LEPTOSPIROSE EXPERIMENTAL EM EQÜINOS INFECTADOS COM LEPTOSPIRA INTERROGANS SOROTIPO COPENHAGENI. ASPECTOS CLÍNICOS E SOROLÓGICOSRESUMO
Cinco eqüinos machos, mestiços, com oito a 12 anos de idade, foram experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorotipo copenhageni. Três eqüinos, com as mesmas características, constituíram o grupo testemunha. O inóculo infectante foi constituído por amostras de leptospiras vivas cultivadas em meio Fletcher enriquecido com soro estéril de coelho, na proporção de 10%, com 30 dias de incubação à temperatura de 28ºC. A dose individual foi de 7,0 mL da cultura pela via subcutânea. Os eqüinos testemunhas receberam, individualmente, I 0,0 mL do meio de Fletcher estéril, via subcutânea. Os animais foram submetidos a exames clínicos com colheitas de amostras de sangue para a realização de exames sorológicos. As colheitas de sangue foram realizadas no 21º, 14º, 7º dias e imediatamente antes da infecção experimental, e no I º, 3º, 5º, 7°, 14º, 18º, 24º, 37º, 56º, 72º e 100º dia pós-infecção. Os exames clínicos foram efetuados no 21º 14º, 7º, 3º, 2° e lº dia antes da infecção, diariamente até o 40º dia, no 56º, no·12° e no 100º.dia pósinfecção. A pesquisa de anticorpos séricos foi efetivada através do teste de soroaglutinação microscópica. Os títulos de anticorpos homólogos foram observados a partir do 5° dia pós infecção. Todos os eqüinos\ infectados apresentaram níveis crescentes de anticorpos até o I 8ºdia, quando a.média geométrica dos títulos foi de 3,685. Os eqüinos infectados apresentaram hipertermia, anorexia, icterícia, petéquias hemorrágicas na cavidade oral e uveítes recorrentes. As médias aritméticas da temperatura retal no grupo de animais inoculados apresentaram elevação superior à faixa da normalidade entre o 13º e o 29º dia pós-inoculação.
PALAVRAS-CHAVE:
Leptospiiose; qumos; sorotipo copenhageni,; aspectos sorológicos e sinais clíi1it6s
ABSTRACT
Five male cross-bred horses, between eight and twelve years old, were experimentally infected with Leptospira interrogans serovar copenhageni. Three other horses, with the sarne characteristics, were used as a contrai group. The inoculum was constituted of live Leptospira strains cultivated in Fletcher medium enriched with sterile rabbit serum, in the proportion of 10%, and incubated for 30 days at 28ºC. The individual dose was 7.O mL, through the subcutaneous route. The horses of the contrai group received 10.O mL of sterile Fletcher medium, through the subcutaneous route. Animais were submitted to clinicai examinations and blood samples were taken for serological tests. Blood s.amples were obtained on days 21, 14, 7 and immediately.before the inoculation, and on days 1, 3, 7, 24, 37, 56, 72 and 100 after the inoculation. Clinicai examinations were performed on days 21, 14, 7, 3, 2 and I before, on the day of inoculation, daily up to the 40th day, on the 56th, 72nd and 100th days after inoculation. The presence of antibodies in the sera of the infected and the contrai animais were investigated by the microscopic agglutination test. Homologous antibody titers were detected after the 5th post-inoculation day. All the infected animais showed an increase of the antibody titers up to the 18th day after inoculation, when the geometrical mean of the antibody titres was the highest, 4,851.3. Infected horses showed fever, anorexia, icterus, oral hemorrhagic petechias and recurrent uveitis. Arithmetical means of the rectal temperature in the infected group showed increases above the normality between the 13th and the 29th day after inoculation.
KEY WORDS:
Leptospirosis; horses; serovar copenhageni,; clinicai and serological aspects.
INTRODUÇÃO
A leptospirose eqüina pode apresentar uma evolução clínica assintomática (Bernard, 1993), ou desenvolver sinais clínicos (Faine, 1994), como: febre, conjuntivite, hemorragias, icterícia, ceratite, com graus variáveis dê conjuntivite, fotofobia, dor e também Illanifestação aguda renal em animais jovens (Hogan et al.,1996). No·Chile, Wegmann (1984) verificou que eqüinqs naturalmente infectados pelo sorotipo copenhageni, apresentaram febre, anorexia, uveítes recorrentes e icterícia. Esse autor ainda relata que nos eqüinos infectados a uveíte pode manifestarse nos 30 dias da infecção. Desta forma o diagnóstico no campo toma-se mais difícil, sendo mais provável a observação da opacidade de córnea que às vezes pode anteceder 6 quadro de uveíte (Bernard, 1993).
Além dessas aherações clínicas, Donahue et al. (1991) constataram que mais de 85% de éguas com transtornos reprodutivos apresentavam aglutininas contra o sorotipo copenhageni.
Com relação à uveite recorrente eqüina, Sillerud et al. (1987) encontraram uma associação significativa entre eqüinos naturalmente infectados e a presença de anticorpos contra o sorotipo pomona; tal observação não foi verificada com os sorotipos icterohaemorrhagiae, bratislava, canicola, hardjo e grippotyphosa.Dwyer et al. (1995), examinaram 9.500 eqüinos e constataram que somente 1,4% apresentaram uveítes recorrentes e que em 56% desses casos os animais apresentaram anticorpos contra o sorotipo pomona.Wollanke et al. (1998) verificaram que de 150 eqüinos clinicamente com uveítes recorrentes, 86 (57%) apresentaram títulos de anticorpos maiores no humor vítreo do que no soro sangüíneo; entre os 150 eqüinos doentes, 90 apresentaram títulos de anticorpos significantes no humor vítreo (p< 0,001). Os sorotipos mais encontrados tanto no humor aquoso como no soro sangüíneo foram grippotyphosa, copenhageni e pomona.
Do exposto, pode-se depreender que os estudos sobre a patogenia de sorotipos de L. interrogans, em eqüinos são escassos e, desse modo, o presente trabalho relata a evol'tlção da: leptospttose em·eqüir10s experimentalmente infectados pelo sorotipo copenhageni, variante esta agrupada em um dos sorogrupos de leptospiras patogênicas de grande importância no Brasil.
MATERIAL E MÉTODOS
A estirpe virulenta de L. interrogans sorotipo copenhageni empregada para a infecção experimental dos eqüinos foi isolada de sangue humano durante a fase aguda da infecção. Essa estirpe foi tipificada pelo Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, sendo denominada de estirpe 43/IAL. Após o primo-isolamento em meio de Fletcher, a estirpe passou a ser ativada em cobaias jovens através de inoculação de 1 mL da cultura pela via intraperitoneal. Decorridos de quatro a cinco dias após a inoculação, os animais que apresentavam sinais clínicos foram sangrados por punção cardíaca e sacrificados na fase agônica da infecção. Em seguida, semeavam-se duas gotas de sangue em meio semi-sólido de Fletcher e incubava-se à temperatura de 28ºC por um período de 30 dias. A partir desse cultivo, foram obtidas as estirpes empregadas como inóculo para a infecção experimental dos eqüinos.
Foram utilizados oito eqüinos, machos, mestiços, com oito a 12 anos de idade. Aos 21, 14 e sete dias antes da inoculação, todos os animais foram submetidos a exames clínicos. Os animais estavam clinicamente normais, não apresentavam alteração nos exames de urina, estavam livres de anticorpos contra qualquer um dos sorotipos de leptospira empregados e não se caracterizavam como portadores renais. Posteriormente, os animais foram distribuídos em dois grupos submetidos a condições de manejo idênticas.
A presença de anticorpos contra leptospira foi investigada pela técnica de soroaglutinação microscópica (SAM) segundo Santa Rosa (1970), executada com uma coleção de antígenos vivos constituídos por 18 sorotipos de leptospiras patogênicas (australis, autumnalis, castellonis, bataviae, brasiliensis, butembo, canicola, whitcombi, grippotyphosa, copenhageni, icterohaemorrhagiae, javanica, panama, pomona, pyrogenes, hardjo, wolffi e shermani) e quatro sorotipos de leptospiras saprófitas (andamana, patoc, rufino e buenos aires).
O estado-de-portador renal de leptospiras foi investigado, através da cultura de urina em meio de Fletcher (Santa Rosa, 1970).
Cinco eqüinos foram infectados com a dose individual de 7 mL de cultura viva da estirpe 43/IAL de L. interrogans sorotipo copenhageni, pela via subcutânea. Três eqüinos foram mantidos como grupo testemunha e receberam como placebo, 10 mL de meio semi-sólido de Fletcher esterilizado, pela via subcutânea.
As amostras de sangue para os exames sorológicos foram obtidas de todos os animais, inclusive do grupo testemunha, no 21º, 14º e 7º dia anterior à inoculação enolº, 3°, 7º, 14º, 18º, 24º, 37º, 56º, 72º e 100º dia pós-inoculação.
Nos animais inoculados e testemunhas, foram realizados exames clínicos gerais, observando-se alterações de olho, de pele, de mucosas e de excreções. Ess·es exames e mais a tomada da temperatura retal, das freqüências cardíaca e respiratória foram efetuados aos 21, 14, 7, 3, 2, e 1 dia antes da inoculação e diariamente, do momento da inoculação até 40º dia e no 56º, 72º e 100º dia. Os exames oftálmicos foram realizados em ambiente de baixa luminosidade e com oftalmoscópio direto, segundo as recomendações de Gelatt (1991).
Para cada parâmetro pesquisado, foram realizadas análises de variância individuais seguindo um delineamento inteiramente casualizado com dois tratamentos: grupo dos inoculados (cinco animais) e grupo dos testemunhas (três animais). Para as análises consideradas significativas foi aplicado o teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade.
RESULTADOS
Os resultados obtidos pela prova de SAM nos soros sangüíneos dos eqüinos inoculados com o sorotipo copenhageni são apresentados na Tabela 1, e a curva dos títulos de anticorpos contra o antígeno homólogo pode ser observada na Figura 1. Através da Tabela l, pode-se verificar que os títulos de anticorpos séricos começaram a aparecer a partir do 5º dia pós-inoculação. A média geométrica dos títulos de anticorpos nesse dia foi de 30,5, sendo que no soro dos eqüinos números 2 e 5 os títulos encontrados foram os maiores, 100. Por outro lado, nos eqüinos 1 e 3 os títulos foram menores, 50 no 5° dia pós-inoculação, e com o soro do eqüino 4 não houve aglutinação. Em todos os eqüinos infectados foi observada elevação dos títulos sorológicos a partir do 7º dia pós-inoculação, sendo obtidos os maiores títulos no 18º dia, quando a média geométrica dos títulos foi de 4.851,3. O maior título aglutinante encontrado durante o experimento foi de 6.400, verificado no 18º dia, no soro dos eqüinos de números 1, 2 e 4. A partir do 24º dia após a inoculação, os títulos começaram a cair, variando entre 50e400. No 100° dia pós-inoculação, a média geométrica dos títulos foi de 152,8.
O eqüino de número 5 apresentou anticorpos contra o sorotipo pomona no 7º dia após a inoculação, os quais persistiram, com título 100, até o 18º dia pós-infecção.
Os exames de microscopia de campo escuro efetuados nas culturas dos fragmentos dos rins e do fígado de todos os animais não revelaram a presença do sorotipo copenhageni.
O grupo dos eqüinos testemunhas não apresentou qualquer alteração clínica no decorrer do experimento. As manifestações clínicas observadas nos eqüinos inoculados com o sorotipo copenhageni foram as seguintes:
O eqüino I apresentou anorexia, febre e petéquias hemorrágicas na mucosa oral; o quadro febril de longa duração persistiu entre o 7º e o3tf' dia pós-inoculação. A anorexia foi observada entre o 5º e o 12º dia, e as petéquias hemorrágicas na mucosa oral foram verificadas entre o 15º e o 21º dia pós-inoculação. Algumas petéquias romperam e originaram pequenas úlceras.
Aglutininas contra leptospira interrogans sorotipo copenhageni em eqüinos experimentalmente infectados com o mesmo sorotipo, expressas em títulos de anticorpos* aglutinantes obtidos através da reação de soroaglutinação microscópica, segundo o número de identificação do animal e o momento da colheita de sangue. Jaboticabal, 1992.
O eqüino 2 apresentou anorexia, febre, petéquias hemorrágicas na cavidade oral e uveíte recorrente unilateral. A anorexia esteve presente entre o 8º e o 15º dia e do 22º ao 25º dia pós-inoculação; a hipertermia foi verificada entre o 12 \e o 22º dia, bem como no 28º e no 29º dia pós-inoculação; as petéquias hemorrágicas foram registradas entre o 17º e o 24º, dia e a uveíte recorrente ocorreu entre o 18º e o 32º dia pós-inoculação.
O eqüino 3 apresentou anorexia, febre, icterícia e uveíte recorrente unilateral. Esse animal foi o único a apresentar simultaneamente icterícia e uveíte recorrente entre o 21º e o 32º dia pós-inoculação. A icterícia foi observada na mucosa oral e ocular a partir do 12º dia, persistindo até o 37º dia.
O eqüino 4 apresentou anorexia e febre entre o 6º e o 20º dia pós-inoculação e emagrecimento progressivo a partir do 37º dia pós-inoculação.
O eqüino 5 apresentou anorexia, febre, icterícia e petéquias hemorrágicas na mucosa oral. A icterícia na mucosa conjuntival foi de longa duração, persistindo entre o 16º e o 56º dia pós-inoculação. A anorexia situou-se entre o 5º e o 12º dia, a febre entre o 18º e o 36º dia e as petéquias hemorrágicas entre o 20º e o 29º dia pós-inoculação.
Diante dessas manifestações clínicas, constatouse que a síndrome febre-anorexia apareceu em 100%, as petéquias hemorrágicas em 60% e a icterícia e uveíte recorrente, em 20% dos eqüinos infectados.
A Figura 2 apresenta os valores das médias aritméticas das temperaturas retais antes e após a inoculação. No grupo de animais infectados com o sorotipo copenhageni, observa-se que do 13º ao 29º dia as médias de temperaturas são superiores à faixa da normalidade. A maior média aritmética da temperatura, 39,8ºC, foi registrada no 18º e no 19º dia pósinoculação. Nessa ocasião, os eqüinos 1 e 2 apresentaram temperaturas retais individuais superiores a 40ºC, eos demais permaneceram na faixa de 39,2ºC e 39,9ºC. O grupo dos eqüinos testemunhas manteve valores dentro das variações consideradas normais.
DISCUSSÃO
A confirmação da indução da leptospirose nos eqüinos experimentalmente infectados ficou caracterizada pela conversão sorológica e pelos sinais clínicos apresentados. No grupo de eqüinos infectados, os anticorpos séricos foram demonstrados a partir do 5º dia pós-infecção, atingindo títulos aglutinantes da ordem de 6.400 no 18º dia pós-infecção. Esses resultados demonstram a virulência e o poder imunogênico da estirpe de Leptospira utilizada para promover a infecção.
O eqüino 5, infectado com o sorotipo copenhageni, também apresentou aglutininas contra o sorotipo pomona no 7º e no 18º dia pós-infecção; no entanto, o título aglutinante foi inferior ao obtido contra o sorotipo homólogo. De acordo com Kmety ( 1958), essas reações ocorrem mais freqüentemente entre o 6º e o 14º dia da doença. Embora o título tenha surgido em apenas um animal e o sorotipo pomona seja freqüentemente encontrado em eqüinos, não se pode assegurar que tal título deva-se a reação paradoxal, uma vez que não se pode excluir a possibilidade do animal, mantido sob condições de campo, ter se infectado naturalmente com o sorotipo pomoma. Apesar disso, Lees & Gale (1994) mencionam que baixos títulos sorológicos podem significar reação cruzada.
O quadro clínico de anorexia, verificado em todos os eqüinos experimentalmente infectados, não difere dos achados de Wegmann (1984) em eqüinos naturalmente infectados pelo sorotipo copenhageni.
A manifestação clínica de icterícia foi observada em dois animais infectados. Essa constatação também foi verificada em eqüinos naturalmente infectados pelo sorotipo copenhageni (Wegmann, 1984). Essa alteração não é comum na espécie eqüina (Hogan et al.,1996), sendo às vezes observada em casos clínicos de leptospirose causada pelo sorotipo pomona (Faine, 1994).
É provável que a intensa multiplicação das leptospiras na corrente sangüínea tenha sido a responsável pela queda dos títulos sorológicos em decorrência da ação "in vivo" dos anticorpos circulantes. Possivelmente, a uveíte recorrente durante a fase de leptospiremia, originou-se da reação de hipersensibilidade oriunda da reação antígenoanticorpo. Essa observação está de acordo com Faine (1994), que menciona a possibilidade de uveíte ser diagnosticada já na segunda semana de infecção. A despeito de uveíte como complicação tardia não estar bem esclarecida, Dwyer et al. ( 1995) admitem que o seu surgimento envolva mecanismos imunológicos. Entretanto, animais infectados podem apresentar somente anticorpos contra leptospira no soro sangüíneo e não apresentar qualquer alteração clínica ou imunológica nos olhos (Wollanke et al.,1998).
As petéquias hemorrágicas na mucosa oral foram observadas em três animais do grupo infectado. Essa alteração clínica parece ser o primeiro sinal da enfermidade; talvez nas infecções naturais o mesmo possa passar despercebido. No entanto, Faine (1994) cita a presença de petéquias hemorrágicas na mucosa oral de cães infectados com o sorotipo icterohaemorrhag iae.
Todos os animais infectados apresentaram elevação da temperatura retal, a qual foi um dos sinais clínicos observados por Wegmann (1984) em eqüinos pelo sorotipo copenhageni.
Média geométrica dos títulos de aglutininas para a variante copenhageni, segundo o tempo pós-infecção expresso em dias.
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