas resolveu este problema. Permitiu os estudos dos espécimes virtualmente "in situ", sem qualquer perturbação das estruturas desenvolvidas sobre a pequena peça de ágar nutritivo. As comparações dos dados morfológicos de treze culturas obtidas deA.bísporus mostraram que as mesmas eram diferentes das espécies fungícolasV.psallíotae (TRESCHOW, 1941; BRADY & WALLER, 1976),V.biguttatum W. Gams e também da variedade de V.fungícola var.flavidum Gams & Van Zaayen (GAMS & ZAAYEN, 1982). Esta ultima variedade produz escleródios, o que não aconteceu com qualquer dos isolados estudados no presente trabalho. Os doze isolados foram identificados comopertencentes aespécie V.fungicola (Preuss) Hassebrauk e uma IB-296-H como Gliocladium sp. que apresenta algumas características morfológi as semelhantes a Verticillium. Estes estudos confirmaram os resultados preliminares obtidos por COUTINHO & AZEVEDO (1991) que identificaram o fungo causador de doença em cogumelo comestível na região de Moji das Cruzes em São Paulo como, provavelmente, V.fungicola.
As medições realizadas nas estruturas somáticas e reprodutivas dos diferentes isolados de Verticillium mostraram uma certa variação, mas essa, sempre esteve dentro dos limites de variabilidade esperada para diferentes populações de uma mesma espécie. Quanto a aspectos fisiológicos, oscilações similares puderam ser observadas na curva de crescimento à diversas temperaturas dos diferentes isolados. Entretanto, todos os isolados tiveram o ótimo de crescimento consistentemente ao redor de 21-27 ºC principalmente, 24ºC e o crescimento interrompido à 33ºC exceto o isolado 367-H que não cresceu à 30ºC.
O ponto térmico letal dos conídios de todos os isolados esteve entre 39-40ºC que é também o ponto térmico letal referido na literatura para V.fungicola.
O isolado identificado como Gliocladium sp teve uma curva de crescimento diferente dos demais com o ótimo de crescimento à 27ºC e desenvolvimento ainda apreciável mesmo à 33ºC.
GAMS & ZAAYEN (l982) e ZAAYEN & GAMS (1982) criaram duas variedades de Verticillium fungicola: V.fungicola var. aleophilum Gams & Van Zaayen e V.fungicola var. flavidum Gams & Van Zaayen e que deram origem a variedade V.fungicola var. fungicola automaticamente estabelecida de acordo com o artigo 26 do Código Internacional de Nomenclatura Botânica (HAWKSWORTH 1974, p. 149). Por várias razões preferimos não entrar no mérito dessa questão nos limitando a identificar os isolados como pertencentes a espécie V.fungicola. Entre essas razões, referindo-se a aspectos taxonómicos GAMS & ZAAYEN (1982) dizem à página 63, ao descrever V.fungicola var. aleophilum: "Como na variedadefungicola os conídios são muito variáveis em forma e tamanho. A única diferença consistente entre as variedades é o máximo de temperatura". Ou sejaV.ff -ótimo 20-24ºC, máximo à 27ºC;V.fa.-ótimo 24-27º, máximo 33ºC. Portanto, de acordo com os autores, a diferença real entre V.fungicola var. fungicola e o V.fungicola var. aleophilum seria apenas à nível fisiológico. Como usualmente o nome do taxon infra específico variedade está nos limites dasdiferenças morfológicas detectáveis e, de acordo com o que relataram os próprios autores, essas diferenças não são consistentes, a nosso ver, seria preferível o uso de outros taxons infra específicos mais apropriados para exprimir diferenças fisiológicas como : forma especial, raça, biotipo etc. Por outro lado, ainda referindo-se a diferenças entre V.f j e V.fa.,ZAAYEN & GAMS (1982) trabalharam também com aspéctos patológicos. Realizaram inoculações experimentais e verificaram que A.bitorquis, que prefere temperaturas mais altas (25ºC) do que A.bisporus (16-18ºC) é muito menos suscetível V.ff do que esta espécie. Entretanto,V.f a. é capaz deproduzir manchas marrons deprimidas em A.bitorquis reduzindo seu valor comercial. Os autores referiram-se ao fato que V.f a. também seria capaz de causar deformações nos corpos de frutificação de A.bitorquis e fizeram descrições comparativas de sintomas causados por uma e outra variedade cujo subjetivismo não permite uma distinção muito clara entre as mesmas. Se fossemos tomar como base o fator temperatura. os espécimes por nós isolados estariam mais próximos de V.fungicola var. aleophilum (Vide curvas de temperatura das Figs. 2). Todavia, uma vez que todos os isolados se comportaram igualmente nos testes de patogenicidade produzindo sintomas característicos de "bolha seca" quando inoculados em A.bisporus e como não incluímos em nossos experimentos inoculações em A.bitorquis, enfatizando o que já foi dito anteriormente, preferimos identificar os isolados simplesmente como V.fungicola. Outros estudos serão necessários para esclarecer sobre a possibilidade da existência em nosso meio, de·V.psalliotae ou mesmo de diferenças marcantes entre as diversas populações de V.fungicola a ponto de justificar a criação de novos taxons infra específicos.
Embora, DADWAL & JAMALUDDIN (1984) tenham relatado a presença de Gliocladium virens Miller, Giddens & Poster na Índia causando doença no cogumelo comestívelA.bisporus,no qual induziria lesões marrons necróticas no píleo e fendilhamentos no estípe essa, seguramente, não é a espécie por nós isolada a partir de material colhido na propriedade do Sr. Lee, Bairro de Botujuru em Moji das Cruzes. Esse fato pôde ser comprovado pelas inoculações artificiais realizadas com o isolado 296-H em A.bísporus, ·as quais foram inócuas, não resultando em quaisquer sintomas nos cogumelos inoculados. Por outro lado, algumas estruturas bastante indicativas de espécies nematófagas, como a formação de anéis do tipo não constritantes3 , foram observadas na espécie isolada quando esta era cultivada em meio pobre em proteínas (A.A.). Convém salientar que tanto solos ricos em matéria orgânica como o composto utilizado para o cultivo de cogumelos são habitats excelentes para proliferação de espécies nematófagas.
Finalmente, a grande importância econômica de V.fungícola pode ser avaliada pela existência, no catálogo de 1982 da American Jype Culture Collection, de 19 linhagens registadas e mantidas por aquela Organização para fins de estudo científicos (ATCC 1982).
Não foram incluídos no planejamento deste trabalho, estudos sobre o controle profilático porque já existe, sobre o assunto, uma tecnologia bem estabelecida. Todavia, não poderíamos deixar de tecer alguns comentários sobre o problema com base na literatura levantada e nas observações e anotações de campo realizadas no período devisitas aos cultivos comerciais. Foi verificado, por exemplo, que a doença é prevalente no terço final dos cultivos e nas propriedades nasquais as instalações são mais rústicas. Quando os restos da "toalete" (fragmentos de estípe e rizomorfas) realizadas depois das colheitas não são destruídas e são deixadas próximas aos cultivos sem maiores cuidados e há uma grande infestação de moscas Sciaridae e Phoridae a incidência da bolha seca é maior. É importante a coleta do solo de cobertura em locais distantes de cultivo de cogumelos. Quando isso não é possível há necessidade de esterilização do solo por métodos químicos ou pela passagem de vapor aerado (WUEST & MOORE, 1972), pois a utilização da terra de cobertura contaminada por V.fungícola leva ao aparecimento da doença no início do cultivo. Essa incidência precoce é comercialmente desastrosa levando, seguramente, ao total insucesso. Estes dados estão de acordo com as observações feitas por NAIR & MACAULEY (1987) na Nova Zelândia. Um resumo das principais medidas profiláticas recomendadas em nosso meio podem ser encontradas em trabalho publicado por FIGUEIREDO & MUCCI (1985).
Apesar das pressões dos ambientalistas para que seja evitada a aplicação de defensivos agrícolas nos cultivos de cogumelos, cujas colheitas são realizadas diariamente, a literatura hoje existente sobre o controle alternativo das pragas e das doenças do cogumelo é ainda inexpressiva. As tentativas preliminares de OLIVIER et al. (1978) e OLIVIER (1987) procurando desenvolver alguns métodos para o controle biológico de V.fungícola com bactérias ou espécies não patogênicas de Tríchoderma não tiveram sucesso. Talvez o caminho mais promissor para o possível controle de V.fungícola sem a utilização de compostos químicos seja aquele proposto por KALBERER (1984) nos Estados Unidos. Este autor sugeriu o incremento dos estudos da biologia e bioquímica da interação de parasitismo de V.fungícola x Agarícus spp visando o auxílio na seleção de linhagens geneticamente resistentes à Vertícillíum e a outras doenças do cogumelo causadas por fungos.
V. fungicola: A - Cultura mostrando alteração setorial; B - Cultura creme-clara desenvolvida em meio de extrato de malte ágar; C - Conidióforos eretos originados de hifas submersas no meio de cultura. Observese os verticílios formando ângulo obtuso com o eixo principal (foto de microcultura lOOX); D - Conidióforo decumbente, fiálides e conídios (150X); E - Verticílios e fiálides (450X); F - Conídios agrupados formando estruturas globosas (400X); G - Fiálides isoladas e conídios característicos (450X).
Gliocladium sp.: H - Conidióforos iniciando a formação de conídios (450X); I - Conidióforos e conídios. Observe-se a morfologia diferentes daquela de V. fungicola (640X).
À esquerda píleos mostrando sintomas brandos e superficiais. No centro e à direita manchas marrons e deprimidas. B - Cogumelo em fase de colheita mostrando manchas marrons que depreciam o valor comercial. C - Cogumelos com rachaduras, fendilhamentos, enrrigecimento e descascamento do estipe. Observe-se à direta, frutificações amareladas e não desenvolvidas. D - À esquerda, cogumelo sadio. No centro e à direita, cogumelos com deformações características da "bolha seca".
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1
BONONI, V.L.R. (Instituto de Botânica, São Paulo - SP. Comunicação Pessoal).
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2
CBSCentraalBureau voor Schimmelcultures - Baam - Holanda; ATCC American Type Culture Collection - Rockville, Ma, USA; CMICommonwealth Mycological Institute - Kew - Inglaterra
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3
Anéis não constritantes são estruturas desenvolvidas por alguns fungos adaptados à caça de nematóides e que parasitam esses organísmos cOmo fonte alternativa de proteínas.
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