PESQUISA DE LEPTOSPIRAS NOS OVÁRIOS, ÚTEROS E EMBRIÕES DE HAMSTERS EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS E INDUZIDOS À CONDIÇÃO DE PORTADORES RENAIS, ATRAVÉS DO TRATAMENTO COM O ESTOLATO DE ERITROMICINARESUMO
Em 61 hamsters experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo pomona, foi investigada a presença de leptospiras nos ovários, lavados uterinos e embriões de fêmeas induzidas à condição de portadoras renais através do tratamento pós-infecção com o estolato de eritromicina. Os materiais foram examinados pela _coloração de Levaditi, cultivo e reação de PCR. As fêmeas foram colocadas com os machos e entre 63 a 68 horas, após o acasalamento os animais foram sacrificados e efetivou-se a pesquisa dos microrganismos. Entre o 17º e o 78º dia pós-infecção (pi), cinco lotes de animais foram examinados, respectivamente nos tempos experimentais: 17º; 29ºao 30º; 43º ao 44º; 57º ao 59ºe 78º dias pi. Entre o 17º e o 59º dia pi., houve 100% de positividade para os cultivos renais; no 78º dia pi., esta positividade foi de 6/13 (46,15%). Os níveis médios de aglutininas para o sorotipo infectante apresentaram um perfil de ascenção, (17º ao 30º-dia pi) e declínio (30º ao 78º dia pi). Entre o 30º e o 60º dia pi., oito de 32 animais (25,0%) apresentaram resultado positivo no exame dos ovários pela coloração argêntica. Todos os líquidos de lavagens uterinas examinados pelo teste de PCR foram negativos para leptospiras. Não foram encontradas leptospiras em nenhum dos outros substratos examinados. Com o modelo biológico ensaiado não foi confirmada a hipótese da transmissão da leptospirose a partir de embriões colhidos de doadoras com infecção renal e ovariana e com níveis de aglutininas séricas decrescentes.
PALAVRAS-CHAVE:
Leptospirose; embriões; hamsters; infecção éxperimental; estolato de eritromicina.
ABSTRACT
This study investigated the presence ofleptospires in the ovaries, uterine washes and embryos of hamsters experimentally infected with Leptospira interrogans serovar pomona and induced to the kidney localization of -the microrganisms by treatment with appropriated·concentration of erythromycin estolate. The ovaries were examined by Levaditi staining; the uterine washes by cultivation and polymerase chain reaction (PCR) and the embryos by culture. The controls of the investigation were: time from infection (17th to 78th days); kidney infection (culture) and the leveis of serum agglutinating antibodies (microscopic agglutination technique-MAT). The females were matched with males and between 63 to 68 hours after the confirmation of copulation the animais were killed and examined. Between the 17th to 59th post-infection-days (pid), all of the animais presented positive kidney cultures, but at the 78th pid, the positivity was_ 6/13 (46.15%). The MAT showed the development of growing (17th to 30th pid) and descending (30th to 78th pid) antibody leveis. A proportion of avaries (8/61) were positive in the Levadit staining at the 29/3ethànc,l,57/59th pid. All embryos and uteririe washes were negative by both techniques (culture and PCR). The conclusion was that in anima1s wjth kidney and ovacy infection and descendirig leveis of humoral immunity there was no proof of the possibility of leptospirosis transmission by ern.bryo transfer.
KEY WORDS:
Leptospirosis; embryos; hamsters; experimental infection; erytromicin.
INTRODUÇÃO
O incremento da biotecnologia da reprodução animal intensificou, inicialmente, o uso das técnicas de inseminação artificial, cuja difusão exigiu o estabelecimento de rigoroso controle sanitário das doenças veiculadas pelo sêmen (HARE, 1985), na atualidade, esta preocupação está sendo dirigida para as técnicas de manipulação e transferência de embriões, particularmente quando da utilização de doadoras, aparentemente saudáveis, mas que poderão ser portadoras de agentes etiológicos de doenças transmissíveis (HARE, 1985; CONCLUSIONS OF THE RESEARCH SUBCOMITTEE OF THE INTERNATIONAL EMBRYO TRANSFER SOCIETY, 1988).
ELLIS et. ai. (1985); ELLIS & THIERMANN (1986); ELLIS et al. (1986) observaram que durante a fase de leptospiremia as leptospiras se difundem por toda a economia animal, o que inclui o sistema urogenital e, em algumas ocasiões, foi demonstrada a persistência do agente no aparelho reprodutor de bovinos e suínos. Estas evidências reforçam a hipótese de que os embriões provenientes de animais infectados poderiam conter leptospiras passíveis de serem transmitidas às receptoras.
A despeito de não existirem registros da transmissão da leptospirose via embriões, tanto em condições naturais, como experimentais, Bailey apresentou uma fotomicrografia eletrônica de leptospiras aderidas à zona pelúcida de óvulos de suínos que não foram removidas mesmo após dez lavagens sucessivas (CHEN SHISONG & WRATHALL, 1989)
CAMARGO et al. (1993) constataram a presença de leptospiras nos ovários de hamsters experimentalmente infectados, com localizações no estroma e parênquima ovariano, incluindo o interior dos ovócitos. A despeito destes resultados levantarem grande suspeita da possível transmissão da leptospirose pela transferência. de embriões, os mesmos foram obtidos de animais doentes, em fase de leptospiremia e poderiam não ser confirmados quando, na condição de portadores, em que há a colonização renal e o estabelecimento da leptospirúria (HANSON, 1977).
BIENLANSKY & SURUJBALLI (1996) investigaram a presença de L.borgpetersenii, variante sorológica hardjo em fluídos foliculares, complexo cumulus-oócitos e lavados de ovidutos de bovinos experimentalmente infectados e examinados no 4º e 11º dia pós-infecção. Encontraram lavados de ovidutos infectados mas todos os embriões, fertilizados "in vitro", foram negativos para leptospiras, destaque-se contudo, que os meios de cultivo utilizados continham antibióticos.
Do ponto de vista epidemiológico os grandes responsáveis pela perpetuação dos focos de leptospirose são os animais que se comportam como portadores, pois eliminam as leptospiras através da urina e determinam a contaminação ambiental de forma continuada e persistente (VASCONCELLOS, 1987).
ALEXANDER & RULE (1987) descreveram um modelo experimental onde hamsters infectados e tratados com o estolato de eritromicina resistem à infecção e passam a albergar o agente no tecido renal.
Deste modo, o presente trabalho teve o objetivo de investigar a presença de leptospiras nos ovários, útero (lavados uterinos) e embriões colhidos de hamsters experimentalmente induzidos à condição de portadores renais, através do tratamento com concentrações adequadas de eritromicina.
MATERIAL E MÉTODOS
Hamsters fêmeas, com 120 a 200 gramas de peso vivo, distribuídas em lotes de oito indivíduos, foram inoculadas pela via intraperitoneal com o volume individual de 0,5 mL da diluição 10-4 de uma suspensão do tecido hepático de outros hamsters, sacrificados na fase agônica da infeção pôr L. interrogans, variante sorológica pomona. Este inóculo apresentou a média de 20 a 30 leptospiras ativas por campo microscópico, no aumento de 200 vezes. No segundo dia pós-infecção, os animais foram tratados com o estolato de eritromicina, na dose de 40 mg por quilo de peso, pela via oral (ALEXANDER & RULE, 1987) e passaram a ser observados diariamente.
No 10º, 22º, 35º, 50º e 71º dia pós-inoculação, lotes de fêmeas receberam em suas caixas, no período da tarde, os machos, na proporção de um macho para cada duas fêmeas. O acasalamento foi confirmado na manhã do dia posterior, através do encontro de espermatozóides no exame do muco vaginal (BLAHA, 1964; WARD, 1946). Os animais sem confirmação do acasalamento retornaram para a observação a fim de serem reutilizados em outro tempo experimental.
Entre 63 a 68 horas após o acasalamento; momento propício para a obtenção dos embriões (AUSTIN, 1956; VENABEL, 1946; ORSINI & PSYCHOYOS, 1965), as fêmeas foram anestesiadas e sacrificadas pela aplicação individual de 0,2 mLde solução de cloridrato de xilasina a 20% e 0,2 mL de cloridrato de ketamina a 50%.
No momento do sacrifício foi colhida uma amostra de sangue por punção cardíaca e a seguir, após rigorosa assepsia da região abdominal, foi realizada a laparatomia mediana para a retirada dos dois rins, ovários e útero.
A confirmação da condição de portador renal de leptospiras foi obtida através do cultivo dos dois rins em meio de Fletcher (SANTA ROSA, 1970). O soro sangüíneo foi submetido à microtécnicà de soroaglutinação microscópica (GALTON, et al.,1965; COLE et al., 1973). A coleção de antígenos empregadas no teste SAM foi mantida em meio de EMJH, modificado (ALVES, et al., 1996).
O útero e os ovários foram lavados, respectivamente, interna e externamente com o volume individual de 1,0 mL do meio TCM .199 (MORGAN, 1950). O lavado uterino foi submetido ao exame em lupa estereoscópica para a confirmação da presença de embriões.( AUSTIN, 1956; ORSINI & PSYCHOYOS, 1965; SATO & YANAGIMACHI 1972; ADAMS, 1982). OHquido da lavagem uterina foi submetido ao cultivo em meio de Fletcher e, independentemente da presença de embriões, uma alíquota do mesmo foi examinada pela técnica de PCR que empregou os oligonucleotídeos iniciadores Lep1 e Lep2 (MÉRIEN et al., 1992) e adotou o protocolo descrito por HEINEMANN, (1995).
Os embriões, considerados viaveis, (WHITTINGHAN, 1974) foram submetidos a três lavagens sucessivas em meio de TCM 199 e quatro embriões foram semeados, individualmente, em tubos c?ntendo o meio de Fletcher para isolamento de leptospiras (FAINE, 1982).
Os ovários foram fixados em formol e submetidos à coloração argêntica de Levaditi (Me MANUS & MOWRY, 1965).
RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos segundo o tipo de exame, o respectivo material e o momento pós-infecção (pi) em que foi realizada a colheita. Podese observar que os cultivas renais foram totalmente positivos entre o 17º e o 59º dia pós-infecção (pi); no 78º dia pi a positividade foi de 46,15% (6/13). As colorações argênticas dos ovários apresentaram resultados parcialmente positivos entre o 29º e o 30º dia pi.(50%- 5/10) e entre o 57º e 59º dia pi (33,33%-3/9). Todos os cultivas de embriões e de lavados uterinos, bem como o PCR dos lavados uterinos apresentaram resultados ne:- gativos. A pesquisa de aglutininas anti-leptospira constatou positividade para a variante sorológica infectante (título 100) em todos os animais examinados. Houve um perfil sorológico ascendente entre o 17º e o 30º dia pi, e descendente no período subsequente (30º ao 78º dia pi).
A figura 1 é uma fotomicrografia que ilustra o estágio de desenvolvimento dos embriões de hamsters quando dó seu processamento entre 63 a 68 horas do acasalamento.
A figura 2 é uma fotomicrografia de ovários de hamsters experimentalmente infectados e corados pela Técnica de Levaditi onde podem ser observadas diversas leptospiras no interstício.
Hamsters experimentalmente infectados com L.interrogans, variante sorológica pomona, .segundo o material, o tipo de exame, o dia pós-infecção em que foi realizada a colheita e a natureza do resultado. São Paulo, 1997.
Fotocrografia de embrião de hamster com 63 a 68 horas pós-ovulação, em meio de cultura para tecidos (TCM). Aumento 660X.
DISCUSSÃO
Os 61 animais examinados entre o 17º e 78º dia pi tiveram a confirmação da presença de leptospiras nos rins, no entanto as culturas dos líquidos de lavagens uterinas, as reações de PCR, destes substratos, e os cultivos de embriões apresentaram resultados negativos para leptospiras. Houve positividade apenas em uma parcela dos cortes histológicos dos ovários corados pela Técnica de Levaditi (8/61-13,11 %). Com base na informação de que os níveis séricos da eritromicina caem rapidamente a partir de quatro a seis horas da sua administração (JONES et al., 1983), podese pressupor que após este período as leptospiras remanescentes tenham tido condições de persistir nos pontos do organismo livres de anticorpos circulantes (FAINE, 1982).
A ausência de leptospiras nos lavados uterinos discorda dos resultados obtidos em bovinos por BIELANSKY & SURUJBALLI (1996), no entanto, os mesmos trabalharam em fase muito precoce, 4º e 11º dia pi, período que ainda poderia ser considerado como fase de infecção aguda.
O encontro de leptospiras nos ovários de animais que resistiram à infecção concorda com os achados de ELLIS & THIERMANN (1986) e de ELLIS et al. (1986), respectivamente em bovinos e suínos e reforça a hipótese da produção de óvulos contaminados. Destaque-se contudo que a quantidade de leptospiras observadas nos animais experimentalmente induzidos à condição de portadores (Fig. 1) foi muito inferior à constatada no experimento anterior (CAMARGO et al., 1993), quando foram examinados os ovários de animais sacrificados durante o quadro agudo de leptospiremia.
Fotocrografia do interstício ovariano de hamster, mostrando várias leptospiras. Coloração de Levaditi. Aumento l .650X.
A interferência dos anticorpos na distribuição de leptospiras nos tecidos também deve ser considerada pois sabe-se que os anticorpos protetores, neutralizantes, não são revelados pelos testes de aglutinação, que só demonstram as aglutininas, principalmente da classe IgM (HANSON, 1977). O declínio observado nos níveis de aglutininas a par-. tir do 30º dia pi sugere a queda progressiva da imunidade humoral, no entanto não se pode afirmar que durante o período estudado os níveis de anticorpos neutralizantes tenham atingido valores tão baixos que permitissem uma bacteremia secundária com comprometimento do aparelho reprodutor.
A constatação de resultados negativos em todos os lavados uterinos examinados pela reação de PCR, técnica que revela até 10 bactérias por mililitro (HEINEMANN, 1995), sugere que a despeito de terem sido encontradas leptospiras nos ovários de oito animais, não houve condições para que estes microrganismos pudessem atingir o útero, veiculados pelos óvulos ou humores orgânicos.
Do exposto conclui-se que no modelo experimental ensaiado; não foi confirmada a possibilidade da transmissão da leptospirose a partir de embriões colhidos de animais induzidos à condição e portadores renais e com níveis decrescentes de anticorpos aglutinantes.
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Parte da tese de doutoramento: Camargo, C.R.A . Pesquisa de leptospiras nos ovários, úteros e embriões de hamsters experimentalmente infectados e induzidos à condição de portadores renais, através do tratamento com o estolato de eritromicina, 1996. Tese (Doutorado) Fac'-;lldade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
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