Ensaio HET-CAM para avaliação de colírio a base da casca e polpa de pequi (Caryocar brasiliense): estudo preliminar

Resumo

Afecções oftálmicas de origem infecciosa ou inflamatória podem frequentemente acometer animais de companhia. Neste sentido, pesquisas referentes ao Caryocar brasiliense vêm apresentando benefícios como ação antibiótica, antioxidante, antifúngica e anti-inflamatória e, diante disso, é esperado que possa ser benéfico para o tratamento de oftalmopatias. Objetivouse nessa pesquisa desenvolver soluções dos extratos da casca e polpa do pequi e, em seguida, realizar testes pré-clínicos para avaliar o potencial irritante por meio do ensaio HET-CAM, por meio do aparecimento de lesões vasculares, simulando a conjuntiva ocular. Para isso, foram utilizados 56 ovos embrionados de galinha, submetidos a soluções do extrato etanólico da casca (EEC) e do extrato hexânico polpa (HEP), nas concentrações denominadas colírio da casca (CC) e colírio da polpa (CP) a CC0,1%, CC0,2%, CC0,25%, CC1% e CC2,5% e CP1%, CP1,5%, CP2%, CP10% e CP20%, além dos controles negativos, utilizando Tween a 0,5% e 1% e NaCl. O controle positivo foi realizado com NaOH 0,1 N, onde reações de hemorragia, hiperemia e coagulação foram observadas. O modelo de regressão que melhor se ajustou aos dados foi o polinomial de segunda ordem, apresentando o valor ideal para CP de 0,18% e para CC de 0,24%. Os benefícios terapêuticos do Caryocar brasiliense, juntamente ao baixo potencial de irritação das soluções testadas, indicam um uso promissor para oftalmopatias.

Palavras-chave:
teste alternativo; ovo embrionado; oftalmologia; irritação ocular.

Abstract

Ophthalmic disorders of infectious or inflammatory origin can often affect companion animals. In this context, research related to Caryocar brasiliense has shown benefits such as antibiotic, antioxidant, antifungal, and anti-inflammatory action, and it is expected to be beneficial for ophthalmopathy treatment. This research aimed to develop solutions of pequi peel and pulp extracts and then perform preclinical tests to assess the irritating potential using the HET-CAM test through the appearance of vascular lesions, simulating the ocular conjunctiva. For this purpose, 56 embryonated chicken eggs were subjected to solutions of ethanol extract of peel (EEP) and hexane extract of pulp (HEP) at concentrations of 0.1, 0.2, 0.,25, 1.0, and 2.5% for eyedrops of peel (EPe) and 1.0, 1.5, 2.,0, 10.0, and 20.0% for eyedrops of pulp (EPu), in addition to negative controls, consisting of Tween at 0.5 and 1.0% and NaCl. The positive control was performed with 0.1 N NaOH, and bleeding, hyperemia, and coagulation reactions were observed. The second-order polynomial was the regression model that best fitted the data, presenting the ideal value for EPu of 0.18% and EPe of 0.24%. The therapeutic benefits of C. brasiliense and the low potential for irritation of the tested solutions indicated a promising use for ophthalmopathies.

Keywords:
alternative test; embryonated egg; ophthalmology; eye irritation.

1. Introdução

O pequi, fruto do C. brasiliense é envolvido por uma casca de característica lenhosa, rica em fibras, carboidratos, magnésio, cálcio e cobre. Pode conter até quatro sementes volumosas, com amêndoas grandes e carnosas, contendo espinhos agudos em seu interior (¹). Sua polpa é composta por ácidos graxos insaturados, como o linoleico (²) que papel importante no processo de cicatrização, aumentando a síntese de colágeno e fornecendo ao tecido maior força tênsil (³), além de atenuar o processo inflamatório no período de reparo tecidual (⁴).

Sendo rica também em carotenoides como anteraxantina, criptoflavina, zeaxantina, β-criptoxantina, ζ-caroteno, β-caroteno e mutatoxantina, que possuem ação antioxidante, além de serem precursores de vitamina A (⁵), que é conhecida por regular a diferenciação e proliferação das células epiteliais da córnea, atuando também na preservação das células caliciformes da conjuntiva e por isso vem sendo utilizada no tratamento de doenças oftálmicas como a ceratoconjuntivite seca (⁶,⁷). Não foram encontrados estudos sobre os efeitos do extrato da casca ou da polpa do C. brasiliense sobre a superfície ocular, contudo um estudo in vitro apontou que o extrato alcoólico da casca apresenta potencial antimicrobiano frente a Staphylococcus pseudintermedius resistentes a meticilina isoladas da superfície ocular de cães com oftalmopatias(⁸).

O tratamento dessas afecções oftálmicas geralmente é realizado com utilização de medicamentos tópicos e sistêmicos, contudo essa última via apresenta dificuldade na perfusão dos fármacos sobre os tecidos oculares, devido às barreiras biológicas, necessitando, portanto, de maiores doses que pode causar efeitos adversos sistêmicos e oculares (⁹). Tem sido cada vez maior a busca de ativos naturais visando uma diminuição dos efeitos colaterais causados pelos medicamentos sintéticos (¹⁰). Para que tais ativos sejam utilizados como solução oftálmica é necessário que sejam feitos testes toxicológicos, devido ao fato de que as estruturas externas oculares são delicadas, como a córnea, conjuntiva e a íris, que podem sofrer injúrias químicas proveniente dos princípios ativos, bem como dos excipientes presentes nas soluções oftálmicas (¹¹).

O teste de irritação ocular geralmente utilizado é o teste de Draize, que consiste na instilação de substâncias testes na superfície ocular de coelhos albinos em dose única, visando observar o grau de irritação e inflamação (¹²). Contudo, devido ao sofrimento que os animais modelos são submetidos, tem-se buscado métodos alternativos in vitro, seguindo o conceito dos 3 Rs (reduzir, substituir e refinar) para o uso de animais como modelo de experimentação, buscando obter-se os mesmos parâmetros in vivo (¹³,¹⁴). No Brasil, atualmente é proibido o uso de animais em pesquisas para desenvolvimento de produtos de higiene, cosméticos e perfumes (¹⁵). Entre os métodos alternativos de irritação ocular se destacam o HET-CAM (Hen’s Egg Test - Chorioallantoic Membrane) que possibilita uma avaliação do potencial irritante por meio de lesões vasculares, simulando a conjuntiva ocular (¹⁶,¹⁷,¹⁸).

Tendo em vista os benefícios medicinais das propriedades do C. brasiliense, com ações anti-inflamatórias, antimicrobianas e proliferativas das células da córnea, espera-se que tais compostos possam ser promissores como adjuvantes no tratamento de doenças oculares em animais de companhia, na forma de colírio. Esta pesquisa tem como objetivo formular soluções da polpa e casca de pequi em diferentes concentrações para uso oftálmico futuro, iniciando os testes pré-clínicos necessários através do teste HET-CAM, com o intuito de identificar concentrações ideais que não causem irritação.

2. Material e métodos

2.1 Obtenção do extrato

Os frutos de C. brasiliense foram adquiridos in natura de um comércio local da cidade de Jataí, Goiás, colhidos de lote único, provenientes de perímetro rural e enviados para o laboratório de química da universidade federal de Jataí (UFJ). As cascas e polpas foram separadas e fatiadas a cada material vegetal sofreu adição de solvente orgânico de acordo com sua polaridade, sendo para casca o álcool 92,8% e hexano para a polpa. Após adição dos solventes, as diferentes partes do C. brasiliense, permaneceram em percolamento por 7 dias, tendo o volume de solvente evaporado e reposto subsequentemente nesse período. Em seguida os solventes foram separados em rotaevaporador e os extratos oriundos da separação foram mantidos em banho maria até atingirem peso constante, garantindo total eliminação de solventes do meio.

O extrato hexânico da polpa (HEP), foi fracionado em concentrações distintas denominadas Colírio da polpa (CP) nas concentrações 1,0%, 1,5% e 2%, diluídas em Tween 80 (Tween 80 -Labsynth) a 0,5%. Também foram formulados CP nas concentrações de 10% e 20% diluídas em tween a 1%. Para obtenção das concentrações de 0,5% e 1%, o Tween 80 foi diluído em solução fisiológica (Solução Fisiológica NaCl 0,9% 250 mL - Medflex), homogeneizadas por agitação no vortéx por 15 minutos em temperatura ambiente. Já o extrato etanólico da casca (EEC) fracionado em cinco concentrações, denominadas colírio da casca (CC): 0,1%, 0,2%, 0,25%, 1% e 2,5%, diluídas em solução fisiológica (NaCl a 0,9%), após agitação em vórtex por 15 minutos.

Para mimetização de futuros colírios as soluções da casca foram diluídas em cloreto de sódio a 0,9%, tendo em vista sua osmoloridade (290 mOsm), próxima do fluido lacrimal de cães (337.4±16.2 mOsm) (¹⁹). Já o pH das soluções foi reajustado em 7,2, adicionando-se ácido clorídrico (quando necessária a diminuição do pH) ou hidróxido de sódio (quando necessário o aumento do pH), visando neutralizá-lo, substâncias já utilizadas em colírios comerciais, mantendo-o próximo do pH 7,0, valor médio do pH lacrimal de cães (²⁰).

2.2 Ensaio experimental

O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) sob o N° 013/19. Para os testes, foram utilizados 56 ovos de galinha fecundados de linhagem Cobb, com dois dias de idade, obtidos de matrizes de galinhas com 34 a 35 dias de idade, doados pela empresa São Salvador Alimentos (Itaberaí, Goiás, Brasil). Após a recepção, os ovos foram mantidos em temperatura ambiente controlada de 24° C por 24 horas, em sala escura e silenciosa. Em seguida, os ovos foram colocados em incubadora digital, modelo RcomPR50, com temperatura de 37,5°C e umidade entre 50% e 60%. Foi programada a função de rotação automática para uma rolagem a cada 60 minutos, até o oitavo dia de incubação e interrompida no nono dia para a realização do HET-CAM. Durante esse período, as condições necessárias para incubação citadas anteriormente foram monitoradas diariamente e ajustadas conforme necessário, sendo a viabilidade dos embriões monitoradas com ovoscopia.

O teste HET-CAM foi realizado utilizando ovos de galinha embrionados de acordo com o protocolo de Luepke e Kemper (¹⁶), ao nono dia de incubação, distribuídos aleatoriamente em 14 grupos de quatro ovos, onde cada grupo foi testado com uma solução distinta, sendo elas denominadas (CP) a CP 1,0%, CP 1,5%, CP2%, CP10%, CP20%. Bem como CC 0,1%, CC 0,2%, CC 0,25%, CC 1% e CC 2,5%, diluídas em solução fisiológica. Como controles negativos foram utilizadas duas concentrações de polissorbato 80 a 0,5% (CN0,5%) e 1% (CN1%), bem como NaCL (CN0,9%). E como controle positivo foi utilizado NaOH 0,1 N (CPNaOH).

Cada ovo foi cuidadosamente higienizado com solução fisiológica aquecida a 37°C no momento da retirada da incubadora, seguida da perfuração da casca com uma agulha lanceolada e remoção com o auxílio de uma pinça anatômica na região câmara de ar até exposição da CAM. Os ovos foram aleatoriamente selecionados para cada grupo, recebendo 0,2 ml da solução correspondente ao grupo sorteado, instilado cuidadosamente sobre a CAM, com auxílio de pipetador. A membrana foi exposta durante 20 segundos a substância teste, e posteriormente instilou-se 10 ml de solução fisiológica aquecida 25°C para remoção da solução instilada. Posteriormente foi observado e registrado a ausência e presença de fenômenos de irritação subsequentes por um total de cinco minutos a partir da instilação da solução teste.

Todos os eventos foram filmados com auxílio de dispositivo digital Apple-Iphone 12, possibilitando observar e revisar a presença ou ausência dos seguintes fenômenos: hiperemia (aumento do fluxo sanguíneo), hemorragia (extravasamento de sangue dos vasos sanguíneos) e de coagulação (opacidade da CAM ou de coagulação nos vasos). Ao final de cada teste, cada ovo embrionado foi submetido imediatamente à eutanásia por meio de resfriamento rápido à -20°C. A avaliação do potencial irritante foi feita com base no aparecimento dos fenômenos de irritação em intervalos de 0,5 minuto, 2 e 5 minutos (¹⁶).

2.3 Análise dos dados

Os fenômenos de hiperemia (Hip), hemorragia (Hem) e coagulação (Coag) foram registrados, quando presentes. Cada concentração, bem como os controles foram analisados em quadruplicata. O tempo dos eventos foi registrado em minutos, conforme a tabela 1. Para o cálculo do escore de irritação (mean score - MSc) obtendo-se um valor numérico único, possibilitando observar a capacidade de irritação da solução testada, em uma escala comum que varia de 0 a 21 (Tabela 2). Foram testados modelos de regressão linear e quadrático utilizando o Software Graphpad Prism 6. O modelo de regressão quadrático foi expresso pela seguinte equação:

Tabela 1
Tabela utilizada para identificar as pontuações das lesões apresentadas nas CAM, durante a avaliação (hiperemia, hemorragia e coagulação) de acordo com o tempo de aparecimento (0,5 minutos; 2 minutos e 5 minutos) segundo Luepk e Kemper (¹⁷).

Efeitos		Pontuação
	0,5 min (30s)	2 min (120 s)	5 min (300 s)
Hiperemia	5	3	1
Hemorragia	7	5	3
Coagulação	9	7	5

Tabela 2
Categoria de irritação mediante a faixa de pontuação obtida da média de pontos de cada grupo segundo Luepk e Kemper (¹⁷).

Faixa de pontuação	Categoria de irritação
0 a 0,9	Não irritante
1 a 4,9	Levemente irritante
5 a 8,9	Irritação moderada
9 a 21	Irritação severa

$Y=\beta 0+\beta 1X+\beta 2X2+ϵ$

Em que:

Y é a variável dependente; X é a variável independente; β0, β1 e β2 são os coeficientes do modelo; X2 é o termo quadrático que captura a curvatura da relação; ϵ é o termo de erro que representa a variação não explicada pelo modelo.

Já o modelo de regressão linear foi descrito pela equação:

$Y=\beta 0+\beta 1X+ϵ$

Em que:

Y é a variável dependente; X é a variável independente; β0 é o intercepto, ou constante, que representa o valor esperado de Y quando X=0; β1 é o coeficiente de regressão para X, que representa a mudança esperada em Y para cada unidade de mudança em X.

3. Resultados

As concentrações do CP apresentaram coloração amarelo citrino, ligeiramente turvo, necessitando de agitação em vórtex por um período de 15 minutos para homogeneização. Contudo, ainda se notava uma discreta separação de fases, sendo a de coloração mais amarelada como sobrenadante, porém se tornava homogênea com agitação manual, sem presença de odor. Já as concentrações do CC, apresentaram coloração âmbar claríssimo, sem sobrenadante ou decantação e inodoro, posterior a agitação em vórtex, por 15 minutos para homogeneização. O pH de todas as soluções foi ajustado para 7,2, buscando proximidade com o pH lacrimal.

No grupo de CPNaOH, foram verificadas as alterações de hemorragia e hiperemia logo após a instilação da solução de NaOH em todos os ovos e coagulação em apenas um ovo. Tais alterações persistiram por todo o período do teste, obtendo-se graduação 14,25, classificado, definido como irritante severo. No CN0, 5% foram verificado hiperemia em apenas um ovo aos 5 minutos e no CN1% foi observado hemorragia aos 5 minutos, obtendo graduação de 0,25 e 0,75 respectivamente, sendo ambas concentrações de Tween 80 utilizadas pra diluição dos CP classificadas como não irritantes.

As concentrações de CC, causaram na CAM hiperemia após 2 minutos de instilação com CC0,1%, CC0,2% e CC0,25%, sendo em dois, um e três ovos respectivamente, tendo a graduação entre 0 e 0,9 na escala HET-CAM, considerados como não irritantes. Já o CC1%, causou hiperemia aos 2 minutos em um ovo, e aos cinco minutos em outro, graduando 1 na escala HET-CAM. Após a instilação do CC2,5%, observou-se hemorragia apenas aos 5 minutos, em dois ovos, graduando 1,5 na escala HET-CAM, sendo ambas consideradas irritantes leves.

Nos grupos dos CP, a CAM apresentou hiperemia após dois minutos com instilação do CP1% em dois ovos; CP1,5% em um ovo e CP2,5% em dois ovos, obtendo graduações entre 0 e 0,9 na escala HET-CAM, sendo considerados não irritantes. Ao se instilar CP10% foi observado hiperemia aos dois minutos em um ovo, bem como hemorragia, seguida de hiperemia aos cinco minutos em outro ovo, graduando 2,25 na escala HET-CAM. No CP20%, foi observado o fenômeno de coagulação aos dois minutos em apenas um ovo, sendo também observado hemorragia aos dois minutos, em outros dois ovos, graduando 4,2 na escala HETCAM, sendo tais concentrações consideradas irritantes leves (Tabela 3).

Tabela 3
Diferentes concentrações da casca e da polpa de C. brasiliense testadas no experimento com seus respectivos escores de irritação e classificação do grau de irritação segundo o HET-CAM.

Soluções	Escore de irritação (MSc)	Classificação
CPNaoH	14,25	IS
CN0,5%	0,25	NI
CN 1%	0,75	NI
CN0,9%	0	NI
CP1%	0,5	NI
CP1,5%	0,25	NI
CP2%	0,5	NI
CP10%	2,25	LI
CP20%	4,25	LI
CC0,1%	0,5	NI
CC0,2%	0,25	NI
CC0,25%	0,75	NI
CC1%	1	LI
CC2,5%	1,5	LI

Segundo os resultados, quanto maior a concentração, maior será seu potencial irritante (Fig. 1 e 2).

Figura 1
Potencial irritante das diferentes concentrações do Colírios da casca (CC) do C. brasiliense e o controle negativo (CN0,9%): NaCL e o Controle positivo CPNaOH: NaOH.

Figura 2
Potencial irritante das diferentes concentrações testadas do Colírio da polpa (CP) do C. brasiliense e os controles negativos: CN1% (Tween a 1%) e CN0,5% (Tween a 1%) e o controle positivo CPNaOH (NaOH).

Resultados em imagens de ovos dos grupos controles negativos e positivo apresentando ausência ou presença de fenômenos de irritação, fotografadas aos 5 minutos (Fig. 3).

Figura 3
A: Ovo do grupo tratado com CN0,9 sem alterações de irritação. B: Ovo do grupo tratado com CN0,5% apresentando hiperemia em seta preta. C: Ovo do grupo tratado com CN1% apresentando hemorragia em seta azul. D: Ovo do grupo tratado com CPNaOH apresentando hemorragia em seta azul e coagulação em seta verde (Trombo no vaso sanguíneo).

Resultados em imagens de ovos tratados com HEP e EE em diferentes concentrações apresentando fenômenos de irritação, fotografadas aos 5 minutos (Fig. 4)

Figura 4
A: Ovo do grupo tratado com CP1% apresentando hiperemia em seta preta. B: Ovo do grupo tratado com CP1,5% apresentado hiperemia em seta preta. C: Ovo do grupo tratado com CP2% apresentando hiperemia em seta preta. D: Ovo do grupo tratado com CP10% apresentando hemorragia em seta azul e hiperemia em seta preta. E: Ovo do grupo tratado com CP20% apresentando coagulação em seta verde. F: Ovo do grupo tratado com CC0,1% apresentando hiperemia em seta preta. G: Ovo do grupo tratado com CC0,2% apresentando hiperemia em seta preta. H: Ovo do grupo tratado com CC0,25% apresentando hiperemia em seta preta. I: Ovo do grupo tratado com CC1% apresentando hiperemia em seta preta. J: Ovo do grupo tratado com CC2,5% apresentando hemorragia em seta azul.

Para determinação da dose com menor potencial de irritação, o modelo de regressão que melhor se ajustou aos dados foi o polinomial de segunda ordem, representado pela equação Y=0,09739+0,2178x-0,0004972x², R²=0,9944, valor de X=0,18 para CP e CC representado pela equação Y=0,3612+07720x-0,1267x² e R² =0,8774 e valor de X=0,24. O modelo linear apresentou R² = 0,9942 e equação Y=0,2077x+0,1172 para CP e enquanto CC apresentou equação Y=0,4403x+0,4433 e R² = 0,8557 representados em gráfico na figura 5 (Fig. 5).

Figura 5
Potencial irritante de ovos de galinha embrionados testados com Colírio da casca (CC) em gráfico A e gráfico B testados com Colírio da polpa (CP), sendo que as linhas tracejadas demonstram os comportamentos de modelo quadrático e a linha contínua comportamento de modelo linear. A variável independente (X) é a dose administrada, enquanto a variável dependente (Y) é a resposta observada.

4. Discussão

É descrito na literatura que os principais constituintes do extrato de C. brasiliense são compostos químicos que apresentam ação antimicrobiana como, por exemplo, os flavonoides que podem interagir com a membrana citoplasmática, inibindo sua função e comprometendo a integridade celular, podendo também inibir a síntese de ácidos nucléicos, interrompendo o metabolismo bacteriano (²¹), bem como os terpenóides que possuem características lipofílicas que afetam a estabilidade da membrana citoplasmática das bactérias, levando à perda de enzimas e nutrientes celulares (²²).

Os componentes antibióticos presentes no extrato de C. brasiliense possuem potencial terapêutico significativo, especialmente nas concentrações de CC1% e CC2,5%, dosagens consideravelmente superiores às utilizadas na presente investigação. Tais concentrações podem ser eficazes no manejo de afecções oftálmicas bacterianas em animais de companhia, incluindo ceratite ulcerativa, uveíte e ceratoconjuntivite seca. A literatura sustenta essa hipótese; estudos prévios revelaram que o extrato da casca de C. brasiliense a 2,2% exibe atividade antibiótica substancial contra Staphylococcus spp. resistentes à meticilina, uma cepa isolada da superfície ocular de cães acometidos por tais oftalmopatias (⁸). Em contraste, o mesmo estudo constatou a ausência de atividade antibiótica do extrato da polpa contra as mesmas bactérias em concentrações inferiores a 25%. Este achado sugere que o extrato da polpa, nas concentrações empregadas neste trabalho, pode não proporcionar a eficácia desejada para fins terapêuticos. Consequentemente, estes resultados sublinham a relevância de uma criteriosa seleção das concentrações e componentes do extrato de C. brasiliense, visando otimizar a eficácia terapêutica contra cepas bacterianas resistentes, o que pode ter implicações importantes na medicina veterinária e no desenvolvimento de novas estratégias de tratamento.

Tendo em vista que não foram encontrados estudos acerca da toxicidade tópica com uso de extratos de pequi, as substâncias testadas foram diluídas em concentrações menores, levando em consideração a alta presença de taninos e flavonoides, substâncias xenobióticas que podem produzir metabólicos tóxicos ao organismo (²³). Para tanto o HEP foi diluído em Tween 80, agindo como demulcente facilitando a solubilidade dos componentes lipídicos (²⁴), que por sua vez foi diluído previamente em cloreto de sódio a 0,9% (NaCl). O EE também foi diluído em NaCl, sendo utilizado como diluente visando a mimetização de um colírio veterinário, tendo em vista sua osmoloridade (290 mOsm) é próxima do fluido lacrimal de cães (337.4±16.2 mOsm) (¹⁹). Os veículos (Tween e NaCl), apontaram segurança, visto que foram testados nos grupos de controles negativos, sendo classificados como não irritantes ao HETCAM no presente estudo.

Com o intuito de não gerar irritação, foram utilizados excipientes tampões comumente utilizados na formulação de colírios, para neutralizar o pH para 7,2, sendo eles ácido clorídrico (quando necessária a diminuição do pH) ou hidróxido de sódio (quando necessário o aumento do pH), levando em consideração que em cães o pH da lágrima pode variar entre 6,0 e 8,0, com média 7,0 (²⁰).

O aparecimento dos fenômenos vasculares nos grupos testados com CP10% e CP20%, bem como da casca a 1 e 2,5%, classificando tais concentrações como potenciais irritantes ao olho, não descartam a utilização dessas substâncias in vivo, uma vez que poderão ainda ser verificadas por meio de outros testes, tais como o CAM-TBS (Chorionallantoic membrane - trypan blue staining) que tem a metodologia inicial a do HET-CAM, contudo se é aplicado azul trypan após instilação da substância teste, possibilitando a avaliação de danos a CAM através da quantidade de corante absorvido, sendo possível identificar falsos positivos no HET-CAM, uma vez que o mesmo tende a superestimar as reações vasculares (¹⁷). Contudo, as concentrações testadas nesse estudo que se apresentaram não irritantes não precisarão ser testadas em animais, haja vista que apresentarão efeitos semelhantes ao do HET-CAM, não gerando irritação in vivo.

Segundo o teste de irritação HET-CAM, observou-se que as soluções com menores concentrações foram aquelas com menor potencial irritante, indicando relação entre concentração e potencial irritante, o que pode ser observado em testes com outros extratos de plantas. Como no estudo realizado com Cantua buxifolia juss, que apresentou categoria não irritante na escala HET-CAM com as concentrações 0,1%, 0,2% e 0,3% (²⁵). Mesmo havendo uma carência de estudos utilizando C. brasiliense para tratamentos oftálmicos, o uso de fitoterápicos em oftalmologia tem se mostrado próspero. Soluções a partir de Citrus limon (²⁶), Copaifera multijuga (²⁷), Aloe vera (²⁸) e Ottonia martiana (²⁹) já foram testadas visando seu uso na terapêutica frente à oftalmopatias apresentando resultados promissores, provando que o uso terapêutico de vegetais em oftalmologia pode ser benéfico.

Os modelos de regressão são utilizados em ensaios de dose resposta no uso de fármacos (³⁰). Segundo o modelo que apresentou o melhor ajuste (polinomial de segunda ordem), as doses que apresentaram menor potencial de irritação foram de 0,18% para HEP e 0,23% para EE. Um modelo de regressão é uma ferramenta estatística poderosa para analisar ensaios de dose-resposta, onde a relação entre diferentes doses de um produto (como um fármaco ou um nutriente) e a resposta observada em um organismo é avaliada. Este trabalho trata de um ensaio de dose-resposta, o objetivo é entender como diferentes doses dos produtos avaliados afetaram o potencial de irritação (³¹). Em um ensaio de dose-resposta, a relação entre a dose e a resposta nem sempre é linear. Um aumento inicial na dose pode levar a um aumento proporcional na resposta até certo ponto, após o qual a resposta pode estabilizar ou até mesmo diminuir, indicando uma relação mais complexa (³²), como o observado neste estudo.

5. Conclusão

As concentrações de 0,18% e 0,24% indicam baixo potencial irritante para as soluções de colírio da polpa e colírio da casca, respectivamente. Este trabalho abre caminho para pesquisas in vivo sobre o uso oftálmico dos extratos de C. brasiliense com essas concentrações em animais com oftalmopatias, agregando valor medicinal à espécie e promovendo o aproveitamento de resíduos da casca, reduzindo seu impacto ambiental.

Declaração de disponibilidade de dados

Os dados serão fornecidos mediante solicitação ao autor correspondente.

Material suplementar

Resumo gráfico (disponível apenas na versão eletrônica).

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• Editor: Luiz Augusto B. Brito

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Ago 2025
• Data do Fascículo
  2025

Histórico

• Recebido
  19 Maio 2024
• Aceito
  10 Set 2024
• Publicado
  27 Mar 2025