Detecção de Mycoplasma spp. e Ureaplasma diversum em vacas com distúrbios reprodutivos

Detection of Mycoplasma spp. and Ureaplasma diversum in cown with reproductive disorders

MEDICINA VETERINÁRIA

Detecção de Mycoplasma spp. e Ureaplasma diversum em vacas com distúrbios reprodutivos

Detection of Mycoplasma spp. and Ureaplasma diversum in cown with reproductive disorders

M. Buzinhani; E. Metiffogo; J. Timenetsky

Instituto de Ciências Biomédicas - USP Av. Prof. Lineu Prestes, 1374 - Cidade Universitária 05508-900 – São Paulo, SP

RESUMO

Foram utilizadas 112 amostras de muco vulvovaginal, coletados de vacas com distúrbios reprodutivos, para pesquisa de Mycoplasma e Ureaplasma. Para isolamentos, foram usados meios específicos para micoplasmas (SP-4) e para ureaplasmas. PCR genérica, PCR específica para Mycoplasma bovis e nested-PCR em tubo único para Ureaplasma diversum foram realizados com os DNAs extraídos das amostras. Mycoplasma spp. e U. diversum foram detectados em 12,5 e 25,0%, respectivamente. A PCR genérica resultou em reações positivas em 63,4% das amostras transportadas em SP-4 e em 69,6% das transportadas em meio de ureaplasma. M. bovis foi detectado, na PCR específica, em 9,8% das amostras e U. diversum, na nested-PCR, em 37,5%. Houve maior sensibilidade na metodologia da PCR quando comparada à técnica de cultivo para Mycoplasma e Ureaplasma.

Palavras-chave: vaca, Mycoplasma bovis, Ureaplasma diversum, cultura, PCR

ABSTRACT

In the study, 112 samples of vulvovaginal mucus of cows bearing reproductive disturbance were investigated for Mycoplasma and Ureaplasma. Specific media for the culture of mycoplasmas (SP-4) and ureaplasmas were used. PCR with general primers, PCR specific for Mycoplasma bovis, and nested-PCR in a single tube for Ureaplasma diversum were performed to detect DNA of the sample. Mycoplasma spp. and U. diversum were isolated in 12.5 and 25.0%, respectively. With generic PCR, positive reaction was obtained in 63.4% of the samples transported in SP-4 and 69.6% in ureaplasma medium. M. bovis was detected in 9.8% of samples and nested-PCR in a single tube for U. diversum resulted in 35.0% of positive reaction. Results demonstrated increased sensitivity of PCR methodology compared with culture technique applied to the search of microorganisms of Mycoplasma and Ureasplasma genera.

Keywords: cow, Mycoplasma bovis, Ureaplasma diversum, culture, PCR

INTRODUÇÃO

As infecções por micoplasmas (Mollicutes) em animais possuem importância histórica e persistem na atualidade interferindo na pecuária. Esses microrganismos estão associados a diversas doenças, cujos sinais clínicos podem ser na forma aguda, porém normalmente são de caráter crônico (Tully, 1993; Rosenbusch, 1994). Os micoplasmas são potenciais causadores de patologias no sistema respiratório, urogenital, glândula mamária, articulações, sistema nervoso e conjuntiva ocular (Kirkbride, 1987; Stipkovits, 1993; Garcia et al., 1996).

Entre as espécies isoladas de bovinos, cerca de 20, Mycoplasma bovis, M. bovigenitalium e Ureaplasma diversum são considerados os patógenos de maior importância para o trato genital. Esses microrganismos estão associados a vulvovaginite granular, endometrite, salpingite, aborto e infertilidade em vacas (Miller et al., 1983; Ahmed et al., 1998). No Brasil, a pesquisa dessas espécies em bovinos é pouco freqüente.

Os micoplasmas são microrganismos fastidiosos e exigem meios bastante ricos. Cuidados adicionais devem ser adotados na coleta e no transporte do material clínico para minimizar contaminações que podem inviabilizar o seu isolamento. Técnicas moleculares (PCR) têm sido utilizadas para identificação e detecção de micoplasmas e ureaplasmas em amostras clínicas (Ghadersohi et al., 1997; Cardoso et al., 2000). Essas técnicas são indicadas para a detecção dos micoplasmas devido às dificuldades encontradas no cultivo e isolamento desses microrganismos.

Os objetivos deste estudo foram isolar e identificar micoplasmas em muco vulvovaginal de vacas com distúrbios reprodutivos e otimizar a nested-PCR em tubo único para identificação de U. diversum.

MATERIAL E MÉTODOS

As cepas M. alkalences – PG51, M. arginini – PG40, M. bovis – Donetta, M. bovigenitalium e Acholeplasma ladlawii foram cultivadas em meios sólidos e líquidos SP-4 (Tully, 1995) e U. diversum – ATCC 49783 cultivada em meios sólido e líquido para ureaplasma (Ruhnke e Rosendal, 1994). Os subcultivos foram utilizados para padronização dos testes e para obtenção de DNA de referência.

Amostras de muco vulvovaginal de 112 vacas da raça Holandesa com distúrbios reprodutivos (vulvite granular, infertilidade ou aborto) foram coletadas em duplicata com o auxílio de swabs e transportadas em meios SP-4 e para ureaplasma. Os animais eram provenientes de sete propriedades tecnificadas dos estados de São Paulo, Goiás e Santa Catarina. Alíquotas das amostras de muco, diluídas a 10^-3, foram inoculadas em meios sólidos e líquidos SP-4 (Tully, 1995) e para ureaplasma (Ruhnke e Rosendal, 1994), em períodos inferiores a 24 horas da coleta.

Os isolados foram caracterizados inicialmente pela observação de colônias em ágar SP-4 na forma de "ovo frito", formação de filmes e manchas, utilização de glicose e/ou de arginina. As culturas puras desses isolados foram submetidas ao teste de inibição de crescimento com soros hiperimunes de M. alkalences, M. arginini, M. bovis, M. californicum e M. canadense (Goll, 1994). No meio para ureaplasma, foi observada a atividade da urease pela alteração da cor do meio líquido (aumento do pH) e pela presença no ágar de pequenas colônias granulosas de coloração marrom escura_.

Para a definição do método de extração de DNA a ser utilizado, foram testadas as metodologias descritas por Fan et al. (1995) baseadas na fervura, por Boom et al. (1990), na sílica e, por Sambrook et al. (1989), no fenol/clorofórmio. Essas extrações foram realizadas em suspensões de 200µl, na proporção de 1:1, em muco de fundo vaginal livre de micoplasmas e cultura de M. bovis Donetta (5x10⁸UFC). O DNA obtido pelos diferentes métodos de extração (5% do volume final em diluições de 10^-1a 10^-5) foram submetidos a PCR para detecção de M. bovis (González et al., 1995). A metodologia descrita por Fan et al. (1995) foi realizada para extração de DNA de 1ml das amostras clínicas.

A PCR para detecção dos gêneros pertencentes à classe Mollicutes (PCR genérica) foi realizada como descrita por Van Kuppeveld et al. (1992). A nested-PCR em tubo único para detecção de U. diversum foi otimizada seguindo parâmetros citados por Cardoso et al. (2000), com alteração na seqüência de oligonucleotídeos iniciadores em um dos primers externos. Foram analisadas em reações independentes as temperaturas de hibridação, as concentrações dos primers externos GPO1 (Van Kuppeveld et al., 1992) e UD₂ (Cardoso et al., 2000) e dos primers internos UD₃/UD₄ (Cardoso et al., 2000). As concentrações de MgCl₂ e o número de ciclos de amplificações foram otimizados com concentrações constantes de Taq DNA polimerase¹ e tampão da PCR e de dNTP¹. Na nested-PCR em tubo único, utilizaram-se 10pmol de cada primer GPO1/UD₂, 100pmol de cada primer UD₃/UD₄, 2U de Taq DNA polimerase, 2,5mM de MgCl₂, 150µM de cada dNTP, 2µl da amostra de DNA e água ultrapura até o volume de 100µl. A amplificação foi obtida em termociclador programado para um ciclo de 94°C por 5min, 35 ciclos de 94, 57 e 72°C por 1min, para os primers externos e 94°C por 5min, 35 ciclos de 94, 49°C por 1min, 72°C por 30s e um ciclo final de 72°C por 10min, para os primers internos. O limite de detecção foi estabelecido por meio de amplificações de diluições seriadas do DNA extraído de culturas de M. bovis (830ng/µl) para PCR genérica e PCR M. bovis e de cultura de U. diversum (90ng/µl) para nested-PCR. O teste de especificidade da nested-PCR foi realizado com diferentes espécies de micoplasmas isoladas de bovinos.

Os produtos obtidos nas amplificações das PCRs foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, contendo 10µg/ml de brometo de etídeo em tampão TAE (40mM Tris-acetato; 2mM EDTA; pH 8,0), detectados sob luz ultravioleta e fotodocumentados². Incluiu-se marcador de peso molecular de 100pb DNA Ladder¹. Na Tab. 1, são apresentadas as seqüências dos primers utilizados nas diferentes PCRs e os respectivos produtos esperados na eletroforese.

O seqüenciamento dos produtos amplificados pela PCR específica para M. bovis e nested-PCR para U. diversum foi realizado no aparelho ABI Prism 310 DNA Sequencer³. Na reação, utilizaram-se 10ng de produto purificado (Zhen e Swark, 1993), 25ng do oligonucleotídeo (MboR/UD₃), 2µl BigDT (Big Dye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit³ e água ultrapura até o volume final de 6µl. Os ciclos realizados foram 1min a 96°C, 10s a 96°C, 20s a 55°C e 60°C por 4min (M. bovis) e 1min a 96°C, 10s a 96°C, 20s a 49°C e 60°C por 4min (U. diversum). Após a reação da PCR, o DNA foi precipitado, adicionando 40µl de isopropanol 75%, seguido de agitação e incubação por 15min à temperatura ambiente. Em seguida o DNA foi centrifugado por 20min a 16000 x g, lavado com 100µl de etanol 70%, resfriado e centrifugado como descrito anteriormente. Após a evaporação do etanol, o precipitado foi homogeneizado em 20µl de TSR (Template Supression Reagent) para o seqüenciamento em aparelho ABI 310 e análise no programa BLAST⁴.

O teste McNamer foi aplicado, utilizando o c², tabela 2x2, para análise comparativa entre as técnicas de cultivo e PCR aplicadas na avaliação das amostras de muco vulvovaginal. O cultivo foi adotado como prova de referência e o nível de significância igual 5% (Siegel, 1956).

RESULTADOS

Foram obtidos 14 isolados de Mycoplasma spp. (12,5%) em meio SP-4 (Tab. 2). Ao se utilizar inibição de crescimento com os soros hiperimunes das principais espécies de importância para bovinos, não se identificaram os isolados, que foram classificados como Mycoplasma spp. Ureaplasmas foram isolados de 28 amostras (25,0%).

A escolha do método de extração foi realizada após análise da PCR específica para M. bovis com DNA extraído da suspensão de muco de fundo de vagina/cultura desse microrganismo. Na Fig. 1-B, observa-se maior sensibilidade da PCR quando realizada com o DNA extraído pelo método de fervura descrito por Fan et al. (1995).

Foram obtidas reações positivas em 71 (63,4%) e 78 amostras (69,6%) na PCR genérica realizada a partir do DNA do material clínico transportado nos meios SP-4 e para ureaplasma, respectivamente (Tab. 3). O limite de detecção dessa metodologia foi de 830fg. A Fig. 2 mostra as reações obtidas na PCR genérica com DNA de diferentes espécies de micoplasmas e amostras clínicas de bovinos. Na PCR para detecção de M. bovis, o limite de detecção foi de 415fg (Fig. 3) e foram obtidas 11 reações (9,8%) positivas com o DNA extraído das amostras clínicas. Reações positivas foram obtidas em 42 amostras clínicas (37,5%) com a nested-PCR. A especificidade da nested-PCR foi testada com o DNA de micoplasmas isolados do trato reprodutivo bovino, obtendo-se reação positiva apenas com o DNA de U. diversum. O limite de detecção correspondeu a 180pg. O seqüenciamento dos produtos da PCR para M. bovis e U. diversum mostrou 100% de similaridade com a seqüência depositada no GenBank para as duas espécies.

Na análise da PCR genérica realizada com DNA extraído de amostras transportadas em meio para ureaplasma e SP-4 em relação ao cultivo, obteve-se uma diferença de positividade significativa (P>0,05) de 48,0 e 55,1 no teste de c², que se encontram acima do valor crítico desta prova. Na análise da nested-PCR em relação ao cultivo, foi obtido o valor de 5,41 no teste c², demonstrando diferença significativa entre as técnicas (P<0,05).

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

O material clínico utilizado neste trabalho foi satisfatório para o cultivo e isolamento de micoplasmas e para extração de DNA para PCR e está em concordância com a literatura que indica esse material para o estudo das micoplasmoses do trato reprodutivo bovino (Cottew, 1970; Langford, 1975, Ball e McCaughey, 1979).

As espécies M. bovis, M. bovigenitalium e M. canadense, implicadas como agentes de infertilidade, de aborto ou de lesões como vulvite granular em vacas, não foram isoladas no cultivo em meio SP-4. Foram obtidos isolamentos de micoplasmas classificados como Mycoplasma spp. em 12,5% das amostras. Cottew, (1970) e Langford, (1975) relataram o isolamento de Mycoplasma spp. em animais sadios. Os isolados não identificados podem ser de espécies não patogênicas encontradas na microbiota do trato reprodutivo de bovinos, como M. verecundum e Mycoplasma sp. Micoplasmas da microbiota residente, entretanto, não devem ser totalmente desconsiderados em processos infecciosos devido ao oportunismo dessas bactérias.

U. diversum foi considerado comensal por muito tempo e atualmente tem importância veterinária. Esse microrganismo é freqüentemente isolado de vacas com histórico de aborto (Maxie, 1986) e com lesões em vulva (Mulira et al., 1992). Neste estudo, foi isolado em 25,0% das amostras de muco vulvovaginal de vacas com distúrbios reprodutivos. Cardoso et al. (2000), no Brasil, isolaram U. diversum em 35,7% de 168 amostras de muco vulvovaginal de vacas.

O cultivo de micoplasmas pode ser prejudicado, mesmo quando se utilizam condições ideais. O tipo de amostra clínica, o método de coleta e transporte, a exigência nutricional e o número de micoplasmas viáveis no material clínico podem interferir no cultivo. Técnicas derivadas da biologia molecular estão sendo aplicadas na medicina veterinária, e a PCR tem sido de ampla utilidade no diagnóstico precoce de doenças. Essa metodologia é bastante sensível, e sua padronização para detecção de DNA em diferentes tipos de materiais clínicos deve ser realizada.

A extração de DNA pela fervura (Fan et al., 1995) demonstrou ser uma técnica de rápida execução, baixo custo, sem utilização de reagentes tóxicos e com boa aplicabilidade em amostras de muco vulvovaginal. O método de extração de DNA a ser empregado deve ser analisado de acordo com o material clínico, para que não permaneçam inibidores da reação de amplificação. A fervura é um método simples que minimiza as perdas do material durante o processamento e possivelmente inativa os inibidores da PCR.

A PCR com primers genéricos (GPO3/MGSO), realizada com DNA obtido das amostras de muco vulvovaginal, foi utilizada como triagem para detecção de gêneros pertencentes à classe Mollicutes, para posterior identificação com PCR específico. A superioridade da PCR genérica em relação à cultura justifica-se por sua capacidade em detectar material genético de Mycoplasma spp. não cultiváveis, presentes no trato reprodutivo bovino, e por sua alta sensibilidade (830fg de DNA). Van Kuppeveld et al. (1992) relataram a detecção limite de 1pg, com primers GPO1 e MGSO, com DNA de M. pneumoniae.

A PCR para detecção de M. bovis mostrou-se satisfatória e detectou 11 amostras (9,8%). Os resultados negativos obtidos na cultura quando comparados às reações positivas na PCR, podem sugerir que o número de bactérias viáveis no material clínico foi insuficiente para o isolamento ou houve contaminação das amostras. O limite de detecção, obtido neste estudo, de 415fg, aproxima-se dos trabalhos de Hotzel et al. (1993), González et al. (1995) e Ghadersohi et al. (1997), que, ao utilizarem a PCR para detecção direta de M. bovis no leite e em amostras nasais de bezerros com pneumonia, verificaram sensibilidade de 10 a 400fg de DNA. A PCR específica para detecção de M. bovis tem sido utilizada em amostras de leite e muco nasal (Hayman e Hirst, 2003; Foddai et al., 2005), não há descrição, porém, para amostras de muco vulvovaginal. A metodologia aplicada neste estudo, portanto, poderá ser utilizada para essas amostras, o que possibilitará ampliar os dados sobre a ocorrência de M. bovis em bovinos com distúrbios reprodutivos.

A nested-PCR em tubo único foi otimizada para a detecção de U. diversum. Foram testadas temperaturas mais baixas de hibridação para os primers internos e temperaturas mais altas para os primers externos, impedindo a interferência cruzada entre eles. Assim, a atuação de ambos os pares de primers foi realizada de forma independente. Concentrações variadas dos primers externos foram testadas, optando-se por uma que possibilitasse todo seu uso no primeiro estágio de amplificações. Dessa forma, os primers externos não interferiram na cinética do segundo ciclo.

Hopert et al. (1993) e Verdin et al. (2000) relataram a alta sensibilidade de nested-PCR. A técnica, porém, requer cuidados adicionais pela maior possibilidade de contaminações. Nested-PCR em tubo único é uma alternativa para diminuir o risco de contaminação. A sensibilidade da metodologia (90pg), observada neste trabalho, foi maior que a descrita até o momento na literatura (Cardoso et al., 2000).

Na nested-PCR foram obtidas 25 amostras positivas, que foram negativas na cultura. Este fato pode ser justificado pela alta sensibilidade da PCR utilizada. Cultura positiva e nested-PCR negativa foram observadas, o que pode ser devido a perdas de DNA durante o processo de extração. Mediante os achados, a necessidade de associação da PCR e do cultivo fica evidente para o diagnóstico da micoplasmasmose em bovinos com distúrbios reprodutivos. A baixa porcentagem de isolamento de ureaplasmas por meio de cultivo pode estar relacionada ao transporte das amostras clínicas (oscilações na temperatura ambiental entre a coleta e o processamento da amostra) ou à presença de outros microrganismos de crescimento mais rápido. Os ureaplasmas podem perder sua viabilidade antes de serem incubados, porém, quando não ocorre a degradação completa do DNA, podem ser detectados pela PCR.

A necessidade de se viabilizar técnicas mais eficientes para o diagnóstico de distúrbios reprodutivos causados por agentes infecciosos é de grande importância para se obter um controle mais efetivo das doenças, diminuindo, assim, as perdas econômicas do produtor.

Testes para Mycoplasma spp., em casos de distúrbios reprodutivos dos bovinos, não são feitos rotineiramente no Brasil, o que dificulta avaliar o seu real envolvimento nesses casos. Pesquisas relacionadas à epidemiologia e à patogenia desses microrganismos devem ser realizadas para o melhor conhecimento e desenvolvimento de métodos de controle e tratamento.

Recebido em 19 de abril de 2006

Aceito em 22 de outubro de 2007

E-mail: [e-mail]

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Vilber Loumat – Marne-la-Vallée, França.

3

PE Applied Biosystems – Foster City, EUA.

4

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Fev 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2007

Histórico

• Aceito
  22 Out 2007
• Recebido
  19 Abr 2006