Relação entre a patogenicidade do Schistoma mansoni em camundongos e a susceptibilidade do molusco vetor: II. Número de ovos nas fezes e número e tamanho dos granulomas nas vísceras

Relationship between the pathogenicity of Schistoma mansoni in mice and the susceptibility of the vector mollusc: II. Number of eggs in the feces and number and size of granulomas in the visceras

Relação entre a patogenicidade do Schistoma mansoni em camundongos e a susceptibilidade do molusco vetor. II. Número de ovos nas fezes e número e tamanho dos granulomas nas vísceras^*

Relationship between the pathogenicity of Schistoma mansoni in mice and the susceptibility of the vector mollusc. II. Number of eggs in the feces and number and size of granulomas in the visceras

Eliana Maria Zanotti-Magalhães^I; Luiz Augusto Magalhães^I; José Ferreira de Carvalho^II

^IDepartamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas - Campinas, SP - Brasil

^IIDepartamento de Estatística do Instituto de Matemática, Estatística e Ciências da Computação da Universidade Estadual de Campinas - Campinas, SP - Brasil

RESUMO

Estudou-se a influência da susceptibilidade de moluscos vetores do S. mansoni no desenvolvimento da patogenicidade do trematódeo no hospedeiro definitivo. Foram utilizadas progênies de moluscos Biomphalaria tenagophila e Biomphalaria glabrata selecionadas para o caráter susceptibilidade ao S. mansoni das linhagens SJ e BH, respectivamente. Cercárias oriundas das gerações P, F₁ F₂, F₃ e F₄ foram usadas para a infecção de camundongos Swiss, que foram sacrificados oito semanas após a exposição às larvas. Por esta ocasião verificou-se o número de ovos nas fezes e o número de granulomas no fígado, baço e intestino. Avaliou-se também o tamanho das reações granulomatosas nestas vísceras. Concluiu-se que a maior susceptibilidade de B. tenagophila induziu a uma maior eliminação de ovos do parasita nas fezes. Verificou-se maior número de granulomas por área de tecido hepático em roedores infectados com cercárias oriundas de moluscos mais susceptíveis. Nos mesmos roedores, constatou-se relação inversa entre a área dos granulomas esplênicos, hepáticos e intestinais e a taxa de infecção dos moluscos que forneceram as cercárias para a infecção dos camundongos.

Descritores: Schistosoma mansoni, patogenicidade. Biomphalaria, parasitologia. Contagem de ovos de parasitas, utilidade. Granuloma. Parasitologia.

ABSTRACT

The influence of the susceptibility of the vector snails of S. mansoni on the development of the pathogenicity of the worm to the host was studied. Off-spring of snails Biomphalaria glabrata and Biomphalaria tenagophila were used, selected with regard to the susceptibility to S. mansoni of the strains BH and SJ trait, respectively. Parenteral, F₁,F₂, F₃ and F₄ generation cercariae were used for the infection of Swiss mice, which were killed eight weeks after infection. The number of eggs in the feces and the number of granulomas in the liver, spleen and intestines were counted. The size of the granulomatous reactions was evaluated. The results led to the conclusion that greater susceptibility of B. tenagophila was associated with a larger egg production in the feces and a higher density of granulomas in the liver. There is a clear inverse relationship between the area of hepatic, spleenic and intestinal granulomas and the rate of infection of the snails which served as intermediate hosts for the S. mansoni.

Keywords: Schistosoma mansoni, pathogenicity. Biomphalaria, parasitology. Parasite egg count, utilization. Granuloma, parasitology.

Introdução

Paraense & Correa^25,26,27 (1963, 1978), estudando populações de Biomphalaria glabrata e Biomphalaria tenagophila expostas ao S. mansoni de várias localidades, verificaram diferentes graus de susceptibilidade entre as populações e o parasita. Esses autores descreveram em 1963²⁶ a existência no Brasil de duas linhagens do trematódeo: a linhagem SJ, oriunda do Vale do Rio Paraíba (SP) e mantida em populações locais de B. tenagophila; e a linhagem BH, originada em Belo Horizonte (BH) e mantida em populações simpátricas de B. glabrata. Ambas as espécies de moluscos mostraram-se refratárias à infecção pelo S. mansoni alopátrico, sugerindo adaptação fisiológica entre o molusco e a linhagem local do parasita.

A susceptibilidade à infecção pelo S. mansoni é um caráter genético e hereditário apresentado por B. glabrata e B. tenagophila (Newton²⁴, 1953; Richards^30,32, 1970, 1977; Richards & Merrill³¹, 1972; Santana e col.³⁴, 1978).

A resistência dos moluscos à infecção pelo S. mansoni manifesta-se pela intensa reação amebocitária em torno dos esporocistos, levando-os à morte, enquanto que em moluscos susceptíveis, a reação e branda e os esporocistos permanecem em sua maioria viáveis (Newton²³, 1952; Coelho⁹, 1962; Guaraldo e col.¹⁴, 1981).

Se a relação entre o caramujo e o parasita é aspecto de interesse para a epidemiologia da esquistossomose, é de interesse também, a relação do parasita com seu hospedeiro definitivo, principalmente se forem considerados os elementos que determinam a patogenicidade do parasita e seu modo de propagação. No caso da esquistossomose mansônica, ao ovo do parasita 6 atribuído o principal papel patogênico além de ser responsável pela disseminação da espécie.

Em torno dos ovos de S. mansoni, não eliminados com as fezes do hospedeiro vertebrado, há formação de intensa reação inflamatória (granuloma) de caráter imune.

Magalhães e col.²¹ (1975), estudando as linhagens BH e SJ do S. mansoni em camundongos, verificaram maior número de granulomas hepáticos por verme na linhagem BH, se comparada com a linhagem SJ. Nas áreas endêmicas dominadas pela linhagem BH observam-se indivíduos com esquistossomose hepatosplênica descompensada, enquanto que, nas áreas abrangidas pela linhagem SJ, o quadro clínico na quase totalidade dos casos, é assintomático (Dias e col.¹¹, 1988), sendo raros os casos de hepatosplenomegalia compensada (Santos³³,1967; Lima¹⁹,1991). Apesar da baixa infectividade apresentada por B. tenagophila, esta espécie tem sido responsável pela manutenção e expansão da esquistossomose mansônica para o sul do Brasil.

O objetivo do presente trabalho foi verificar a relação entre a maior facilidade com que o parasita se desenvolve no molusco e o grau de patogenicidade apresentado pelo trematódeo no hospedeiro definitivo. Nesta segunda fase de apresentação dos resultados abordou-se a susceptibilidade de B. glabrata e B. tenagophila e o número e tamanho dos granulomas nas vísceras e o número de ovos eliminados com as fezes dos camundongos.

Material e Método

Animais Utilizados

a) Moluscos vetores

Moluscos com diferentes graus de susceptibilidade foram obtidos por autofecundação dos moluscos susceptíveis. Foram utilizados espécimes de B. glabrata e B. tenagophila expostos, respectivamente, às linhagens BH e SJ.

Foram obtidas cinco progenies de B. glabrata (P, F₁ , F₂, F₃ e F₄) e de B. tenagophila (P, F₁, F₂, F₃ e F₄), que foram expostas a dez miracídios de S. mansoni. As cercárias eliminadas pelos moluscos foram utilizadas na infecção de camundongos.

Os planorbídeos foram observados por seis meses para a determinação da susceptibilidade.

Maiores detalhes sobre a seleção dos moluscos e obtenção das cercárias podem ser obtidos no trabalho anterior (Zanotti-Magalhães e col.³⁷,1991).

b) Hospedeiros definitivos

Camundongos Swiss, SPF, albinos, provenientes do Biotério Central da UNICAMP, foram usados como hospedeiros definitivos.

Cercárias oriundas das gerações P, F₁, F₂, F₃ e F₄ de B. glabrata e B. tenagophila, respectivamente, foram utilizadas para infecção dos camundongos.

A especificação completa dos grupos formados foi a seguinte:

Camundongos infectados com a linhagem BH:

- 20 camundongos infectados com cercárias da geração parental (BHP).

- 19 camundongos infectados com cercárias da geração F₁ (BHF₁).

- 20 camundongos infectados com cercárias da geração F₂ (BHF₂).

- 27 camundongos infectados com cercárias da geração F₃ (BHF₃).

- 25 camundongos infectados com cercárias da geração F₄ (BHF₄).

Camundongos infectados com a linhagem SJ

- 14 camundongos infectados com cercárias da geração parental (SJP).

- 18 camundongos infectados com cercárias da geração F₁ (SJF₁).

- 19 camundongos infectados com cercárias da geração F₂ (SJF₂).

- 18 camundongos infectados com cercárias da geração F₃ (SJF₃).

- 10 camundongos infectados com cercárias da geração F₄ (SJF₄).

Os subgrupos de camundongos foram constituídos à medida que as cercárias foram sendo eliminadas pelos caramujos.

Infecção dos Camundongos

Cercárias foram obtidas após a exposição dos moluscos infectados, à luz e ao calor de 28°C.

Os camundongos foram infectados percutaneamente, pela cauda, por cem cercárias, seguindo técnica de Magalhães²⁰ (1969).

Após oito semanas de infecção, os roedores sobreviventes foram sacrificados por deslocamento cervical, realizando-se a perfusão do sistema porta hepático (Yolles e col.³⁶,1947).

Obtenção e Contagem de Granulomas Hepáticos

Posteriormente à perfusão, o fígado dos animais foi homogeneizado em liquidificador, para determinação do número de granulomas totais, segundo técnica de Pellegrino & Brener²⁸ (1956).

Além disso, um fragmento da víscera foi fixado em Bouin, a fim de se determinar o número de reações granulomatosas por área de corte histológico de 7 mm de espessura.

Os granulomas foram observados em microscópio óptico comum. A determinação da área tissular foi realizada de acordo com Magalhães e col.²² (1979).

Obtenção e Contagem de Granulomas Esplênicos e Instestinais

Fragmentos do baço e do colo ascendente foram fixados em Bouin. Cortes histológicos de 7 mm de espessura foram utilizados para a observação de granulomas.

A área de tecido examinado foi determinada conforme especificado no item anterior para o fígado.

Verificação do Tamanho da Reação Granulomatosa

O tamanho da reação granulomatosa em torno do ovo de S. mansoni foi medida para avaliação da atividade celular apresentada pelos roedores infectados.

Através de cortes histológicos e com o auxílio de ocular micrométrica Zeiss, foram medidos os diâmetros maior e menor dos granulomas. Para uma melhor delimitação da reação granulomatosa, os cortes histológicos foram corados com tricrômico de Gomori. Foram medidos todos os granulomas presentes em um corte histológico. Somente foram medidos os granulomas que apresentavam em seu núcleo um ovo de S. mansoni, que comprovava a condição de que o corte estava próximo de seu diâmetro máximo.

Para a análise estatística considerou-se a área dos granulomas presentes no baço, fígado e intestino.

Verificação do Número de Ovos de S. mansoni Eliminados nas Fezes.

Por ocasião da necrópsia, as fezes dos roedores contidas no reto foram coletadas.

O número de ovos presentes na matéria fecal foi verificado pelo método de Kato (Komyia & Kobayashi¹⁶,1966).

Métodos de Análise Estatística

Os camundongos foram aleatoriamente distribuídos pelos 10 grupos descritos, constituindo experimento completamente aleatorizado. Os resultados foram submetidos à análise estatística, baseada nesse esquema experimental. Foram feitas comparações entre os grupos através de procedimentos usuais de análise de variância. Procedeu-se, também, ao estudo dos efeitos de linhagem e de taxa de infecção dos moluscos em cada resposta. A taxa de infecção dos moluscos dá um índice de susceptibilidade, cujo modelo adotado pode ser escrito:

onde L representa o efeito de linhagem, T a taxa de infecção relativa ao animal j na linhagem i e O o efeito da taxa na resposta. O termo e corresponde ao erro experimental. Note-se que este modelo corresponde ao ajuste de uma reta para cada linhagem. O modelo foi verificado através de extensa análise de resíduos e considerado adequado. Com a análise, é possível identificar-se os efeitos (ou diferenças) de linhagens e os devidos à taxa de infecção. Os cálculos foram feitos com o software SAS ^R, em computador compatível com IBM-PC.

Resultados

Os resultados referentes à susceptibilidade das gerações P, F₁, F₂, F₃, e F₄ de B. glabrata e B. tenagophila, expostas à infecção pelas respectivas gerações de S. mansoni, estão apresentados na Tabela 1. Até a geração F₃, observou-se um acentuado aumento da taxa de infecção dos moluscos de ambas espécies.

Na Tabela 2 podem ser observados os resultados referentes ao número de ovos de S. mansoni presentes nas fezes dos camundongos, assim como o número de reações granulomatosas verificadas no baço e no intestino. Na Tabela 5, a análise de variância evidencia o efeito da taxa de infecção dos moluscos e da linhagem do trematódeo sobre o número de ovos e o número de granulomas no baço e no intestino. As Figuras 1, 2 e 3 mostram de maneira mais direta o efeito quantitativo. Considerando o número de ovos nas fezes dos roedores, verificou-se comportamento diferente para as linhagens BH e SJ. Para a linhagem SJ verificou-se um aumento no número de ovos com a maior susceptibilidade de B. tenagophila, enquanto que a maior susceptibilidade de B. glabrata resultou em menor eliminação de ovos pelas fezes.

O número de granulomas por área de tecido esplênico ou intestinal não diferiu significativamente entre as linhagens e com relação ao aumento das taxas de infecção dos moluscos.

Nas Tabelas 3 e ⁶ estão apresentados os resultados relativos ao número de granulomas presentes no fígado, obtido através da liquidificação do órgão (granuloma total) e da determinação por área de corte histológico. Através da análise de variância evidenciou-se aumento no número de reações granulomatosas, por área hepática, em conseqüência da maior susceptibilidade de B. glabrata e B. tenagophila. A Figura 4 permite avaliar melhor este resultado. A liquidificação do fígado indicou diferença significativa no número de lesões no órgão entre as linhagens BH e SJ ( ^{Tabela 6}).

Nas Tabelas 4 e ⁷ e Figuras 5 e 6 estão apresentados os resultados concernentes ao tamanho dos granulomas presentes no baço, fígado e intestino por ocasião da necrópsia dos camundongos. Nessas três vísceras observou-se significativa diminuição no tamanho das lesões granulomatosas decorrentes da maior susceptibilidade dos moluscos nos quais foram produzidas as respectivas cercárias.

Discussão

Conforme foi verificado por Cheever⁵ (1968) e Cheever e col.⁶ (1977), o número de ovos nas fezes, assim como nos tecidos humanos, está linearmente relacionado com o número de vermes fêmeos recuperados. No caso da esquistossomose mansônica no homem, parece haver uma relação entre a deposição de ovos nos tecidos, sua destruição pela reação granulomatosa e a eliminação de ovos pelas fezes do hospedeiro (Cheever e col.⁶, 1977). Sob este aspecto acreditamos ter confirmado as observações acima referidas para a esquistossomose mansônica em camundongos, ao se verificar, na linhagem SJ, número crescente de vermes fêmeos e de ovos nas fezes dos roedores (Zanotti-Magalhães e col.³⁷, 1991). Na linhagem BH, a maior susceptibilidade do moluscos se contrapôs a menor número de vermes fêmeos e, paralelamente, menor número de ovos foi verificado nas fezes dos camundongos.

Para vários autores, a principal diferença observada entre os animais infectados com diversas linhagens de S. mansoni é a variação na densidade e distribuição dos ovos nos tecidos (Saoud³⁵, 1966; Anderson & Cheever¹,1972; Powers & Cheever²⁹, 1972; Kassim e col.¹⁵,1979).

Apesar da afirmação de que a patogênese da esquistossomose mansônica e principalmente determinada pela densidade dos ovos nos tecidos, Saoud³⁵ (1966) não evidenciou relação entre o número de ovos produzidos e a virulência do parasita, sugerindo que a ampla distribuição de ovos nos vários órgãos poderia estar mais relacionada com a maior virulência.

No presente experimento, o número de ovos eliminados nas fezes diferiu entre as linhagens BH e SJ. A maior susceptibilidade de B. tenagophila implicou maior eliminação de ovos pelas fezes dos camundongos. O número de ovos depositados nos tecidos hepático, esplênico e intestinal foi semelhante nas duas linhagens. A maior susceptibilidade de B. glabrata e B. tenagophila determinou maior deposição de ovos nos tecidos hepáticos.

Segundo Doenhoff e col.¹² (1986), existe uma significante correlação numérica entre o diâmetro dos granulomas hepáticos o número de ovos que são eliminados com as fezes, sendo ambos estes processos célula mediados. Numa fase mais adiantada da infecção esquistossomótica, observa-se redução ou modulação da reação granulomatosa, sendo que o processo de eliminação de ovos poderia, neste caso, ser controlado pela resposta imune humoral. Em animais imunocompetentes, podem ser formados, trombos inflamatórios, intravascularmente, em torno dos ovos, e esse fato poderia auxiliar a ruptura do endotélio vascular e permitir a penetração do ovo no tecido circunjacente.

A mediação celular, que modulou o granuloma no intestino dos roedores infectados pela linhagem SJ, não teria interferido na eliminação de ovos pelos camundongos parasitados por essa linhagem, observando-se maior eliminação de ovos com as fezes dos camundongos infectados por cercárias originadas de moluscos mais susceptíveis. Poder-se-ia pensar, também, que uma discreta reação granulomatosa fosse insuficiente para reter os ovos na parede intestinal.

Com efeito, acredita-se que numa primeira fase os granulomas retêm os ovos ao nível da parede intestinal. Numa segunda etapa, o processo inflamatório intenso, a necrose e a destruição dos tecidos facilitariam a eliminação de ovos (^{Tabela 7} e Fig. 1).

O processo granulomatoso é entendido como uma tentativa do hospedeiro para controlar a dispersão de substâncias antigônicas e restringi-las ao local de deposição, onde seriam desnaturadas e metabolizadas. A duração e o tamanho do granuloma seriam proporcionais à persistência do ovo na lesão e a capacidade de destruição dos antígenos por parte das células do hospedeiro (Lichtenberg^17,18, 1962, 1964).

Domingo e Warren¹³ (1968) verificaram notável diminuição da reação granulomatosa, quando a infecção esquistossomótica avançava para a fase crônica. A diminuição do tamanho do granuloma seria uma forma de dessensibilização endógena, relacionada com a constante e elevada produção de antígenos do ovo. Essa modulação poderia ser benéfica para o hospedeiro, pois os tecidos seriam destruídos em menor extensão, a formação de tecido fibroso seria menos intensa, e ainda, os antígenos seriam seqüestrados e destruídos mais rapidamente. Buchanan e col.⁴ (1973) sugeriram que, em decorrência da supressão da resposta imune celular, uma doença sistêmica, fatal, poderia estar se desenvolvendo. Numa segunda fase mais adiantada da doença, os ovos são circundados por uma zona de necrose liquefativa, contendo restos celulares e neutrófilos fragmentados. A contaminação das lesões hepáticas por bactérias promoveria infecções sistêmicas, toxemia e septicemia. Segundo os mesmos autores, o organismo do hospedeiro, uma vez apresentando incapacidade de montar uma resposta imune mediada por células, torna-se indefeso contra as atividades enzimáticas e fosfolipídicas dos ovos de S. mansoni.

A participação de células T e a caracterização de subpopulações de linfócitos que atuam modulando a resposta imune granulomatosa foram evidenciadas por Chensue & Boros⁷ (1979) e Chensue e col.⁸ (1980). A participação de anticorpos com ação de neutralizar os produtos hepatotóxicos do ovo foi sugerido por varios autores (Buchanan e col.⁴ 1973; Boros e col.², 1975; Colley¹⁰, 1975; Brito e col.³,1983).

Não se observou diferença significativa no tamanho dos granulomas das linhagens BH e SJ em todas as vísceras estudadas. A infecção dos camundongos com cercárias originadas em moluscos mais susceptíveis determinou diminuição no tamanho dos granulomas em todas as vísceras. Uma modulação mais precoce dos granulomas pode ter ocorrido em decorrência de uma apresentação mais rápida dos antígenos dos ovos responsáveis pela indução da reação granulomatosa.

Os resultados obtidos são importantes, pois há evidência de maior adaptação no campo das linhagens sulinas ao seu vetor B. tenagophila. Com a crescente susceptibilidade de B. tenagophila às linhagens autóctones do S. mansoni, os portadores vertebrados eliminariam, cada vez mais, maior número de ovos por grama de fezes, o que facilitaria a dispersão da doença na região Sul do Brasil.

Conclusões

Constatou-se que camundongos expostos ao S. mansoni, oriundos de B. tenagophila selecionadas geneticamente para o caráter susceptibilidade, eliminaram maior número de ovos do parasita nas fezes. A maior susceptibilidade de B. glabrata e B. tenagophila determinou maior número de granulomas esquistossomóticos por área de tecido hepático, em roedores infectados com as cercárias originadas nesses moluscos. Nos mesmos roedores, verificou-se que o tamanho dos granulomas hepáticos, esplênicos e intestinais, variou inversamente à taxa de infecção dos grupos de moluscos dos quais foram obtidas as cercárias infectantes.

Recebido para publicação em 25.3.1993

Reapresentado em 8.9.1993

Aprovado para publicação em 20.9.1993

Separata/Reprints: E.M. Zanotti-Magalhães - Caixa Postal 6109 - Cidade Universitária - Barão Geraldo - 13083-970 - Campinas, SP - Brasil

Edição subvencionada pela FAPESP. Processo Medicina 93/ 0208-5.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Out 2003
• Data do Fascículo
  Dez 1993

Histórico

• Aceito
  20 Set 1993
• Revisado
  08 Set 1993
• Recebido
  25 Mar 1993