SENSIBILIDADE AO FUNGICIDA BENOMYL IN VITRO DE ISOLADOS DE COLLETOTRICHUM GLOEOSPORIOIDES PROVENIENTES DE FRUTOS DE PIMENTÃO, JILÓ E BERINJELARESUMO
A antracnose dos frutos das solanáceas, devida à Colletotrichum gloeosporioides, ocasiona elevados prejuízos aos agricultores do Estado do Rio de Janeiro. O controle químico tem-se mostrado pouco eficiente, sob condições climáticas propícias ao patógeno, que comumente prevalecem nas regiões produtoras. Objetivou-se estudar a sensibilidade in vitro de isolados de C. gloeosporioides, provenientes de pimentão (Capsicum annuum), jiló (Solanum gilo) e berinjela (Solanum melongena), em relação ao fungicida benomyl, um dos mais utilizados pelos agricultores fluminenses contra o agente da antracnose. Culturas monospóricas de 34 isolados foram repicadas para meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar) complementado com as concentrações de zero (controle), 1, 10, 100 e 1000 µg / mL de benomyl. As diluições do fungicida foram feitas em acetona a 20% e sua adição ao meio foi realizada antes da autoclavagem. Constatou-se variação significativa no crescimento micelial entre isolados e em função da concentração do fungicida. A maioria dos isolados de pimentão apresentou crescimento micelial mais vagaroso do que aqueles obtidos das outras espécies. Tal fato ocorreu com as concentrações de zero, 1, 10, 100 µg / mL de benomyl. Os isolados de jiló e berinjela não diferiram entre si, mesmo na ausência do fungicida, indicando sua similaridade genética.
PALAVRAS-CHAVE:
Antracnose; especificidade por hospedeiro; Capsicum annuum; Solanum gilo; Solanum melongena
ABSTRACT
The anthracnose of solanaceous fruits, caused by Colletotrichum gloeosporioides, is a very harmful fungal disease in the State of Rio de Janeiro, Brazil. Chemical control with fungicides has not been efficient under climatic conditions favorable to the pathogen. The present study had the purpose of evaluating in vitro sensitivity to benomyl among isolates of C. gloeosporioides obtained from sweet pepper (Capsicum annuum), garden egg (Solanum gilo), and eggplant (Solanum melongena). This fungicide is commonly recommended to the growers against anthracnose. Monosporic cultures of 34 isolates were transferred to Petri dishes of PDA (potato-dextrose-agar) complemented with 0 (control treatment), 1, 10, 100, and 1000 µg / mL of benomyl. The fungicide was diluted in 20% acetone and added to the medium before autoclaving. A significant variation in mycelial growth was detected as related to the isolate and to the fungicide concentration. Most of the isolates coming from sweet pepper fruits had a growth rate lower than the others. Isolates from garden egg and eggplant groups did not differ from each other even with any fungicide in the medium, thus indicating genetic similarity. The slower mycelial growth of the pepper isolates was verified at 0, 1, 10, and 100 µg / mL of benomyl concentration.
KEY WORDS:
Anthracnose; host specificity; Capsicum annuum; Solanum gilo; Solanum melongena
INTRODUÇÃO
A antracnose, causada por Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., é uma das principais doenças do pimentão (Capsicum annuum L.), do jiló (Solanum gilo Raddi) e da berinjela (Solanum melongena L.) no Estado do Rio de Janeiro. O patógeno se manifesta em plantas de qualquer idade, mas é nos frutos que seus danos são mais expressivos, por meio de lesões necróticas tendendo à forma circular, deprimidas e de diâmetro variável (KUROZAWA & PAVAN, 1997). Esses sintomas, por vezes, aparecem após a colheita, durante o transporte e a comercialização dos frutos, acarretando prejuízos ainda maiores.
Colletotrichum gloeosporioides é uma espécie bem caracterizada, mediante parâmetros morfológicos, fisiológicos e moleculares, abrangendo isolados obtidos de Stylosanthes spp. (BRAITHWAITE et al., 1990; CHAKRABORTY et al., 1996), Citrus spp. (LIYANAGE et al., 1992; BROWN et al., 1996), morangueiro (SMITH & BLACK, 1990; GUNNELL & GLUBLER, 1992; FREEMAN & RODRIGUEZ, 1995) e abacateiro (HODSON et al., 1993; FREEMAN et al., 1996). Por outro lado, estirpes do patógeno que incidem sobre solanáceas não têm recebido a mesma atenção.
A aplicação de fungicidas é, há muitos anos, o mais difundido método de controle a C. gloeosporioides no Brasil (ROBBS & VIEGAS, 1978). Entretanto, os princípios ativos recomendados não têm apresentado alta eficiência contra o agente causal da antracnose das solanáceas cultivadas (FERNANDES et al., 1991; JEFFRIES & KOOMEN, 1992; PEREIRA, 1995).
Estudos mais recentes demonstraram que C. gloeosporioides apresenta especialização patogênica dentro da família Solanaceae (KUROZAWA & PAVAN, 1997; FERNANDES, 1997). Para subsidiar programas de melhoramento visando a resistência genética, o conhecimento da variabilidade do fungo torna-se imperativo. Dentre os diversos atributos genéticos, a sensibilidade a compostos químicos tem sido empregada para caracterização de isolados de Colletotrichum de diferentes origens (SHABI et al., 1994; BERNSTEIN et al., 1995). BERNSTEIN et al. (1995), estudando 72 isolados de Colletotrichum, de frutos de pessegueiro (Prunus persica), pecã (Carya ellioensis) e outros hospedeiros, detectaram dois grupos distintos do patógeno: o primeiro, formado por representantes da espécie Colletotrichum acutatum, apresentou colônias de coloração rósea, crescimento rápido em meio BDA (batata-dextroseágar) e crescimento satisfatório em meio complementado com benomyl; o segundo grupo, de isolados da espécie C. gloeosporioides, caracterizou-se por colônias de cor acinzentada, cresceu mais lentamente em BDA e não se desenvolveu em meio com o mesmo fungicida. BALARDIN & RODRIGUES (1995) registraram sensibilidade diferenciada entre raças de Colletotrichum lindemuthianum com respeito a fungicidas. Esses autores assinalaram que o aumento da concentração de fungicidas resultou em diminuição do crescimento micelial das raças, sendo que a maior inibição foi devida ao benomyl e ao tiofanato metílico.
O presente trabalho teve por objetivo avaliar, in vitro, o comportamento de isolados de C. gloeosporioides, provenientes de frutos de pimentão, jiló e berinjela, em relação a concentrações do fungicida benomyl, um dos mais utilizados contra o agente da antracnose.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram obtidos 34 isolados de C. gloeosporioides provenientes de frutos de pimentão, jiló e berinjela (Quadro 1).
Os isolamentos foram realizados a partir de lesões típicas de antracnose, sendo os frutos doentes desinfestados superficialmente através de imersão por um minuto em solução de hipoclorito de sódio comercial (contendo 5% de cloro ativo), diluída na proporção de uma parte do produto para três partes de água esterilizada. Seguiu-se lavagem em água esterilizada, sendo os frutos secos com papel toalha e transferidos para sacos plásticos previamente umedecidos com água esterilizada.
Os sacos plásticos selados e contendo os frutos assim tratados, foram mantidos à temperatura ambiente por, aproximadamente, 48 horas para induzir esporulação do patógeno sobre as lesões. Conídios foram então transferidos com auxílio de agulha histológica flambada, para placas com BDA. As placas foram incubadas em ambiente a aproximadamente 25 oC, na ausência de luz, durante sete dias.
Foram obtidas culturas monospóricas de cada isolado, “semeando-se” uma suspensão diluída de conídios sobre a superfície de meio ágar-água. Após 24 horas de incubação em temperatura ambiente, as placas foram examinadas ao microscópio e esporos individualizados transferidos para novas placas de BDA, sendo a incubação também efetuada a + 25 oC. As culturas monospóricas de cada isolado foram armazenadas no refrigerador, em tubos com BDA ou em água esterilizada, segundo o método de Castellani (FIGUEIREDO, 1967).
Os diferentes isolados foram colocados através de discos com crescimento micelial de 0,44 cm de diâmetro, no centro de placas contendo BDA adicionado de zero (controle), 1, 10, 100 e 1000 µg / mL de benomyl (metil - 1 - (butilcarbamoil) - 2 -benzimidazol carbamato). Foram realizadas três repetições por tratamento, cada placa correspondendo a uma repetição, adotando-se o delineamento experimental inteiramente casualizado.
As diluições de benomyl foram feitas em acetona a 20% e o fungicida adicionado ao meio antes da autoclavagem (GHINI, 1987).
Isolados de Colletotrichum gloeosporioides avaliados quanto à resistência ao benomyl, com indicações sobre local de procedência e hospedeiro de origem.
As placas foram incubadas por seis dias à temperatura de aproximadamente 25 oC, no escuro, determinando-se o crescimento micelial linear através de medições do maior diâmetro das colônias.
Na análise de variância foram considerados os isolados individualmente e também com os isolados agrupados em relação aos seus hospedeiros de origem. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Detectou-se variação significativa, quanto ao crescimento micelial, entre isolados de C. gloeosporioides e em função da concentração do fungicida adicionado ao meio de cultura (Tabelas 2 e 3). O benomyl, todavia, não inibiu totalmente o crescimento micelial dos isolados, ainda que na concentração máxima de 1000 µg / mL.
Efeito de diferentes concentrações de benomyl em meio de cultura BDA, no crescimento micelial linear de isolados de Colletotrichum gloeosporioides, após incubação a + 25 oC, por seis dias, na ausência de luz.
Os isolados originários de pimentão, em sua maioria, apresentaram sensibilidade mais acentuada ao benomyl em comparação aos demais isolados, mesmo quando submetidos a baixas concentrações do fungicida. Fenômeno semelhante foi verificado por SHABI et al. (1994), trabalhando com isolados oriundos de frutos de abacateiro, que foram mais sensíveis aos fungicidas benzimidazoles do que aqueles obtidos de amendoeira.
Efeito de concentrações de benomyl adicionadas ao meio de cultura BDA no crescimento micelial linear de isolados de Colletotrichum gloeosporioides agrupados por hospedeiro de origem, após incubação a ± 25oC por seis dias, na ausência de luz.
Ao examinar o comportamento dos isolados ora estudados em função de seu respectivo hospedeiro (Fig. 1), constatou-se que a maioria daqueles procedentes de frutos de pimentão apresentou diâmetros médios de colônias significativamente inferiores aos dos demais isolados. Tal fato ocorreu com as concentrações de 0 a 100 µg / mL de benomyl. Os isolados de pimentão EEI/550 e EEI/568 comportaram-se de forma diferente em relação a todos os outros isolados testados, ou seja: a partir da concentração de 1 µg / mL de benomyl ocorreu uma considerável redução do crescimento micelial dos isolados, que não diferiu significativamente dos efeitos acarretados pelas concentrações de 10, 100 e 1000 µg / mL do fungicida. Esses dois isolados, portanto, mostraram-se altamente sensíveis ao benomyl in vitro, embora originários de regiões geograficamente distantes, o que indica que não sofreram forte pressão de seleção, imposta pelo emprego continuado do fungicida em questão. Esse comportamento diferenciado poderia configurar o fato de que o restante dos isolados da coleção avaliada já revela algum nível de tolerância ao benomyl, o que, por seu turno, explicaria a pouca eficácia do fungicida freqüentemente verificada no campo.
Em contrapartida, outros dois isolados obtidos de frutos de pimentão (EEI/569 e EEI/570) comportaram-se de forma semelhante aos isolados de jiló e berinjela. Nas concentrações de 1, 10 e 100 µg / mL de benomyl no meio de cultura, houve redução equivalente a cerca de 40 % do crescimento micelial, enquanto que com 1000 µg / mL a redução do crescimento foi bem mais acentuada, diferindo significativamente das demais concentrações.
A ocorrência de estirpes de fungos resistentes a substâncias do grupo dos benzimidazois já é conhecida. TU & MCNAUGHTON (1979) determinaram 13 biótipos de Colletotrichum lindemuthianum resistentes ao benomyl. Verificaram, também, diferenças culturais quanto à esporulação e ao crescimento dos diferentes biótipos desse fungo. MARIOTTO (1985) detectou redução da eficácia de benomyl no controle de Cercosporidium personatum em condições de campo, registrando, ainda, que o fungo cresceu em meio de cultura aveia-ágar contendo 100 ppm do respectivo princípio ativo. REMIRO & KIMATI (1974) verificaram que o fungo Mycosphaerella fragariae desenvolveu resistência ao benomyl, com determinados isolados crescendo na presença de até 100 ppm do fungicida incorporado ao meio de cultura. TOLEDO (1974) relatou que, a partir de cachos de bananas provenientes de plantas pulverizadas com benomyl, foram obtidos três isolados de Colletotrichum musae que diferiram de outras estirpes do fungo em diversas características, incluindo resistência ao benomyl. Esse último autor obteve uma raça de Erysiphe graminis com resistência ao benomyl e que causava até 99 % de infecção em plantas previamente regadas com uma solução de 1000 µg / mL do fungicida. BALARDINI & RODRIGUES (1995), ao testarem fungicidas sistêmicos e protetores, detectaram que o benomyl foi o que causou maior efeito inibidor em C. lindemuthianum; ponderaram, contudo, que essa alta inibição poderia implicar maior pressão de seleção, acarretando o incremento populacional de isolados adaptados. Outros autores, como DELP (1980) e GEORGOPOULOS & DOVAS (1973), apresentaram evidências de que fungicidas sistêmicos como o benomyl, são capazes de induzir adaptação em diversos fungos fitopatogênicos. Segundo DELP (1980), os problemas de resistência de fungos ao grupo dos benzimidazoles intensificaram-se, não somente devido ao uso indiscriminado desses produtos nas lavouras, mas também pelo fato de eles atuarem em um sítio específico de metabolismo dos patógenos e, ainda, porquê a maioria deles já contava com estirpes resistentes em suas populações originais.
Comparando-se as médias de crescimento micelial dos isolados de C. gloeosporioides in vitro, agrupados em relação aos hospedeiros de origem, verificou-se que os isolados de pimentão apresentam crescimento mais lento que os restantes, mesmo na ausência do benomyl.
Os resultados aqui relatados, além de demonstrar variação de populações de C. gloeosporioides patogênicas a solanáceas, em relação à sensibilidade ao benomyl, sinalizam para outros aspectos práticos quanto à diagnose e ao controle do agente da antracnose. Assim, para recomendações sobre o uso de fungicidas fica evidenciada a dependência do conhecimento prévio da existência e predominância de estirpes resistentes em cada região e ano de cultivo.
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