NECROSE EM MILHO (ZEA MAYS L.) OCASIONADA POR BURKHOLDERIA GLADIOURESUMO
Em campo de produção de sementes de milho da cultivar Dina 10, safra 90/91, localizado na região de Tambaú, SP, foram observadas, de forma generalizada, plantas apresentando uma necrose úmida das brácteas que atingia o pedúnculo das espigas. Dessas lesões foram obtidas bactérias, cujas colônias eram de coloração creme, que apresentavam um enrugamento não característico de bactérias fitopatogênicas. Essas bactérias mostraram-se patogênicas nas inoculações artificiais realizadas. Testes bioquímicos, culturais, fisiológicos e serológicos, bemcomo eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio, permitiram caracterizar o agente causal como Burkholderia gladioli (sin. Pseudomonas gladioli). Cultura de isolado bacteriano está depositada na Coleção de Culturas IBSBF, sob nº 902.
PALAVRAS-CHAVE:
Burkholderia gladioli, milho; Zea mays.
ABSTRACT
Parental plants of com "Dina I O" showing necrotic, water-soaked lesions in the bract that extended to the peduncles were observed in 1990/91 in Tambaú county, State of São Paulo, Brazil. Bacteria, whose colonies had a wrinked or convoluted surface and irregular margins, were consistently isolated from these lesions. These bacteria showed pathogenicity to com plants under artificial inoculations. Biochemical, cultural, physiological and serological characteristics of the isolates and poliacrilamide gel eletrophoresis with sodium dodecil sulphate confirmed the causal agent as Burkholderia gladioli (syn. Pseudomonas gladioli). Culture was deposited in the IBSBF Culture Collection under number 902.
KEY WORDS:
Burkholderia gladioli, com; Zea mays.
Cerca de 15 espécies bacterianas pertencentes aos gêneros Bacillus, Clavibacter, Curtobacterium, Envinia, Herbaspirillum, Pantoea, Pseudomonas, Spiroplasma e Xanthomonas já foram relatadas como ocasionando doenças na cultura do milho (Zea mays L.) (Bradbury, 1986; Baldani et al., 1996; Young et al., 1996). Além desses gêneros já relacionados, existem também organismos do tipo micoplasma, atualmente denominados fitoplasmas, englobados no proposto gênero Phytoplasma (Davis, 1995).
No Brasil, o primeiro relato de bacteriose em milho foi o de Frenhani et al. (1969), descrevendo a ocorrência de Acidovorax avenae subsp. avenae (sin. Pseudomonas alboprecipitans, Pseudomonas avenae, Pseudomonas rubrilineans) em plantios comerciais localizados em Jardinópolis-SP, causando manchas foliares necróticas, alongadas, que quando coalesciam causavam crestamento. São também relacionadas outras bactérias como Erwinia chrysanthemi causando podridão do topo, do colmo e de espigas em Brasília-DF, em Sete Lagoas, MG e em Itatiba, SP (Reifschneider & Lopes, 1982; Malavolta Jr. et al., 1993); uma Pseudomonas não fluorescente, espécie não identificada, causando necrose do ápice foliar de plântulas (Oliveira et al., 1991); o fitoplasma "maize bushy stunt" e Spiroplasma kunkelli causando o enfezamento vermelho e o enfezamento pálido, respectivamente (Kitajima, 1986; Massola et al., 1998). A ocorrência de Pantoea stewartii (sin. Erwinia stewartii) foi cogitada por Pereira & Zagatto (1968), mas sem confirmação de sua patogenicidade através da comprovação pelos postulados de Koch.
Em 1991, em campos de produção de sementes de milho situados no município de Tambaú-SP, foram observadas plantas apresentando manchas aquosas na base das brácteas e pedúnculo da espiga (Fig. 1), as quais evoluíam para coloração preta, causando posterior desfibramento de toda a palha. Os sintomas apareceram por ocasião do embonecamento das plantas, quando, após um período de seca, ocorreram chuvas excessivas. Estudos preliminares indicaram tratar-se de uma doença de etiologia bacteriana. Com o objetivo de se caracterizar o agente causal, foi desenvolvido o presente trabalho.
Para isolamento do patógeno, pequenas porções de tecido com sintomas da doença foram macerados em água destilada esterilizada e a suspensão resultante plaqueada em meio nutriente agar (Levine, 1954) ou meio B de King (BK) (King et al., 1954). Os isolamentos efetuados mostraram, após 72 horas de incubação, colônias circulares, de coloração creme, enrugadas e que difundiam pigmento esverdeado não fluorescente para o meio BK (Fig. 2).
Apesar da morfologia atípica apresentada pelas colônias (enrugamento não característico de bactérias fitopatogênicas), elas foram selecionadas e repie.adas, devido à sua quantidade e freqüência nos diversos isolamentos efetuados. Os testes de hipersensibilidade em folhas de fumo (Klement et al., 1964) foram positivos, indicando tratar-se de bactéria fitopatogênica.
A comprovação de patogenicidade foi feita através da infiltração de suspensões aquosas dos isolados (concentração aproximada de 108 ufc/mL) em folhas de milho cv. Dina 10 com 30 dias de idade, mantidas em vasos em casa de vegetação. Foi também observada a patogenicidade em espigas de plantas cultivadas em condições de campo, sendo as inoculações realizadas através de aspersão de suspensões bacterianas em concentração semelhante à citada anteriormente. Após as inoculações, as plantas e/ou espigas foram mantidas sob condições de câmara úmida. Nas testemunhas, o inóculo foi substituído por água destilada.
Aspecto enrugado das colônias de Burkholderia gladioli obtidas nos isolamentos de plantas de milho.
Nas inoculações realizadas em plantas jovens observou-se o aparecimento de lesões anasarcadas ao redor das áreas foliares infiltradas. Essas lesões evoluíram para manchas necróticas, escurecidas, de coloração marrom, que aumentaram em tamanho (Fig. 3). Nas inoculações realizadas em espigas também conseguiu-se reproduzir os sintomas da doença, embora com uma evolução mais lenta, particularmente após a retirada da câmara úmida, possivelmente devido às condições climáticas durante os testes. Reisolamentos efetuados a partir dos materiais infectados artificialmente resultaram em colônias semelhantes às originais. Plantas testemunhas não apresentaram qualquer alteração dos tecidos.
A produção de pigmento esverdeado não fluorescente difusível em meio BK apresentada pelos isolados em estudo é característica de determinadas espécies bacterianas fitopatogênicas (Burkholderia cepacia, B. gladioli e Pseudomonas corrugata). Dessa maneira, para identificação, foram empregados testes bioquímiêos, culturais e fisiológicos direcionados para essas espécies bacterianas (Lelliott & Stead, 1987). Foram utilizados três isolados bacterianos de milho além de outras 5 culturas bacterianas, provenientes da Coleção de Culturas IBSBF, que foram empregadas a título de comparação (Tabela l ).
Foram realizados também testes serológicos de dupla difusão em agar, empregando-se antígenos dos isolados em estudo e dos constantes na Tabela 1 e antissoros contra os isolados de Burkholderia cepacia, B. gladioli e Pseudomonas corrugata.
Alíquotas do complexo proteico da membrana (CPM) (Thaveechai & Schaad, 1986) de todos os isolados já relacionados foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (PAGE/SDS) (Hames, 1982; Bium et al.,1987), após dosagem proteica (Hartree, 1972).
A comparação dos resultados dos testes bioquímicos, culturais e fisiológicos obtidos e expressos na Tabela 2 mostraram similaridade entre os isolados de milho e B. gladioli. Nas reações serológicas, houve identidade total entre os isolados de milho e os antissoros contra B. g. pv. gladioli e B.g. pv. aliicola (AS-605 e AS-583). O perfil proteico em PAGE/SDS dos isolados de milho foi semelhante àquele obtido para os isolados de B. gladioli (pvs. gladioli e alliicola). A análise de todos os resultados, juntamente com algumas características diferenciais entre Burkholderia cepacia, B. gladioli e Pseudomonas corrugata (Tabela 3), confirmaram a classificação da bactéria isolada de milho como Burkholderia gladioli.
Características bioquímicas, culturais e fisiológicas do isolado de milho e de Burkholderia gladioli.
Algumas características diferenciais entre Pseudomonas corrugata, Burkholderia cepacia e B. gladioli.*
Esta é a primeira constatação, a nível mundial, da presença de B. gladioli em plantas de milho. Tratase também do primeiro relato dessa bactéria apresentando morfologia atípica das colônias, no Brasil. Em 1989, foi observada na Inglaterra, a ocorrência de B. gladioli pv. alliicola, isolada de bulbos de cebola armazenada (Forster et al., 1989), mostrando colônias bacterianas com morfologia semelhante àquela apresentada pelos isolados obtidos de milho.
Estudos realizados para se determinar o patovar da bactéria, incluindo inoculação em plantas de gladíolo e de cebola além de outros testes serológicos e eletroforese em PAGE/SDS, não permitiram adiferenciação a nível infra-específico.
Isolado da bactéria foi incorporado à Coleção de Culturas IBSBF sob nº 902.
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