UTILIZAÇÃO DE PAPEL FILTRO PARA O TRANSPORTE DE AMOSTRAS DESTINADAS À REAÇÃO DE SOROAGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA APLICADA AO DIAGNÓSTICO DA LEPTOSPIROSE EM HAMSTERS (MESOCRICETUS AURATUS) EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS COM LEPTOSPIRA INTERROGANS SOROTIPO POMONARESUMO
Conhecendo-se a importância da leptospirose como zoonose causadora de grandes prejuízos junto aos animais domésticos e silvestres e tendo em vista as dificuldades de diagnóstico devido ao pequeno número de laboratórios capacitados e as dificuldades no transporte das amostras de soro e às necessidades de meios conservantes, foi delineado este estudo que objetivou determinar a viabilidade do uso de papel filtro como meio de transporte de amostras de sangue total e soro sangüíneo dessecadas, verificando-se a correspondência dos resultados, tanto qualitativa como quantitativamente. Foi utilizado o papel filtro da marca Whatman nº 1 e amostras de 76 hamsters experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo pomona, sendo quatro desses animais os controles do inóculo e os 72 restantes divididos em seis grupos de 12 animais cada, sendo estes tratados com estolato de eritromicina n;i dosagem de 25 mg por kg de peso, 48 horas após a inoculação. Foram utilizados também outros 12 animais que não foram inoculados nem tratados, sendo estes os controles do manejo. Cada grupo de 12 animais foi sacrificado seguindo-se o cronograma do experimento: 5, 15, 30, 45, 90 e 120 dias pós-inoculação, sendo colhidas amostras do sangue, das quais se extraiu uma alíquota de 100 mL que foi dissecada em papel filtro e outra amostra que foi semeada em meio semi-sólido de Fletcher. Além dessa outra quantidade que foi dessorada, e do soro extraiu-se outra alíquota de 100mL que também foi dissecada no papel filtro e outra parte que foi encaminhada para a microtécnica de soroaglutinação microscópica. Setenta e duas horas após a dissecação, as amostras mantidas em papel filtro foram eluidas e procedeu-se à microtécnica de soroaglutinação microscópica a partir da diluição 1:50. A conversão sorológica foi verificada em todos os animais a partir do grupo dois (15 dias pósinoculação). As diferenças observadas entre os três tipos de materiais examinados (sangue total eluido, soro sangüíneo eluido e soro sangüíneo fresco) foram quantitativas, pois do ponto de vista qualitativo não houve diferença significante.
PALAVRAS-CHAVE:
Papel filtro; leptospirose; soroaglutinação microscópica; conversão sorológica.
ABSTRACT
Leptospirosis is an important zoonosis and can cause large lasses in domestic and wild animals, and considering the difficulties of diagnosis due to the low number of laboratories and the risks of lasses of the samples due the necessity of transporting the medium, this test was carried out to examine the viability of the use of filter paper in transportation of dried total blood and blood serum samples, checking the qualitative and quantitative correspondence of the results. The materials used were the Whatman nn 1 filter paper and the samples of 76 hamsters experimentally infected with Leptospira interrogans serovar pomona, four of them were the contrai of the infection and the other 72 were divided in six groups of 12 animals each one, and these were treated with eritromicin at the dosage of 25 mg per kg of body weight 48 hours after the inoculation. Also used were another 12 animals that were not inoculated and were not treated, and so they were the contrai of the environmental conditions. Each group of 12 hamsters was sacrificed accordingto the chronology of the test: five, 15, 30, 45, 90 and 120 days after inoculation and blood samples were collected, for a dried aliquot of 10OmL in the filter paper, some drops for cultive Fletcher medium, and another quantity for the microscopical seroaglutination technique. Seventy-two hours after the dessecation, the dried samples maintained in the filter paper discs were eluted for the microscopical seroaglutination at 1:50 dilution. The serological conversion was detected in all the animals after group two (15 days after inoculation). The differences observed between the three types of examined materiais (eluted blood, eluted blood serum and fresh blood serum) were quantitative, therefore the qualitative differences were not significant.
KEY WORDS:
Filter paper; leptospirosis; microscopic seroaglutination; zoonosis; serological conversion.
INTRODUÇÃO
Estudos epidemiológicos são constantemente realizados em diversas populações animais e rebanhos de espécies de interesse zootécnico, mas freqüêntemente estes estudos enfrentam limitações decorrentes das dific_uldades em se colher e transportar adequadamente as amostras de sangue e soro sangüíneo para os inquéritos soroepidemiológicos.
A escassez de laboratórios devidamente equipados e de pessoal habilitado para os exames diagnósticos, especialmente nas localidades mais afastadas dos grandes centros urbanos, são as maiores barreiras para estudos mais profundos sobre a prevalência da infecção.
Para o diagnóstico de algumas doenças, o papel filtro tem sido utilizado como recurso no transporte de amostras dissecadas de soro sangüíneo, mostrando-se eficaz para este propósito (Thaver & Draper, 1974; Guimarães, 1981). Sendo testados diversos tipos de papel filtro tanto no transporte de soro sangüíneo humano (Cohen et al., 1969; Zhuang et al., 1982; Wanderley et al., 1982; Pérez & Bolívar, 1989; Carvalho et al., 1992) como animal (Segui et al., 1990; Bahia et al., 1995; Chiari et al.,1997).
Em relação a outros métodos de conservação e envio de material biológico, como ocongelamento, liofilização e adição de glicerina (Guimarães, 1981), o uso do papel filtro apresenta diversas vantagens, tais como:
1) Necessidade de pequeno volume de material, o que permite a colheita de sangue de espécies animais das quais só se consegue uma pequena quantidade ou que não podem ser devidamente contidas quando da colheita, principalmente devido às conseqüências danosas do estresse, muito comum em espécies selvagens (Fowler, 1986);
2) A maior viabilidade das amostras quando do transporte até o laboratório, o que se verifica por não serem necessários os frascos de colheita, diminuindo as possibilidades de erro na identificação das amostras e contaminação do material devido à umidade, tempo ou temperatura de estocagem;
3) A diminuição dos cus-tos do transporte, devido à considerável redução do volume das amostras, que podem ser enviadas pelos serviços de postagem em simples envelopes (Guimarães, 1981).
Estudos soroepidemiológicos de animais ou seres humanos naturalmente infectados, geralmente não permitem a observação de um perfil sorológico ao longo do tempo mas somente a avaliação emum dado momento. A utilização de um modelo biológico experimental possibilita o controle de parâmetros como o momento exato da infecção, dose infectante e a via de penetração do microorganismo.
Para investigações sobre infecções por leptospiras, o hamster dourado tem sido amplamente utilizado como modelo experimental (Sanger et al., 1961 ; Passos et al., 1988; Macedo, 1991; Camargo et al., 1998), pois, além de ser bastante suscetível a estas infecções, oferece outras vantagens como a uniformidade genética e a fácil manutenção em biotérios.
No presente estudo procurou-se verificar a viabilidade da utilização do papel filtro no transporte de amostras de sangue e soro sangüíneo de hamsters previamente infectados com leptospiras e tratados com antibiótico para que fossem analisadas as fases aguda e crônica de infecção.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados 76 hamsters (Mesocricetus auratus) machos e adultos, pesando entre 80 e 120 gramas, divididos em seis grupos experimentais de dez indivíduos os quais foram inoculados com O,1 mililitro de uma suspensão de Leptospira interrogans sorotipo pomona, comprovadamente patogênica para estes hospedeiros (Passos et al., 1988; Alt & Bolin, 1996). No segundo dia pós-infecção, os animais foram tratados com estolato de eritromicina na dosagem de 25 mg/kg de peso vivo com a finalidade de bloquear a evolução da infecção e favorecer a condição de portador (Alt & Bolin, 1996). Outros 12 animais, divididos em seis grupos de dois indivíduos, não foram submetidos à inoculação e tratamento, _ sendo portanto considerados os animais controle do manejo empregado durante o experimento. Simultâneamente quatro animais inoculados não foram tratados com o antibiótico (grupo controle do inóculo).
Os animais foram sacrificados, segundo a ordem numérica do grupo, aos 5, 15, 30, 45, 90 e 120 dias após a inoculação, sempre acompanhados com o sacrifício de dois animais do grupo controle do manejo. No momento do sacrifício, colheram-se duas amostras de sangue de cada animal, uma destinada a posterior centrifugação e obtenção de soro sangüíneo e a outra foi colocada sobre o papel filtro. Foram utilizados círculos de papel filtro de 10 centímetros de diâmetro da marca Whatman número 1. Para que ocorresse a dissecação das amostras, estas foram espalhadas na região central dos círculos de papel filtro que foram mantidos na posição horizontal até que secassem totalmente. O mesmo procedimento foi realizado com as amostras de soro sangüíneo dissecadas. Amostras de soro foram colhidas também para a realização da microtécnica de soroaglutinação microscópica (Santa Rosa, 1970)
Decorridas 72 horas da dessecação, as amostras foram eluidas, sendo as manchas formadas pelas alíquotas no papel filtro, recortadas, picadas e eluidas em 4,9 mL de solução salina tamponada de Sorensen por três horas à temperatura ambiente, obtendo-se, assim, uma diluição inicial de 1:50. Após esta etapa, cada amostra eluida foi submetida aos procedimentos da microtécnica de soroaglutinação microscópica.
Para cada animal sacrificado foram colhidos também fragmentos de lg do fígado, baço, rim e sangue para a tentativa de isolamento das leptospiras. As amostras de sangue foram semeadas em tubos de ensaio contendo meio semi-sólido de Fletcher logo após a colheita. Utilizaram-se três tubos de ensaio para a tentativa de isolamento, sendo semeada uma gota no primeiro tubo, duas no segundo e três no terceiro. Estes, após a semeadura, foram incubados em estufa a 28-30ºC durante 30 a 40 dias para a observação do crescimento do agente, seguindo-se a técnica preconizada por Santa Rosa (1970). Os órgãos foram macerados e misturados com solução salina estéril, de modo a se obter uma suspensão de tecido a 10% (1g de tecido em 9mL de solução salina estéril). A partir desta diluição inicial, prepararam-se duas outras diluições seriadas de razão dez, de forma a se obter concentrações de 10, 1,0 e O,1%; semeou-se O,1mL de cada suspensão dos orgãos em dois tubos contendo o meio semi-sólido de Fletcher, e procedeu-se à incubação em estufa a 28-30ºC por 12 semanas (Passos et al., 1988) com leituras de crescimento semanais.
RESULTADOS
Os quatro animais empregados como controles do inóculo de Leptospira interrogans sorotipo pomona e não tratados com estolato de eritromicina morreram em cinco dias após terem apresentado sinais de leptospirose (apatia, anorexia, icterícia e hemorragias). O exame do tecido renal em microscopia de campo escuro confirmou a presença do agente. Isso mostra a patogenicidade da amostra de leptospira utilizada e o efeito do antibiótico que bloqueou a evolução da fase aguda da infecção.
No grupo 1 o isolamento foi confirmado, no sangue em 9/12 dos hamsters, no fígado em 10/12, nos rins em 8/12 e no baço em 11/12 dos animais, ficando assim comprovada a infecção generalizada ou leptospiremia em todos os indivíduos deste grupo.
Nos grupos 2,3,4,5 e 6, a proporção de animais comprovadamente infectados através dos isolamentos foi respectivamente de 3/12, 6/12, 5/12, 3/11 e 3/12.
Nos grupos_ 2 a 6 houve 18 animais com isolamentos de leptospiras nos rins; no entanto, observou-se também baço positivos em dois animais do grupo dois (15ºdia pós-inoculação) e um animal do grupo cinco (90ºdia pós-inoculação) com cultivo do fígado positivo.
Os valores sorológicos obtidos nos seis grupos cpntrole da infecção foram nulos, como era esperado, pois estes animais, serviram como "sentinelas" qa infecção em função dos procedimentos de manejo adotados durante o experimento.
O grupo 5 (90º dia pós-inoculação) apresentou o óbito de um animal durante o experimento, do qual não foi possível a colheita e o processamento dos materiais para as técnicas sorológicas e tentativas de isolamento de leptospiras.
A Tabela 1 exibe as médias aritméticas dos logaritmos dos resultados da microtécnica de aglutinação microscópica segundo os três tipos de materiais examinados. Observa-se a positividade quanto à sorologia em todos os grupos e materiais, havendo, no entanto, diferenças entre valores numéricos encontrados.
Médias aritméticas dos logaritmos dos títulos de aglutininas para Leptospira interrogans sorotipo pomona segundo o dia pós-inoculação e a técnica utilizada. São Paulo, 1997.
A Figura 1 mostra o comportamento dos títulos de aglutininas ao longo do tempo do experimento. Verifica-se que os anticorpos tiveram comportamentos bastante próximos do esperado, ou seja, houve produção crescente de aglutininas, seguida pela fase de estabilização e finalmente a fase de declínio.
Ao comparar-se os resultados da análise estatística, dos títulos de aglutininas das três metodologias utilizadas, pelo teste não-paramétrico de Friedman (Siegel, 1975), verifica-se que nos cinco grupos experimentais houve significância entre os títulos de aglutininas obtidos com os três tipos de materiais examinados (sangue total eluido, soro sangüíneo eluido e soro sangüíneo fresco).
A Tabela 2 apresenta os resultados das comparações dos resultados das técnicas utilizadas duas a duas, através da prova de Wilcoxon (Siegel, 1975).
Hamsters experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo pomona e tratados com o estolato de eritromicina. Médias aritméticas dos logaritmos dos títulos de aglutininas de L. interrogans sorotipo pomona segundo os grupos experimentais e os materiais examinados. São Paulo, 1997.
Hamsters experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo pomona e tratados com o estolato de eritromicina. Comparação dos títulos de aglutininas para Leptospira interrogans sorotipo pomona obtidos pela microtécnica de soroaglutinação microscópica (Prova de Wilcoxon), para os três tipos de materiais examinados, segundo o grupo experimental e os parâmetros estatísticos calculados. São Paulo, 1997.
Hamsters experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo pomona e tratados com o estolato de eritromicina. Comparação dos títulos de aglutininas para L.interrogans sorotipo pomona obtidos pela microtécnica de soroaglutinação microscópica (cálculo dos coeficientes de correlação por postos de Spearman), para os três tipos de materiais examinados, segundo o grupo experimental e os parâmetros estatísticos calculados. São Paulo, 1997
A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos quando da aplicação do teste de correlação por postos de Spearman (Siegel, 1975) nos diversos grupos experimentais e nos três tipos de materiais examinados, quando comparados dois a dois.
DISCUSSÃO
A confirmação da virulência do inóculo empregado foi obtida a partir da observação dos sinais clínicos e da conversão sorológica em todos os animais inoculados e tratados com o estolato de eritromicina e as verificações de crescimento de leptospiras em meio de Fletcher a partir dos materiais colhidos nas necrópsias em 45% dos animais.
A utilização do papel filtro como suporte para o transporte de amostras de sangue e soro sangüíneo dissecadas demonstrou-se eficaz, embora tenham sido constatadas diferenças estatísticamente significantes entre os valores dos ,títulos de aglutininas. Maior correlação foi observada quando foram comparadas as médias dos valores sorológicos do soro sanguíneo eluido e do soro sanguíneo fresco nos primeiros 15 dias da infecção.
As imunoglobulinas de classe M e G presentes no soro sangüíneo são as principais responsáveis pela resposta imune humoral que ocorre após um estímulo antigênico. Diferem entre si quanto às suas propriedades físico-químicas, peso molecular, constante de sedimentação, estruturas primária e secundária, mobilidade eletroforética, número de unidades básicas estruturais e presença de cadeias acessórias, mas poderão ter sítios de combinação de mesma configuração espacial capazes de reconhecer os mesmos determinantes antigênicos (Guimarães, 1981). O presente estudo não determinou o comportamento das duas classes de imunoglobulinas, mas sim as concentrações das aglutininas como um todo, o que certamente foi influenciado pelo maior título de uma ou outra destas. A preservação das propriedades físico-químicas das moléculas de imunoglobulinas, como integridade da sua estrutura primária, das cadeias acessórias e manutenção da carga elétrica é necessária para o perfeito desempenho das funções do anticorpo. Este pré-requisito para uma técnica de transporte de amostras de soro sangüíneo, como é o caso da dissecação e eluição em papel filtro, parece ter sido cumprido pois, apesar das variações observadas nos títulos, todos os animais positivos para o sorotipo em estudo, foram assim demonstradas também nos materiais absorvidos em papel filtro. Portanto, do ponto de vista qualitativo, houve total coerência dos resultados, não ocorrendo reações falso-negativas.
Estatisticamente houve significância dos resultados quando comparados simultâneamente os três métodos, ao contrário do que aconteceu quando foram confrontados os processos dois a dois. A nãosignificância da diferença dos resultados foi mais intensamente observada entre os 30 e 45 dias pósinoculação quando da comparação dos exames do soro sangüíneo eluido do papel filtro com a técnica padrão. No entanto, a maior concordância quantitativa ocorreu na colheita efetuada aos 15 dias da inoculação, quando pressupõe-se a existência de uma maior concentração de IgM.
A verificada variação entre os títulos das três metodologias adotadas deve-se certamente às interferências de uma somatória de fatores, entre os quais pode-se supor os constituintes celulares e demais elementos figurados do sangue dessecado, componentes proteicos e a oxidação das proteínas do soro pelo ar atmosférico retido dentro dos envelopes plásticos. A porção carbono terminal da molécula de IgM parece ser mais resistente à desnaturação em função do tempo que as moléculas de IgG, o que também pode ter contribuido para a distribuição irregular dos títulos de aglutininas das amostras nos diversos grupos (Guimarães, 19 8½0) .
Os inúmeros fatores que poderiam declinar os títulos das aglutininas das amostras dissecadas mais rapidamente, tais como os relacionados à estocagem (tempo, temperatura, grau de umidade, presença de ar), quantidade de soro embebido, características do papel filtro e diminuição das imunoglobulinas da classe M mais rapidamente do que as da classe G, parecem não interferir de forma importante, pois os títulos tiveram perfis bastante semelhantes e, quando observadas as variações, algumas foram para além dos valores obtidos com a técnica padrão. Isto pode ser explicado, ao menos em parte, pelo tempo de estocagem relativamente curto (72 horas) quando comparado aos de Cohen et al., 1969; Thaver & Draper, 1974; Guimarães, 1981; Zhuang et al., 1982; Nilsson et al., 1985; Segui et al., 1990; Carvalho et al., 1992; De Gaspari et al.,1994; Bahia et al., 1995 e ao fato de se ter trabalhado com amostras de volume previamente conhecido (100 mL).
A praticidade e facilidades oferecidas pela técnica de dissecação e eluição de amostras sorológicas puderam ser constatadas durante os procedimentos experimentais, como averiguado anteriormente (Guimarães, 1981; Pérez & Bolívar, 1989; Carvalho et al., 1992; Nilsson et al., 1985). Embora observemos a diferença entre os valores sorológicos dos eluatos de sangue e soro sangüíneo e a técnica de soroaglutinação microscópica, que é a referência, as vantagens que esse método de preservação de alíquotas possui para trabalhos de campo certamente supera as suas deficiências.
O isolamento de leptospiras a partir de uma amostra de fígado no grupo cinco pode ter ocorrido por nova estimulação antigênica, devido à nova invasão dos hospedeiros pela bactéria a partir dos rins , o que significaria o ressurgimento da leptospiremia devido a algum fator em particular do animal, como o declínio da imunidade adquirida, ou por contaminação do meio exterior, já que os animais permaneceram eliminando o agente para o ambiente, contaminando a cama das caixas de criação.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos com o presente estudo permitiram estabelecer-se as seguintes conclusões:
1 - As amostras de sangue total eluido e soro sangüíneo eluido apresentaram resultados qualitativamente iguais ao soro sangüíneo fresco.
2 - As amostras de sangue total eluído e soro sanguíneo eluído apresentaram . resultados quantitativamente diferentes do soro sanguíneo fresco.
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STE = sangue total eluido SSE = soro sangüíneo eluido SSF=soro sangüíneo fresco