PRODUÇÃO DE NEMATÓIDES ENTOMOPATOGÊNICOS "IN VITRO"

Batista Filho, A.

doi:10.1590/1808-1657v63n1p0911996

RESUMO

O uso de nematóides para controle biológico de pragas requer técnicas de cultura massal que permitam produzir de forma rápida, econômica e simples, um grande número de nematóides. A presente revisão reúne as tecnologias desenvolvidas para a produção comercial de nematóides entomopatogênicos "in vitro".

PALAVRAS-CHAVE:
Nematóides entomopatogênicos; produção.

ABSTRACT

The use of nematodes for biologic control of pests requires efficient and economic technology for mass production of the agent. This work deals with about the production of entomopathogenic nematodes in vitro.

KEY WORDS:
Entomopathogenic nematodes; production.

INTRODUÇÃO

O uso de nematóides para controle biológico de pragas requer técnicas de cultura massal quepermitam produzir de forma rápida, econômica e simples, um grande número de nematóides.

Há mais de sessenta anos vêm sendo desenvolvidas tecnologias para produção de nematóides entomopatogênicos. Durante esse período, os nematóides têm sido produzidos através dos seguintes processos: infecção do inseto em meio artificial; culturas axênica ou monoxênica e fermentação fase sólida e líquida. A escolha do processo depende da quantidade deproduto necessário edo tempo, recursos e conhecimento disponíveis.

O fato de não se dispor de metodologia adequada para produção massal de muitos nematóides entomopatogênicos tem dificultado o desenvolvimento de projetos envolvendo esses agentes de controle biológico. O sucesso da comercialização desses bioinseticidas depende, basicamente, da capacidade de se produzir quantidades suficientes de produtos para suprir programas de manejo integrado de pragas. Sem a industrialização, o benefício da pesquisa científica jamais poderia tomar-se disponível para o público.

CONSIDERAÇÕES GENÉRICAS SOBRE A PRODUÇÃO "IN VIVO"

Os nematóides entomopatogênicos podem ser multiplicados "in vivo" e, nesse caso, larvas de Galleria mellonella têm sido muito utilizadas. Os métodos de criação do inseto hospedeiro, de infecção e incubação do nematóide e a colheita das formas juvenis infectivas têm sido descritos por DUTKY et al.(1964) e WHITE (1927).

O custo da produção de nematóides através da infecção de insetos é alto, excedendo a l(um) dólar para cada milhão de larvas infestantes; além disso o processo carece de alguma economia de escala. Entretanto, a mais importante é talvez a falta de economia de qualidade, pois a produção "in vivo" de nematóides é sensível às variações biológicas, à sanidade e ao estado fisiológico do hospedeiro, exigindo rigorosas práticas de controle (FRIEDMAN, 1990). Caso de resistência adquirida pelo inseto hospedeiro já foi observado em culturas de Strelkovimermis peterseni sobre Anopheles quadriculatus,devido ao uso de pupas que escaparam ao ataque dos nematóides. Observou-se, então, declínio gradual de produção.

Por outro lado, a multiplicação "in vivo" é necessária para fornecer inóculo básico para pesquisas de criação "in vitro" e para estudos sobre a fisiologia e biologia dos nematóides (AGUILLERA, 1988). Para a produção em larga escala, os métodos "in vitro" são mais práticos (WOODRING & KAYA, 1988) e serão objeto de nossas considerações.

EVOLUÇÃO DAS TÉCNICAS DE MULTIPLICAÇÃO "IN VITRO" DE NEMATÓIDES ENTOMOPATOGÊNICOS

Em 1931 Glaser foi capaz de reproduzir o ciclo de vida completo de Steinernema glaseri em meio artificial, sendo este o primeiro caso de sucesso com um nematóide parasito de qualquer espécie. Glaser, citado por FRIEDMAN (1990), observou que micróbios contaminavam as culturas causando um alto grau de variabilidade na produção. O autor desenvolveu a técnica de permitir que a "flora natural dos nematóides" (hoje conhecida como sendo o simbionte Xenorhabdus) colonizasse a superfície do meio de cultura baseado em ágar, antes da inoculação dos nematóides, com o objetivo de suprimir contaminações. Utilizando uma variedade de meios associados com leveduras vivas e compostos antimicrobianos, Glaser estabeleceu o primeiro processo de produção em larga escala para nematóides entomopatogênicos. O custo do processo, entretanto, era alto e as produções inconstantes. O autor observou, também, que após sucessivas multiplicações dos organismos em um meio constituído por infusão de carne de vitela - dextrose, ocorria redução no fator de crescimento, fato que Glaser associou à perda de um nutriente essencial. A reposição do referido fator, que é feita com leveduras vivas, substâncias do hospedeiro ou substância ovariana de bovinos, torna este meio caro e sem condições para aplicações à campo (AGUILLERA, 1988).

Glaser nunca identificou o nutriente essencial, mas o problema de organismos contaminantes foi solucionado pela produção de nematóides sobre insetos hospedeiros e o desenvolvimento de culturas axênicas.

Em 1940, Glaser, citado por FRIEDMAN (1990) foi o primeiro a desenvolver um sistema de cultura axênica para S. glaseri e mais tarde S. carpocapsae (=chresima). O inóculo axênico foi obtido por meio de um difícil processo de limpeza e desinfecção aplicado aos juvenis infectivos. Esse inóculo foi introduzido em meio de ágar contendo lg de rim de coelho (lg= lümL agar l %). Esse meio permite obter 50 gerações do nematóide. Além disso, GLASER et al. (1942) constataram que os nematóides poderiam viver igualmente bem em meios líquidos contendo extrato de rim de coelho, fígado e rim de boi, água e ágar. Fórmula semelhante (rim e fígado de boi, cloreto de sódio, água e ágar) foi empregada por POINAR e THOMAS (1966) para N. carpocapsae DD-136.

Stoll (1953) continuou o trabalho de Glaser com meios líquidos e observou que extrato de fígado cru adicionado a infusões de carne de vitela deu boa produção axênica de S. glaseri quando os tubos de crescimento foram agitados 100 vezes por minuto. Rotação menor que 100 vezes/minuto originaram baixas produções, enquanto rotações maiores foram deletéricas.

Os benefícios e riscos da boa aeração de culturas axênicas líquidas foram mostrados por HANSEN & CRYAN (1966). Parece que aeração constante remove a amônia e retarda a elevação do pH (BUECHER & HANSEN 1971). Esses autores relataram, ainda, que o simples borbulhar do meio líquido em garrafas assegurou altas produções e, pela primeira vez, apresentaram um método para produzir, axenicamente, grandes quantidades de nematóides em um meio artificial.

Os meios utilizados no processo de cultura axênica líquida passaram a ser estudados quanto à idéntificação do nutriente essencial ou "fator de crescimento" exigidos pelos nematóides. Os estudos de BUECHER et al. (1970) destacavam o papel das proteínas no crescimento deCaenorhabditisbriggsae.DUTKY et al. (1967) observaram que a incorporação de colesterol ao meio de cultura antecipou a formação de adultos e incrementou a produção de ovos viáveis. Novos componentes para crescimento e maturação de nematóides foram estudados por BUECHER et al. (1970) e LOWER & BUECHER (1971).

A descoberta de que "fatores de crescimento" beneficiavam culturas de nematóides entomopatogênicos levou à prática de;l multiplicação desses nematóides em conjunto com suas bactérias.

Um dos mais econômicos meios e que satisfaz as necessidades alimentares dos nematóides é a ração para cães. HOUSE et al.(1965) reportaram, pela primeira vez, o uso desse substrato para a produção massal, em cultura polixênica (com vários microrganismos associados), de Steinernema carpocapsae (DD-136). A técnica é simples e assim descrita: 20mL de ração para cães são misturados com 20mL de água destilada em uma placa de Petri de 9cm de diâmetro. O material é autoclavado por 15 minutos a 15 libras de pressão e resfriado de um dia para o outro sob condição estéril. Os nematóides que servem de inóculo são lavados 5 vezes com O,1% de formalina para remover a maioria dos contaminantes. Cada placa é inoculada com 1 a 2 x 10³ nematóides. Poucos dias após incubação (24ºC) tem origem um grande número de nematóides, indicado pela aparência cinza brilhante da cultura. Eles podem ser colhidos 8 a 14 dias após a inoculação. Os nematóides são lavados do meio de cultura para o interior de um grande recipiente e são deixados descansar. Os fragmentos suspensos do meio são decantados e descartados. Os nematóides são então armazenados a 5-lOºC em suspensões contendo formalina O,1%. Geralmente uma só placa produz cerca de 3 x 10⁵ nematóides em uma única colheita. Cada placa pode ser usada pelo menos seis vezes e é estimado que 60 a 80% dos nematóides coletados estejam no estágio infectivo.

A técnica de HOUSE et al. (1965) chegou a ser produzida, em larga escala, por firma comercial nos E.U.A, ao custo de US$ 1 por milhão de nematóides e produtividade de cem milhões de nematóides/técnico/semana(AGUILLERA, 1988).

HARA et al. (1981) descrevem modificações na técnica de HOUSE et al. (1965) com vistas à produção massal monoxênica (com um microrganismo associado). Pedaços triturados de ração para cães (100g) foram misturados com 500 mL de água com 1% de ágar. O material foi homogeneizado por 1 minuto e, em seguida, autoclavado por 15 minutos a 123ºC. Após refrigeração, alíquotas de 25 mL foram vertidas em placas de Petri plásticas e inoculadas com nematôides da cultura estoque monoxênica. As placas de Petri foram então lacradas com Parafilm e incubadas a 25ºC por 20 a 30 dias. Para a coleta dos juvenis infectivos, a tampa da placa de Petri foi removida e o fundo da placa, contendo o meio infestado de nematóides, foi colocado no interior de uma placa de Petri maior. Para essa placa, que era abastecida com 40mL de formalina 0,1%, migravam, através de uma ponte formada por papel de filtro esterilizado, os juvenis infectivos. Essas formas eram retiradas em dias alternados durante cerca de 3 semanas. A suspensão de nematóides era vertida para um copo (beaker-400 mL) e mantida em repouso por 45 minutos. O sobrenadante foi aspirado e os nematóides concentrados com o auxílio de uma centrífuga à 300 rotações por minuto durante 1 minuto. Esse material centrifugado foi transferido para frascos contendo solução de formalina O,1% e armazenado a lOºC.

Com esse método os autores obtiveram uma produção de 400.000 juvenis de S. carpocapsae por placa em uma única vez. Foram realizadas 5 a 7 coletas durante o período de 2 a 3 semanas, totalizando cerca de 2 milhões de juvenis por placa de Petri. O custo da produção massal foi de US$ 0,28 por milhão de larvas.

WOUTS (1981) descreve uma metodologia para a produção de Heterorhabditis heliothidis sobre meio artificial.

Em 1981, BEDDING propôs um novo processo para multiplicar, monoxenicamente, elevadas quantidades de nematóides das espécies de Steinernema e Heterorhabditis, possibilitando a produção de dezesseis bilhões de nematóides/ técnico/semana ao custo de aproximadamente US$ 0,02 por milhão de S. carpocapsae. A "técnica de Bedding" substituia a utilização de placas de Petri por frascos de 500 mL, em cujo interior eram colocadas tiras de espuma plástica (poliuretano) previamente embebidas em meio homogeneizado à base de rim de porco e carne de vaca. Os frascos de cultura eram inoculados com a forma primária da bactéria associada (Xenorhabdus nematophilus), incubadas a 20-30ºC por 2 horas e então recebiam os nematóides. O pico de produção foi obtido após a segunda semana e para extração (coleta) de larvas seguiu-se a técnica do funil de Baermann modificado (Goodey, 1963 citado por BEDDING 1981). Alguns anos depois, BEDDING (1984) reduziu, ainda mais, o custo de produção ao utilizar homogeneizado de vísceras de galinha revestindo espuma de poliéster-poliuretano contida em sacos plásticos (1,0 x 0,5m). Nessas condições, Bedding obteve cinquenta bilhões de nematóides/técnico/semana, ao custo menor que US$ 0,01 por milhão de indivíduos. Segundo o autor, miúdos ou restos de pato também são meios adequados para a produção industrial.

Mais recentemente BUECHER & POPIEL (1989) descreveram um sistema de cultura líquido monoxênico para multiplicação de S. feltiae e outras espécies de Steinemematidae. Os autores destacaram a importância do esterol, da aeração e densidade bacteriana no desenvolvimento e reprodução dos nematóides. Complementando esses estudos, POPIEL et al. (1989) observaram que densidades maiores de nematóides induziram à uma fração maior de formas infectivas na população e que durante o processo de fermentação a temperatura ótima para S. feltiae foi 25ºC.

É importante destacar que quase toda substância rica em proteína pode ser empregada para multiplicar S. carpocapsae desde que sejam observados dois critérios: necessidade de associação contínua com a bactéria simbiôntica e ausência de outros microrganismos no meio de cultura (POINAR, 1979).

Com relação à bactéria associada (Xenorhabdus nematophilus) são conhecidas as formas primária e secundária (AKHURST 1980). Na presença da forma primária,a reprodução do nematóide é ótima. Após sucessivas gerações em meio de cultura ¹¹ in vitro ^II ou ^II in vivo¹¹ , ocorre predominância da forma secundária, provocando redução na taxa de multiplicação.

O efeito de diferentes meios de cultura sobre a produtividade e virulência dos nematóides é outro aspecto que deve ser considerado. Estudos de LIAN et al. (1989) mostraram diferenças na virulência e retenção da bactéria simbiótica para nematóides mantidos em diferentes substratos.

TÉCNICA PARA MULTIPLICAÇÃO DE Deladenus siricidicola (Neotylenchidae)

BEDDING & AKHURST (1974) descrevem que o método mais bem sucedido para multiplicar Deladenus siricidicola é sobre o fungo simbiótico Amylostereum areolatum. As culturas são estabelecidas à partir da remoção de segmentos do fungo das glândulas da fêmea micetófaga do hospedeiro, esterilizado superficialmente. O material é então semeado em meio de batata-dextrose-ágar (BDA). Após o fungo ter iniciado o crescimento, formas juvenis são assepticamente removidas do inseto hospedeiro e colocadas sobre o meio de cultura. A cultura de nematóides pode ser armazenada a 5ºC, no escuro, por 6 a 12 meses.

Devido ao custo, tempo e dificuldades de manejo, foi desenvolvido o método de cultura massal em frascos. A técnica utiliza 100g de trigo e 150 mL de água para um frasco (Erlenmeyer) de 500 mL, submetidos à esterilização por 20 minutos. Antes de resfriarem, os frascos são agitados para separar o trigo e arejar o meio. Após a inoculação e incubação à 24ºC, no escuro, durante 4 a 6 semanas, adiciona-se água ao material e os nematóides são removidos, peneirados e deixados em repouso.

Usando esse método, 3 a 10 milhões de nematóides podem ser recuperados de cada frasco.

MUTLIPLICAÇÃO DE culicivorax Romanomermis (Mermithidae)

Tentativas de multiplicação "in vitro ¹¹ têm sido feitas para algumas poucas epécies de mermitídeos, em particular Romanomermis culicivorax, parasito obrigatório de mosquitos (pernilongos). FINNEY (1981) apresentou os resultados de vários métodos para iniciar as culturas que, todavia, esbarram na falta de informações básicas. Os problemas encontrados durante as tentativas de produção comercial de R. culicivorax também foram discutidos por PETERSEN & CUPELLO (1981). A obtenção de nematóide em cultura de tecido do inseto hospedeiro (Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus) não apresentou rendimento satisfatório.

Ainda hoje, a produção de R. culicivorax tem sido conduzida apenas "in vivo", principalmente sobre larvas de Culex pipiens, nos Estados Unidos.

ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE

Os nematóides devem ser armazenados em água destilada, acrescida de um agente molhante, para prevenir que os espécimes fiquem aderidos às paredes do recipiente. Pode-se, também, utilizar 0,1% de formalina com o objetivo de evitar-se contaminações. Quando armazenado sem aeração, a concentração de nematóides não deve exceder a 20.000 indivíduos/mL e a lâmina de água deve ser de, no máximo, 1cm. Por outro lado, altas concentrações de nematóides (100.000/mL) não serão prejudiciais se a suspensão for suprida com aeração.

Steinernematídeos podem ser armazenados a 4-lOºC por 6-12 meses sem muita perda de atividade. Heterorhabditis não comportam-se tão bem (WOODRING & KAYA, 1988).

BEDDING (1984) propôs o armazenamento de juvenis infectivos de Steinernematidae mantidos em pasta semi-sólida aplicada à espuma ou rede plástica. Quando da aplicação à campo, os nematóides são extraídos em água friccionandose a espuma. Essa forma de armazenamento também é a mais adequada para o transporte de nematóides vivos.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Analisando o papel da indústria na comercialização de nematóides entomopatogênicos, GEORGIS (l992) observa que a baixa estabilidade no armazenamento é considerada aprincipal limitação parao estabelecimento de um mercado consumidor. Um outro fator limitante é o tamanho da embalagem, razão das necessidades de oxigênio e umidade requeridas pelos nematóides. O autor segue relatando que aestabilidade desses produtos têm sido melhorada substancialmente nos últimos anos através de pesquisas com inertes específicos, tais como gel-alginato, gel-poliacrilarnidaou argilas quereduziram o metabolismo dos nematóides e ampliaram sua "vida de prateleira".

Quanto aos sistemas de produção, Georgis relata que os processos de fermentação líquida e cultura em meio sólido (BEDDING 1984) são os métodos atualmente utilizados pela indústria com vistas a produção de nematóides das famílias Steinernematidae e Heterorhabditidae. ·

No Brasil são raros os trabalhos sobre nematóides entomopatogênicos, sobretudo na área de produção "in vitro" (FERRAZ 1993). Nessa linha, EL-KADI (1977) apresentou um método para criação de Caenorhabditis elegans utilizando uma dieta à base defarinha de sangue, fécula de batata, ácido ascórbico, ácido sórbico, ácido acético glacial e formol 40%. O autor argumentava, · na época, que o baixo custo do meio de cultura e a simplicidade das técnicas de produção ofereciam perspectivas de uso comercial. Infelizmente o programa não teve continuidade.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AGUILLERA, M.M. Multiplicação de nematóides entomopatogênicos In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 11., 1987, Campinas, SP. Controle biológico de insetos: anais. Campinas: Fundação Cargill, 1988. p.21-30
AKHURST, R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp, bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol., v.121, p. 301-309,1980.
BEDDING, R.A. & AKHURST, R.J. Use of Deladenus siricidicola in the biological control of Sirex noctilio in Australia. J. Aust. Entomol. Soe., v.13, p.129-35, 1974.
BEDDING, R.A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematoda) for field control of insect pests. Nematologica, v.27, p.109-114, 1981.
BEDDING, R.A. Large scale production, storage and transport of the insect parasitic nematodes, Neoaplectana spp andHeterorhabditis spp. Ann. Appl. Biol., v.104, p. 117-120, 1984.
BUECHER, E.J., HANSEN, E.L. ; GOTTFRIED,T. A nematode growth factor from baker's yeast. J. Nematol., v.2, p.93-98, 1970.
BUECHER, E.J., HANSEN, E.L.; YARWOOD, E.A. Growth of nematodes in defined medium containing hemin and supplemented with comercially available proteins. Nematologica, v.16, p.403-409, 1970.
BUECHER, E.J. & HANSEN, R.L. Mass culture of axenic nematodes using continuous aeration. J. Nematol., _v.3, p.199-200, 1971.
BUECHER, E.J. & POPIEL,I. Liquid culture of the entomogenous nematode Steinernema feltiae with its bacterial symbiont. J. Nematol.,v.21,p. 500-504, 1989.
DUTKY, S.R., THOMPSON, J.V.; CONTWEKK, G.E. A technique for mass propagation of the DD-136 nematode. J. Insect Pathol., v.6, p.417-422, 1964.
DUTKY, S.R., ROBBINS, W.E.; THOMPSON, V.V. The demonstration of sterols as requirements for the growth, development , and reproduction of the DD-136 nematode. Nematologica, v.13, p. 140, 1967.
EL-KADI, M.K. Produção comercial de nematóides parasitas de cigarrinhas. Soe. Eras. Nematol., v. 2, p. 71-74, 1977.
FERRAZ, L.C.C.B. Considerações sobre nematóides entomopatogênicos. In: CICLO DE PALESTRAS SOBRE CONTROLE BIOLÓGICO DE PRAGAS, 3.,1993, Campinas, SP. Anais. Campinas: Fundação Cargill, 1993. p.13-25.
FINNEY, J.R. Mermithid nematodes: in vitro culture attempts. J. Nematol., v.13, p. 275-280, 1981.
FRIEDMAN, M.J. Commercial production and development. In: GAUGLER, R. & KAYA, H.K., (Eds.) Entomopathogenic nematodes in biological control. BocaRaton: CRC Press, 1990. 365p.
GEORGIS, R. The role of biotechnology companies in commercialization of entomopathogenic nematodes. In: GOMMERS, F.J. & MAAS, P.W. (Eds.), Nematology from molecule to ecosystem: proceedings of the International Nematology Congress, 2., Veldhoven, Netherlands., 1992, p. 295-306.
GLASER, R.W., McCOY, E.E.; GIRTH, H.B. The biology and culture of Neoaplectana chresima, a new nematode parasitic in insects.J. Parasitol., v.28, p.123-126, 1942.
HANSEN, E.L. & CRYAN, W.S. Continuous axenic culture offree-living nematodes. Nematologica, v.12, p.138-142, 1966.
HARA, A.H., LINDEGREN, E.J. & KAYA, H.K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode, Neoaplectana carpocapsae Weiser, on dog food/agar medium, USDA/SEA, AAT-W-16, 1981. 8p.
HOUSE, H.L., WELCH, H.E.; CLEUGH, T.R. Food medium of prepared dog biscuit for the massproduction of the nematode DD 136 (Nematoda; Steinernematidae). Nature,London, v.206 n.4986, p.847, 1965.
LIAN, J.X.; PING, Y.; LING, L.X. Effect on the productivity and virulence of the insecticidal nematodeSteinernema glaseri in different culture media. Acta Entornol. Sinica, v.32, p.317-321, 1989.
LOWER, W.R. & BUECHER, E.J. Axenic culturing of nematodes: an easily prepared medium containing yeast extract. Nematologica, v.16, p. 563-566, 1971.
PETERSEN, J.J. & CUPELLO, J.M. Commercial development and future prospects for entomogenous nematodes. J. Nematol., v.13, p. 280-284, 1981.
POINAR Jr., G.O. & THOMAS, G.M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteracae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitology,v.56, p.385, 1966.
POINAR JÚNIOR, G.O. Nematodes for biological control of insects. Boca Raton: CRC Press.,1979. 277p.
POPIEL, I.; GROVE, D.L.; FRIEDMAN, M.J. Infective juvenile formation in the insect parasitic nematode Steinernemafeltiae. Parasitology, v. 99, p.77-81, 1989.
STOLL, N. Axenic cultivation of the parasitic nematode, Neoaptectana glaseri, in a fluid mediumcontaningraw liverextract. J. Parasitol., v.39, p.422-444, 1953.
WHITE, G.F. A method for obtaining infective nematode larval from cultores. Science, v. 66, p. 302-303, 1927.
WOODRING, J.L. & KAYA, H.K. Steinernematid and heterorhabditid nematodes: A handbook of biology and techniques. Ark. Agric. Exp. Stn. South. Coop. Ser. Bull., Fayetteville, n.331, p.1-30, 1988.
WOUTS, W.M. Mass production of the entomogenous nematode Heterorhabditis heliothidis (Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media J. Nematol., V. 13, p. 467-469, 1981.

Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
10 Fev 2025
Data do Fascículo
Jan-Jun 1996

Histórico

Recebido
04 Mar 1996
Aceito
09 Abr 1996

Este é um artigo publicado em acesso aberto sob uma licença Creative Commons.

[1] AGUILLERA, M.M. Multiplicação de nematóides entomopatogênicos In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENTOMOLOGIA, 11., 1987, Campinas, SP. Controle biológico de insetos: anais. Campinas: Fundação Cargill, 1988. p.21-30

[2] AKHURST, R.J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp, bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol., v.121, p. 301-309,1980.

[3] BEDDING, R.A. & AKHURST, R.J. Use of Deladenus siricidicola in the biological control of Sirex noctilio in Australia. J. Aust. Entomol. Soe., v.13, p.129-35, 1974.

[4] BEDDING, R.A. Low cost in vitro mass production of Neoaplectana and Heterorhabditis species (Nematoda) for field control of insect pests. Nematologica, v.27, p.109-114, 1981.

[5] BEDDING, R.A. Large scale production, storage and transport of the insect parasitic nematodes, Neoaplectana spp andHeterorhabditis spp. Ann. Appl. Biol., v.104, p. 117-120, 1984.

[6] BUECHER, E.J., HANSEN, E.L. ; GOTTFRIED,T. A nematode growth factor from baker's yeast. J. Nematol., v.2, p.93-98, 1970.

[7] BUECHER, E.J., HANSEN, E.L.; YARWOOD, E.A. Growth of nematodes in defined medium containing hemin and supplemented with comercially available proteins. Nematologica, v.16, p.403-409, 1970.

[8] BUECHER, E.J. & HANSEN, R.L. Mass culture of axenic nematodes using continuous aeration. J. Nematol., _v.3, p.199-200, 1971.

[9] BUECHER, E.J. & POPIEL,I. Liquid culture of the entomogenous nematode Steinernema feltiae with its bacterial symbiont. J. Nematol.,v.21,p. 500-504, 1989.

[10] DUTKY, S.R., THOMPSON, J.V.; CONTWEKK, G.E. A technique for mass propagation of the DD-136 nematode. J. Insect Pathol., v.6, p.417-422, 1964.

[11] DUTKY, S.R., ROBBINS, W.E.; THOMPSON, V.V. The demonstration of sterols as requirements for the growth, development , and reproduction of the DD-136 nematode. Nematologica, v.13, p. 140, 1967.

[12] EL-KADI, M.K. Produção comercial de nematóides parasitas de cigarrinhas. Soe. Eras. Nematol., v. 2, p. 71-74, 1977.

[13] FERRAZ, L.C.C.B. Considerações sobre nematóides entomopatogênicos. In: CICLO DE PALESTRAS SOBRE CONTROLE BIOLÓGICO DE PRAGAS, 3.,1993, Campinas, SP. Anais. Campinas: Fundação Cargill, 1993. p.13-25.

[14] FINNEY, J.R. Mermithid nematodes: in vitro culture attempts. J. Nematol., v.13, p. 275-280, 1981.

[15] FRIEDMAN, M.J. Commercial production and development. In: GAUGLER, R. & KAYA, H.K., (Eds.) Entomopathogenic nematodes in biological control. BocaRaton: CRC Press, 1990. 365p.

[16] GEORGIS, R. The role of biotechnology companies in commercialization of entomopathogenic nematodes. In: GOMMERS, F.J. & MAAS, P.W. (Eds.), Nematology from molecule to ecosystem: proceedings of the International Nematology Congress, 2., Veldhoven, Netherlands., 1992, p. 295-306.

[17] GLASER, R.W., McCOY, E.E.; GIRTH, H.B. The biology and culture of Neoaplectana chresima, a new nematode parasitic in insects.J. Parasitol., v.28, p.123-126, 1942.

[18] HANSEN, E.L. & CRYAN, W.S. Continuous axenic culture offree-living nematodes. Nematologica, v.12, p.138-142, 1966.

[19] HARA, A.H., LINDEGREN, E.J. & KAYA, H.K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode, Neoaplectana carpocapsae Weiser, on dog food/agar medium, USDA/SEA, AAT-W-16, 1981. 8p.

[20] HOUSE, H.L., WELCH, H.E.; CLEUGH, T.R. Food medium of prepared dog biscuit for the massproduction of the nematode DD 136 (Nematoda; Steinernematidae). Nature,London, v.206 n.4986, p.847, 1965.

[21] LIAN, J.X.; PING, Y.; LING, L.X. Effect on the productivity and virulence of the insecticidal nematodeSteinernema glaseri in different culture media. Acta Entornol. Sinica, v.32, p.317-321, 1989.

[22] LOWER, W.R. & BUECHER, E.J. Axenic culturing of nematodes: an easily prepared medium containing yeast extract. Nematologica, v.16, p. 563-566, 1971.

[23] PETERSEN, J.J. & CUPELLO, J.M. Commercial development and future prospects for entomogenous nematodes. J. Nematol., v.13, p. 280-284, 1981.

[24] POINAR Jr., G.O. & THOMAS, G.M. Significance of Achromobacter nematophilus Poinar and Thomas (Achromobacteracae: Eubacteriales) in the development of the nematode, DD-136 (Neoaplectana sp. Steinernematidae). Parasitology,v.56, p.385, 1966.

[25] POINAR JÚNIOR, G.O. Nematodes for biological control of insects. Boca Raton: CRC Press.,1979. 277p.

[26] POPIEL, I.; GROVE, D.L.; FRIEDMAN, M.J. Infective juvenile formation in the insect parasitic nematode Steinernemafeltiae. Parasitology, v. 99, p.77-81, 1989.

[27] STOLL, N. Axenic cultivation of the parasitic nematode, Neoaptectana glaseri, in a fluid mediumcontaningraw liverextract. J. Parasitol., v.39, p.422-444, 1953.

[28] WHITE, G.F. A method for obtaining infective nematode larval from cultores. Science, v. 66, p. 302-303, 1927.

[29] WOODRING, J.L. & KAYA, H.K. Steinernematid and heterorhabditid nematodes: A handbook of biology and techniques. Ark. Agric. Exp. Stn. South. Coop. Ser. Bull., Fayetteville, n.331, p.1-30, 1988.

[30] WOUTS, W.M. Mass production of the entomogenous nematode Heterorhabditis heliothidis (Nematoda: Heterorhabditidae) on artificial media J. Nematol., V. 13, p. 467-469, 1981.