DOSAGENS DE TANINOS E FENÓIS TOTAIS NOS EXTRATOS ETANÓLICOS DAS FOLHAS E GALHOS DE VITIS VINIFERARESUMO
A dosagem de fenóis totais pelo método de Folin-Denis, nos extratos etanólicos. de folhas e galhos de Vitis vinifera mostraram que os galhos produzem 5,5 vezes mais fenóis que as folhas. Quanto aos taninos pelo método de difusão radial contendo albumina de soro bovino, verificou-se apenas formação de halos de precipitação no extrato dos galhos.
PALAVRAS-CHAVE:
Taninos; fenóis; extrato etanólico; Vitis vinifera, Vitaceae.
ABSTRACT
The level of the phenols by Folin-Denis method, in the ethanolic extracts ofthe leaves and branchs from Vitis vinifera, being known that the branches have produced 5.5 more phenols than leaves. For the tannins by radial difusion containing bovine serum albumin, a halo of precipitation was verified only in the branch extract.
KEY WORDS:
Tannin; phenols; ethanolic extract; Vitis vinifera, Vitaceae.
INTRODUÇÃO
Substâncias fenólicas são compostos aromáticos, nos quais se ligam um ou mais grupos hidroxílicos, sua ocorrência é ampla no reino vegetal, todas as plantas vasculares apresentam metabólitos secundários fenólicos (HASLAM, 1981). É pertencente ao grupo dos compostos fenólicos um número muito grande de classes de substâncias, a exemplo dos ácidos fenólicos, cumarinas, flavonóides, ligninas e taninos.
É difícil definir o termo "tanino" de um modo conciso e rigoroso, pois são incluídos como taninos grupos de substâncias que apresentam certas propriedades físicas e químicas em comum, embora certamente sem relações estruturais (OZAWA et al., 1987). Todas as classificações químicas dos taninos são arbitrárias, pois eles apresentam uma grande diversidade estrutural, entretanto é norma agrupa-los em taninos condensados (protoantocianidinas, antocianidinas) e taninos hidrolizáveis (gálicos e elágicos), biossintéticamente são formados apartir da via do ácido chiquímico (Fig 1). A propriedade essencial dos taninos é sua capacidade para se combinar com proteínas e outros polímeros, tais como celulose e pectina.
Os taninos possuem um largo espectro de atividades porém seu papel principal na evolução, tem sido proteger as plantas contra infecções causadas por vírus, fungos, bactérias e ainda contra insetos fitófagos. A natureza defensiva destas substâncias é explicada pois ocorre um aumento na sua concentração como resultado de qualquer infecção ou lesão devido à presença dos agentes citados acima. Quanto aos predadores a capacidade inespecífica dos taninos de complexar com polímeros, proteínas e enzimas muitas vezes atua como redutor de digestibilidade, pois estas substâncias podem anular o valor energético do alimento ou interromper especificamente o processo digestivo (BEART et al., 1985).
A quantificação dos taninos em extratos de plantas é baseada na sua habilidade em complexar com proteínas, (BATE-SMITH, 1973). HAGERMAN (1987) descreve vários métodos para determinação de taninos por precipitação de proteínas, mas muitos deles embora sejam seletivos são inconvenientes pois envolvem multietapas para formação e isolamento do precipitado. O método de difusão radial é simples, sensível, específico e pode ser aplicado ao mesmo tempo para análise de um grande número de amostras.
Vários compostos químicos das diferentes classes de metabólitos secundários foram isolados de frutos e folhas de Vitis vin)Jera. As folhas são ricas em carotenóides, cerca de 90% dos frutos é constituído de ácidos orgânicos como ácido tartárico e málico. Das sementes e folhas foram isolados antocianidinas, proantocianidinas e flavonóides a exemplo da catequina, epicatequina, canferol, quercetina, isoquercetina e luteina têm sido identificados de Vitis vinifera (BOMBARDELLI & MORAZZONI, 1995). Outros compostos fenólicos pertencentes ao grupo dos estilbenos, como o resveratrol e a viniferinas (oligomeros de resveratrol), foram isolados também de folhas de Vitis vinifera infectadas com Botrytis cinerea ou quando estas são irradiadas com luz ultravioleta (LANGCAKE & PRYCE, 1977a/1977b).
Num estudo para avaliação da constituição química de folhas sadias e galhos de Vitis vinifera, foi observado, pelo cromatograma, uma grande diferença entre os extratos etanólicos de folhas e galhos da planta. Iniciando a triagem fitoquímica determinouse o teor de fenóis totais e taninos destes extratos. Desta forma poderia verificar se havia alguma diferença quanto ao teor destas substâncias nos dois extratos. Este trabalho descreve os métodos de dosagens e os resultados obtidos na quantificação de taninos e fenóis totais de extratos etanólicos de folhas e galhos de Vitis vinifera.
MATERIAIS E MÉTODOS
Material vegetal: Os galhos e folhas de Vitis vinifera foram coletados de um especimen localizados no Instituto Biológico de São Paulo. Após secagem em estufa a 40ºC foram moídos na forma de pó, que posteriormente foram submetidos à extração com etanol 96ºem aparelho de soxhlet. Os extratos após filtragem, foram concentrados em rotaevaporador sob pressão reduzida à temperatura de 50ºC para obter os extratos etanólico dos galhos e das folhas.
DETERMINAÇÃO DE FENÓIS TOTAIS
Preparação dos extratos finais: Adaptação do método de PHILLIPIS & HENSHAW (1977) lg do extrato foi transferido para um tubo de ensaio e adicionados 10 mL de etanol 70% e colocado em banho maria a 60ºC. Em seguida o conteúdo do tudo foi filtrado e o sobrenadante transferido para um balão volumétrico de 50mL. O resíduo foi re-extraído por mais duas vezes com volumes de aproximadamente 10mL de etanol 70%. O volume dos extratos foi reunidos e completado com etanol 70% a 50mL.
Doseamento: Método de Folin-Denis (HORWITZ, 1955)
Uma alíquota dos extratos finais foi transferida para dois tubo de ensaio, onde adicionou-se 0,5 mL do reagente de Folin-Denis e 0,5 mL de solução saturada de carbonato de sódio. O volume foi completado a 5mL com água destilada. A solução foi deixada em repouso por 45 min. A absorbância foi lida no espectro de ultravioleta Hitachi U 2001 à 730 nm, os resultados foram confrontados com os dados de uma curva padrão obtida com soluções de ácido tânico.
Preparo da curva padrão de ácido tânico (Fig.2): 25mg de ácido tânico foram dissolvidos em 250mL de água destilada. Alíquota de O a 1 mL da solução de ácido tânico padrão foram pipetadas para tubos de ensaio. 0,25 mL de reagentes de Folin-Denis e 0,5 mL de solução saturada de carbonato de sódio foram adicionadas, e foi completado o volume para 5 mL com água destilada. Deixando em repouso durante 45 min, as absorbâncias foram lidas no espectrofotometro em 730 nm.
Preparo do reagente de Folin-Denis: 100g de tungstato de sódio, 20g de ácido fosfomolibdênico e 50 mL de ácido fosfórico, foram dissolvidos em 750 mL de água. A solução foi deixada em refluxo por 2 horas, resfriada e diluída até 1 litro com água destilada. Preparo da solução saturada de carbonato de sódio: 35g de carbonato de sódio foram dissolvidos em 100 mL de água a 70-80 ºC. A solução foi deixada em repouso por uma noite e depois filtrada.
DETERMINAÇÃO DE TANINOS:
Método HAGERMAN (1987)
Extração dos taninos: 1mg de cada extrato foi extraído por 1 hora a temperatura ambiente com 0,5 mL uma solução de metanol-água (1:1), em seguida filtrou-se o extrato com algodão e utilizou-se o filtrado.
Preparação do gel de agarose em placas de petri: Uma solução de agarose 1% (p/v) foi preparada em tampão contendo ácido acético e ácido ascórbico nas concentrações de 50mM e 60mM, respectivamente, o pH foi ajustado para 5,0 com hidróxido de sódio lN. A solução foi fervida até que a agarose se dissolvesse totalmente e posteriormente resfriada a 45ºC, num banho de água, então foi adicionado o soro de albumina bovina (BSA) 0,1 % (p/v), agitando-se até total homogeneização. Aliquotas de 9,5 mL desta solução foram colocadas em placas de Petri (de 8,5 cm de diâmetro). As placas foram colocadas para resfriar em superfície nivelada para se obter espe_ssuras uniformes e estocadas a 4 ºC para prevenir o crescimento de bactérias e fungos.
Deposição do extrato tânico e medida dos halos: Com auxilio de um furador de rolhas de 4mm de diametro externo, fez-se os orifícios no gel de agarose, com espaços de cerca de 1,5cm entre eles. Os extratos foram então depositados nos orifícios através de uma microseringa, com alíquotas de 10 mL por vez, num total de 20 mL de solução. Paralelamente, fez-se uma placa em cujos orifícios se depositam soluções contendo 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5 e 2,0 % de ácido tânico, a fim de se obter a curva padrão (Fig. 3). Estas placas foram incubadas a 30 ºC por 96-120 horas. Os diâmetros dos anéis foram medidos, perpendicularmente entre si para minimizar possíveis erros devido ao desenvolvimento não uniforme dos halos, calculando-se depois as médias dessas duas medidas. As concentrações de taninos das _amostras foram calculadas a partir da curva de calibração.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
DOSAGENS DE FENÓIS TOTAIS
As concentrações de fenóis totais foram obtidas a partir da extrapolação na curva padrão do ácido tânico (Fig. 2), seus valores estão na tabela 1. A quantificação dos fenóis totais dos extratos de folhas e galhos pelo método de Folin-Denis mostrou que para lg do extrato etanólico dos galhos a concentração de fenóis solúveis é aproximadamente 5,5 vezes maior que para as folhas, o resultado é visual como pode ser observado na Fig. 4.
DOSAGENS DE TANINOS
Quanto ao resultado de dosagens dos extratos, verificou-se que o padrão (controle) e o extrato dos galhos, formavam halos de precipitação medindo 20,5 e 13 mm respecti_vamente, e o extrato das folhas não apresentavaµi'halos de precipitação, como pode ser observado na Fig. 5. A porcentagem de taninos dos extratos é dada pelo cálculo da área do halo (cm2 ) em relação ao padrão, os resultados estão expressos na tabela 1.
As curvas padrões Fig.2 e Fig.3 apresentam boa linearidade, como pode ser observado pelos seus coeficiente de correlação, 0,99973 para curva padrão de dosagem de fenois e 0,992 para curva padrão de dosagem de taninos.
Os resultados obtidos em relação à percentagem de fenóis e taninos nos extratos de folhas e galhos vão ao encontro do estudo comparativo da composição química de Vitis vinifera, realizado posteriormente, onde foram isolados e identificados os componentes químicos de folhas e galhos da planta e observou-se que as folhas eram constituídas basicamente de flavonóides e os galhos de resveratrol e seus derivados (oi oestilbenóides) e alguns triterpenos.
CONCLUSÃO
Recentemente os oligoestilbenóides foram apontados como uma nova classe de taninos condensados BORALLE et al. (1993), uma vez que estas substâncias poderiam precipitar proteinas. Portanto, o resultado obtido nas dosagens de taninos de folhas e galhos da planta, confirmam que os oligoestilbenóides produzidos pelos galhos de V. viríifera, são de uma outra classe de metabólitos secundários pertencentes ao grupo dos taninos.
AGRADECIMENTOS
J.D. Felicio de Souza agradece a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo financiamento do projeto "Estudo dos metabólitos de Vitis vinifera antes e após ao stress causado por ozônio".
Resultados das dosagens de fenóis totais nos extra.tos de folhas e galhos de Vitis vinifera (B= branco; 3, 4, 5 e 6= padrões de ácido tânico; F=extrato de folhas e G extrato de galhos).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- BATE-SMITH, E.C. Haemanalysis of Tannins: the concept ofrelative astringency. Phytochemistry. v.12, p.907-912, 1973.
- BEART. J.E.; TILLEY, T.H.; HASLAM, E. Plant. Polyphenols secundary metabolism and chemical defence: some observations. Phytochemistry, v. 24, p.33-38, 1985.
- BOMBARDELLI, E. & MORAZZONI, I. Vitis vinifera L . Fitoterapia. v.LXVL, p.291-317, 1995.
- BORALE, N.; GOTTLIEB, H.E.; GOTLLIEB, O.R.; KUBITZKI, K.; LOPES, L.M.X.; YOSHIDA, M.; YOUNG, M.C.M. Oligostilbenoids from Gnetum venosim. Phytochemistry, v.34, p.1403-1407, 1993.
- HAGERMAN, A.E. Radial difusion method fro determining tannin in plant extracts. J. Chem. Ecol., v.13, p.437-449, 1987.
- HASLAM, E. Vegetable tannins, The Biochemistry of plants. New York: Academic Press, 1981, v.7, p.527-556.
- HORWITZ, H. Official methods of analisis of the association of official agricultural chemists. 8.ed., Ass. Off. Agr. Chem. Washington, 1955, 144p.
- LANGCAKE, P. & PRYCE, R.P. A new class of phytoalexins from gravepines. Experientia, v.33, p.151-152, 1977a.
- LANGCAKE, P. & PRYCE, R.P. a-Viniferin: na antifungical resveratrol trimer from gravepines. Phytochemistry, v.16, p.1452-1454, 1977b.
- PHILLIPS, R. & HENSHAW, G.G. The regulation of synthesis of phenolics in stationary phase cell cultures of Acerpseudoplatanus. L. J. Exp. Bot., v.35, p.108-114, 1977.
