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Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia

Print version ISSN 0102-0935On-line version ISSN 1678-4162

Arq. Bras. Med. Vet. Zootec. vol.52 n.6 Belo Horizonte Dec. 2000

https://doi.org/10.1590/S0102-09352000000600009 

Avaliação citológica de lavados traqueobrônquico e broncoalveolar em cavalos clinicamente sadios pelo método de coloração de Rosenfeld

[Cytological evaluation of Rosenfeld-stained tracheobronchial washes and bronchoalveolar lavages, in healthy horses]

 

W.R. Fernandes, E. Mori, A. Sanches

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP
Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87
05508-000 - São Paulo, SP

 

Recebido para publicação, após modificações, em 28 de julho de 2000.
E-mail: wilsonrf@usp.br
Financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP

 

 

RESUMO

Foram realizados estudos comparativos dos exames citológicos obtidos a partir de amostras dos lavados traqueobrônquico (LTB) e broncoalveolar (LBA) de cavalos clinicamente sadios. Foram colhidas 25 amostras pela técnica do LTB (25 animais) e 25 amostras pela técnica do LBA (5 animais). A suspensão celular dos lavados foi centrifugada, confeccionando-se lâminas coradas pelo método de Rosenfeld. A contagem diferencial mostrou predominância de macrófagos em ambas as técnicas de colheita, confirmando a possibilidade de sua utilização para obter amostras celulares das vias aéreas distais. Observou-se diferença na proporção de macrófagos e linfócitos entre as técnicas dos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar. As porcentagens de macrófagos e linfócitos observadas foram de 81,51±11,06% e 2,91±3,44% no LTB e de 54,78±15,92% e 33,70±14,41% no LBA, respectivamente. Também notou-se ausência de células epiteliais cilíndricas e produtoras de muco em LBA, indicando que essas amostras são provenientes da população alveolar e que esta técnica não traumatizou as vias aéreas proximais. Os demais tipos celulares foram identificados em proporções semelhantes e em pequenas quantidades em ambas as técnicas. As características morfológicas dos tipos celulares foram semelhantes nas duas técnicas.

Palavras-Chave: Cavalo, citologia, sistema respiratório, lavado broncoalveolar, lavado traqueobrônquico

 

ABSTRACT

Comparisons of tracheobronchial (TBW) and bronchoalveolar wash (BAL) cytologies, using respectively 25 and 5 normal horses were made. Differential cell counts were made on both TBW and BAL fluids on Rosenfeld-stained cytocentrifuged preparations. Macrophages were the predominant cell types seen in both fluid samples and these findings suggest the possibility of an adequate sampling of the distal air passages. Differences were found in lymphocytes and macrophages between TBW and BAL cytologies. The main cell types in BAL fluids were macrophages (54.78±15.92%) and lymphocytes (33.70±14.41%). On the other hand, lymphocytes and macrophages were found in 2.91±3.44% and 81.51±11.06% of cell types in TBW fluids, respectively. Also, there were absences of epithelial and goblet cells in BAL cytology, and these explain the adequacy of the lower respiratory tract sampling, performed without causing trauma of proximal air passages. Other cell types were found in few numbers and no differences were found between TBW and BAL fluids. Differences were not detected concerning morphological characteristics between TBW and BAL preparations.

Keywords: Horse, cytology, respiratory system, bronchoalveolar wash, tracheobronchial wash

 

 

INTRODUÇÃO

No Brasil, os recursos atuais disponíveis para uma avaliação objetiva e segura da severidade das doenças respiratórias em cavalos são escassos e limitados. O estudo das secreções do trato respiratório, em diferentes segmentos, demonstrou ser um meio semiológico importante como complemento de diagnóstico nas afecções respiratórias, capaz de obter resultados objetivos e confiáveis que definam a etiologia bem como estabeleçam o prognóstico da doença (Gonçalves et al., 1990; Gonçalves, 1997; Sanches, 1998).

O lavado traqueobrônquico (LTB) é uma das técnicas mais utilizadas com o objetivo de obtenção do conteúdo das secreções provenientes das vias aéreas distais. Essa técnica foi introduzida na medicina humana por Pecora (1959) e adaptada para cavalos por Mansmann & Knight (1972), que constataram a grande utilidade desse método na identificação do agente etiológico em afecções respiratórias de caracter infeccioso. Beech (1975) observou que o exame citológico do LTB pode ser utilizado na identificação do tipo de resposta inflamatória local das vias aéreas em cavalos com doença respiratória. Diversos autores demonstraram que as amostras provenientes do LTB apresentam valor de auxílio no diagnóstico em casos clínicos para investigações citopatológicas e microbiológicas (Whitwell & Greet, 1984; Gonçalves et al., 1990; Beech, 1991; Gonçalves, 1997; Sanches, 1998). Além disso, esses mesmos autores observaram facilidade e baixo custo para a realização das colheitas. Algumas desvantagens da técnica do LTB são decorrentes da aspiração percutânea, que incluem o enfisema subcutâneo, a infecção e a hemorragia local (Beech, 1991).

Apesar de ser uma técnica amplamente difundida, a utilização de amostras obtidas pelo LTB para avaliar as afecções pulmonares tem sido questionada, principalmente em relação ao valor da citologia do lavado relacionada com a manifestação clínica da doença. Larson & Busch (1985) relataram baixa correlação entre os achados histopatológicos pulmonares e citopatológicos traqueais em cavalos com doença pulmonar. Outros autores relataram que as amostras obtidas por meio do LTB possuem baixa concentração celular e grande variabilidade na população dos diferentes tipos celulares (Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989; Beech, 1991). Isso se deve aos diferentes métodos utilizados nas colheitas de amostras do LTB, nos quais podem ocorrer contaminação pelos tipos celulares das vias aéreas anteriores em conseqüência da endoscopia ou do deslocamento retrógrado do cateter após a tosse (Bain, 1997), ou mesmo devido à maior dinâmica de circulação na população celular traqueobrônquica em conseqüência da movimentação do epitélio respiratório ciliado (Derksen et al., 1989).

Outro método para a obtenção de amostras de secreções das vias aéreas distais é o lavado broncoalveolar (LBA). Essa técnica proporciona acesso às vias aéreas distais seguro e não invasivo, por meio de instilação de líquido para facilitar a aspiração do conteúdo fluido e dos tipos celulares presentes no lavado (Fogarty, 1990; Sweeney & Beech, 1991). A técnica do LBA foi originalmente desenvolvida na medicina humana por Finley et al. (1967). Viel (1983) apud Derksen et al. (1989), ao adaptar essa técnica em cavalos, demonstrou ser um indicador sensível de afecções pulmonares, com alta correlação com a histopatologia pulmonar, o que permitiu análise dos tipos celulares e proteínas provenientes do lavado (Dyer et al., 1983; Roszel et al., 1985; Sweeney & Beech, 1991). Algumas desvantagens da técnica do LBA em cavalos são decorrentes do seu custo mais elevado quando comparado ao LTB, devido à necessidade de um broncoscópio ou de um cateter específico para a colheita, bem como a necessidade de sedação prévia do animal (Sweeney & Beech, 1991).

Ao contrário da técnica do LTB, que é utilizada de rotina como complemento de diagnóstico no país (Gonçalves et al., 1990; Gonçalves, 1997; Sanches, 1998), a técnica do LBA ainda pode ser considerada como uma ferramenta recente para essa finalidade (Mori & Fernandes, 1999; Mori et al., 1999; Mori, 2000), necessitando de avaliação comparativa entre os resultados obtidos pelos dois métodos.

Sanches (1998) e Mori (2000) utilizaram o método de coloração de Rosenfeld (1947) para identificar os diferentes tipos celulares e estruturas presentes nos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar devido à visualização de suas características morfológicas. Os autores observaram ser uma técnica rápida e de fácil execução.

Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar os tipos celulares presentes no LTB e no LBA em cavalos clinicamente sadios, por meio da citologia corada pelo método de Rosenfeld.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados cavalos adultos, com idade entre 5 e 16 anos, sem raça definida, provenientes do Setor de Clínica de Grandes Animais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo. Os cavalos foram alojados em baias individuais com dimensões de 3,5´3,5 metros, isoladas do setor de atendimento clínico. A alimentação foi composta por 4kg de ração comercial e 4kg de feno para cada animal, divididos em duas vezes ao dia, e água oferecida ad libitum. A cama utilizada nas baias foi a maravalha de pinus, trocada diariamente. Essas condições de alojamento e manutenção dos animais estão de acordo com as recomendações descritas no Canadian..., (1993). Todos os animais foram submetidos a exames físicos e de laboratório complementares, dando especial atenção ao sistema respiratório.

Para a colheita do LTB foram utilizados 25 cavalos e a técnica utilizada foi a preconizada por Mansmann & Knight (1972), modificada por Beech (1975). Com os cavalos em estação, após a realização de tricotomia e anti-sepsia de uma área de 10´10cm, na região média do pescoço e cranial à bifurcação do músculo estenocefálico foi introduzida uma cânula na pele entre os anéis traqueais, atingindo o lúmen da traquéia. Através dessa cânula foi introduzido um cateter de polietileno de 60,9cm de comprimento até alcançar a região da carina. As cânulas utilizadas foram de dois calibres diferentes, 14 e 17 gauge, de acordo com o tamanho do animal. Através do cateter foi introduzida de 20 a 100ml de solução fisiológica estéril 0,9%, a qual foi imediatamente aspirada por meio de sucção leve por seringa. Esse procedimento foi repetido até recuperar um volume satisfatório com representatividade das células.

Para a realização do LBA foram utilizados cinco cavalos adultos. A técnica de colheita foi realizada a partir das observações descritas por diversos autores (Sweeney & Beech, 1991; McKane et al., 1993; Hoffman & Viel, 1997). Um cateter de silicone, com 10mm de diâmetro externo, 2,5mm de diâmetro interno e 300cm de comprimento, foi introduzido através da narina até a altura dos pequenos brônquios, com o animal posicionado em estação e com a cabeça e o pescoço estendidos, sedado com cloridrato de xilazina a 10% (na dosagem de 0,44mg/kg) associada com butorfanol a 1% (na dosagem de 0,033mg/kg) por via intravenosa. Uma solução fosfatada salina tamponada (PBS) estéril associada com heparina sódica na dosagem de 5 UI/ml foi introduzida em alíquotas de 60ml em cinco vezes (volume total de 300ml) através desse cateter, sendo imediatamente aspirado através de sucção leve por seringa. Esse procedimento foi repetido até se recuperar um volume satisfatório com representatividade de células. As amostras do LBA foram obtidas por cinco colheitas sucessivas em cada animal com intervalos de sete dias, totalizando 25 amostras.

A citologia dos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar foi realizada por meio de centrifugação à velocidade de 28g por 6 minutos (citocentrífuga modelo citospyn INCIBRÁSÒ) de 200ml das suspensões celulares. As lâminas foram fixadas com álcool metílico pa e coradas pelo método de Rosenfeld (1947). A leitura das lâminas foi realizada em microscopia óptica de imersão, em aumento de 800´ .

Fez-se a comparação entre as médias dos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar. Aplicou-se o teste U não-paramétrico de Mann-Whitney e estabeleceu-se o valor de 0,05 como nível de rejeição da hipótese de nulidade (P).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os exames físicos e de laboratório revelaram que todos os animais utilizados no experimento apresentavam-se hígidos, confirmando a ausência de sintomas compatível com afecções respiratórias.

A contagem de macrófagos e linfócitos mostrou diferenças significativas entre os lavados traqueobrônquico e broncoalveolar. Para os demais tipos celulares, neutrófilos, eosinófilos e mastócitos, as contagens foram semelhantes, e em pequenas quantidades, entre os lavados traqueobrônquico e broncoalveolar. O LTB apresentou maior proporção de macrófagos, menor proporção de linfócitos e presença de células epiteliais cilíndricas e de células produtoras de muco, quando comparado ao LBA (Tab.1).

 

 

O tipo celular predominante nos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar foi o macrófago, confirmando a capacidade de ambas as técnicas em obter amostras provenientes das vias aéreas mais distais (Roszel et al., 1985; Zinkl, 1992; Bain, 1997). A porcentagem de macrófagos obtida em LTB diverge das obtidas por alguns autores em cavalos hígidos (Nuytten et al., 1983; Larson & Busch, 1985; Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989), os quais observaram menor quantidade desse tipo celular (entre 24,0 e 65,0%) em relação aos obtidos no presente trabalho. Essa discordância pode ocorrer devido às diferentes técnicas de colheita do LTB descritas na literatura. Mair et al. (1987) observaram 65,0% de macrófagos em LTB de cavalos ao utilizarem a técnica de aspiração percutânea transtraqueal, enquanto que na técnica de lavagem por via endoscópica foram verificados valores menores (43,0%). Além disso, a diferenciação dos tipos celulares no LTB, especialmente os macrófagos e linfócitos, pode ficar prejudicada pela presença de muco e células epiteliais cilíndricas. Segundo Beech (1991), a contagem celular total e diferencial de amostras do LTB não é considerada confiável devido a variações no volume de fluido infundido e recuperado (diluição da amostra) e na distribuição celular entre as amostras da mesma colheita. As amostras obtidas do LBA apresentaram pequena quantidade de muco e ausência de células epiteliais. O número de macrófagos em LBA está de acordo com os relatos de literatura para animais hígidos (entre 30,0 e 60,0%; Mair et al.,1987; Derksen et al., 1989; Sweeney & Beech, 1991; Bain, 1997). Isto se deve à menor variabilidade da população celular alveolar em relação a traqueobrônquica, quando se comparam os resultados obtidos por diversos autores.

A porcentagem de linfócitos obtida em LTB e LBA no presente trabalho está de acordo com os relatos de literatura em cavalos hígidos (Nuytten et al., 1983; Larson & Busch, 1985; Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989; Sweeney & Beech, 1991; Bain, 1997). Os autores citados observaram valores entre 2,0 e 8,0% de linfócitos em LTB e entre 30,0 e 70,0% em LBA.

Em relação à porcentagem de neutrófilos obtidos em LTB de cavalos hígidos, Nuytten et al. (1983) e Mair et al. (1987) observaram valores entre 4,6 e 9,0%, próximos aos obtidos no presente experimento. Larson & Busch (1985) e Derksen et al. (1989) observaram maior quantidade de neutrófilos em LTB de cavalos hígidos, 39,0% e 32,0%, respectivamente. Isto confirma a grande variabilidade da população celular traqueobrônquica em diferentes experimentos. A contagem de neutrófilos no LBA em cavalos hígidos está de acordo com as observadas na literatura (entre 1,2 e 14,4%, Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989; Sweeney & Beech, 1991; Bain, 1997).

Os valores das células epiteliais cilíndricas obtidas em LTB foram diferentes dos encontrados por outros autores em cavalos hígidos (Nuytten et al., 1983; Larson & Busch, 1985; Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989), os quais observaram maior quantidade desse tipo celular (entre 13,0 e 49,1%). No LTB de cavalos hígidos normalmente podem ser observadas células epiteliais ciliadas e não ciliadas, devido à descamação da mucosa durante o procedimento de colheita, além de grande quantidade de muco proveniente das vias aéreas proximais (Bain, 1997). A ausência de células epiteliais cilíndricas do LBA indica que essas amostras são provenientes da população celular alveolar e que o procedimento de colheita não proporcionou trauma das vias aéreas proximais.

Os valores dos demais tipos celulares (eosinófilos, mastócitos e células produtoras de muco) no LTB e LBA de animais hígidos foram similares aos observados na literatura (Nuytten et al., 1983; Larson & Busch, 1985; Mair et al., 1987; Derksen et al., 1989; Sweeney & Beech, 1991; Bain, 1997).

Não houve diferença nas características morfológicas dos tipos celulares entre as técnicas de colheita dos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar (Fig. 1), estando de acordo com as descrições de Zinkl (1992). Os macrófagos pulmonares apresentaram grande variação no tamanho e na forma, mas todos tinham em comum citoplasma abundante, com presença de pequenos vacúolos. O núcleo apresentava formato riniforme ou arredondado, de localização periférica ou central, com nucléolo bem evidente. Houve de maneira esporádica formas bi, tri e multinucleadas. Os linfócitos apresentaram tamanho pequeno, quando comparados com os macrófagos pulmonares, com predomínio de núcleo intensamente corado envolvido por citoplasma de proporções bastante reduzidas. Os neutrófilos apresentaram-se íntegros, com núcleo grande, segmentado e citoplasma abundante. Em menor número, os eosinófilos apresentaram morfologia semelhante a uma framboesa, devido à presença de grandes grânulos esféricos que preenchiam quase todo o citoplasma, deixando o núcleo localizado na periferia da célula. Os mastócitos apresentaram-se de modo esporádico com vários grânulos citoplasmáticos arroxeados e núcleo pouco segmentado. O número reduzido de neutrófilos, eosinófilos, células produtoras de muco e ausência de células metaplásicas e/ou neoplásicas são também indicativos do estado de higidez dos cavalos utilizados nos experimentos, demostrando ausência de processo inflamatório de qualquer natureza.

 

 

A utilização do método de coloração preconizado por Rosenfeld (1947) para a citologia dos lavados traqueobrônquico e broncoalveolar permitiu caracterização e diferenciação dos diversos tipos celulares e estruturas presentes nos lavados, inclusive com visualização de estruturas mais delicadas como os cílios das células epiteliais, de forma semelhante aos resultados obtidos em relação a outras metodologias de coloração (Whitwell & Greet, 1984; Beech, 1991; Zinkl, 1992).

 

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos permitem concluir que a técnica de LBA foi capaz de obter amostras com pequena variação celular proveniente das vias aéreas distais. Pela técnica de LTB observa-se maior variação celular, com presença de células epiteliais e produtoras de muco. Isso indica que a técnica de LTB é capaz de recuperar amostras de diferentes locais das vias aéreas proximais e distais. Em relação à metodologia de coloração de Rosenfeld, observaram-se resultados satisfatórios, demostrando ser uma técnica prática, rápida e que permite a caracterização de todos os tipos celulares presentes nos lavados.

 

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