Efeito alelopático e toxicidade frente à Artemia salina Leach dos extatos do fruto de Euterpe edulis Martius

Allelopathic effects and toxicity against Artemia salina Leach of extracts of the fruit of Euterpe edulis Martius

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Efeito alelopático e toxicidade frente à Artemia salina Leach dos extatos do fruto de Euterpe edulis Martius

Allelopathic effects and toxicity against Artemia salina Leach of extracts of the fruit of Euterpe edulis Martius

Cristina Peitz de Lima^I,1; Miriam Machado Cunico^II; Roberta Rafaela Trevisan^I; Andressa Frizzo Philippsen^II; Obdúlio Gomes Miguel^II; Marilis Dallarmi Miguel^I

^IUniversidade Federal do Paraná, Departamento de Farmácia, Laboratório de Farmacotécnica, Curitiba, PR, Brasil

IIUniversidade Federal do Paraná, Departamento de Farmácia, Laboratório de Fitoquímica, Curitiba, PR, Brasil

RESUMO

Alelopatia é um processo envolvendo metabólitos secundários produzidos por plantas que infl uenciam o crescimento e desenvolvimento de sistemas agrícolas. Devido à toxicidade dos herbicidas sintéticos para o meio ambiente e para a saúde humana tem-se aumentado o interesse na exploração da alelopatia como uma alternativa para o controle de plantas daninhas. O presente trabalho avaliou efeito dos extratos dos frutos de Euterpe edulis Martius sobre o desenvolvimento de cipselas e plântulas de Lactuca sativa Linné, foram determinados o índice de velocidade de germinação, o crescimento da radícula e do hipocótilo. Para a avaliação da toxicidade dos extratos foi realizado o ensaio de toxicidade frente ao microcrustáceo Artemia salina Leach determinando-se a CL₅₀ e percentual de mortalidade. A fração remanescente demonstrou efeito alelopático, pois todas as concentrações alteraram os valores do índice de velocidade de germinação e as concentrações de 0,2 e 0,4 mg inibiram tanto o crescimento da radícula quanto o crescimento do hipocótilo. No ensaio de toxicidade todos os extratos apresentaram CL₅₀ superior a 1000 ppm e 0% de mortalidade das artemias, indicando a não toxicidade dos extratos.

Palavras-chave: alelopatia, palmeira Juçara, Mata Atlântica, toxicidade

ABSTRACT

Allelopathy is a process involving secondary metabolites produced by plants that influence growth and development of agricultural systems. Because of the toxicity of synthetic herbicides to the environment and human health, there has been increased interest in exploiting allelopathy as an alternative for weed control. This study evaluated the eff ect of extracts of Euterpe edulis Martius fruits on the development of cypselae and seedlings of Lactuca sativa Linné; the germination speed index, radicle and hypocotyl growth were determined. To evaluate the toxicity of the extracts the toxicity test against Artemia salina Leach was used, where the LC₅₀ and mortality rate were determined. Th e remaining fraction showed allelopathic effect, all concentrations altered the values of the index of germination speed and the concentrations of 0.2 and 0.4 mg inhibited both radicle growth and hypocotyl growth. In the toxicity test all extracts showed LC₅₀ greater than 1000 ppm and mortality rate of 0%, indicating no toxicity of the extracts.

Key words: allelopathy, Atlantic Forest, Juçara palm tree, toxicity

Introdução

A alelopatia é defi nida como qualquer processo envolvendo metabólitos secundários produzidos por plantas, microrganismos e fungos que, uma vez liberados no ambiente, infl uenciam o crescimento e o desenvolvimento de sistemas biológicos naturais ou implantados, seja de forma positiva ou negativa (Carmo et al. 2007). A alelopatia produz efeitos sobre diversidade de ecossistemas terrestres e aquáticos, incluindo infl uências na sucessão de plantas e padrões de vegetação, na inibição da fi xação de nitrogênio e nitrifi cação, na inibição da germinação e decomposição de sementes (Gorla & Perez 1997). A competição gerada pelo desenvolvimento de plantas daninhas em áreas de cultivo de culturas comerciais afeta o desenvolvimento destas, reduzindo a produtividade e a qualidade produto (Tokura & Nóbrega 2006). Além disso, disputam com as culturas os elementos nutritivos, a água, os raios solares e o espaço, em virtude disso as culturas invadidas crescem mal e por vezes morrem. O uso de herbicidas sintéticos, embora seja considerado um método de controle efi caz para um número considerável de espécies de plantas daninhas, é questionado quanto ao seu impacto ambiental (Souza Filho et al. 2006). O uso inadequado de herbicidas aumenta a resistência de plantas daninhas a algumas classes destes pesticidas. Estudos relacionados à ação alelopática são úteis na busca de novas moléculas com ação herbicida ou reguladora do crescimento, geralmente pertencentes a classes de metabólitos secundários, menos prejudiciais ao ambiente quando comparados aos agroquímicos sintéticos (Magiero et al. 2009).

Os agrotóxicos ao permanecerem no ambiente ou atingirem o meio aquático, oferecem riscos para espécies animais por sua toxicidade, além da possibilidade de acumulação ao longo da cadeia alimentar. Assim, na pesquisa sobre novos herbicidas são necessários estudos de ecotoxicidade. Para estimar os efeitos deletérios de agrotóxicos sobre o ambiente, freqüentemente são utilizados testes de toxicidade aguda. Os peixes e invertebrados aquáticos são sensíveis às variações de parâmetros ambientais e por isso são utilizados como modelos para testes de poluentes (Barbieri 2004). Dentre os testes utilizados podemos destacar o ensaio de letalidade frente ao microcrustáceo Artemia salina Leach, que é utilizado para o tanto para o monitoramento de efl uentes, como para a determinação da toxicidade aguda.

Ensaios de laboratório com papel de filtro e caixa Gerbox são utilizados para demonstrar a atividade alelopática de extratos e compostos. Uma das espécies mais amplamente utilizadas nos bioensaios é a alface (Lactuca sativa Linné), pois as cipselas (frutos) são pequenas, possuem grande área de superfície de contato, fazendo com que sejam bastante sensíveis ao meio que as rodeia, não requerendo nenhuma manipulação, além do contato com o meio (Malheiros & Peres 2001).

Visto o exposto acima tornam-se necessários estudos com extratos de plantas para avaliar o potencial alelopático bem como a toxicidade dos mesmos, para a procura de novos modelos de moléculas herbicidas. Não são relatados estudos alelopáticos sobre os frutos da espécie Euterpe edulis Martius, palmeira conhecida como palmito doce ou juçara, de ocorrência natural na Mata Atlântica (Lima et al. 2008). Sendo assim presente trabalho objetivou avaliar o efeito alelopático dos extratos do fruto E. edulis sobre cipselas e plântulas de L. sativa e além da toxicidade frente a náuplios de A. salina.

Material e métodos

Preparo dos extratos

Os frutos foram coletados no município de Garuva, SC. Os mesmos foram imersos em 4 L de água destilada e despolpados. A polpa foi extraída por maceração em mistura 6 L de etanol e água, por duas semanas. A polpa foi fi ltrada e o extrato obtido foi concentrado a um quarto do volume. Após o extrato concentrado foi particionado com solventes de polaridade crescente: hexano, clorofórmio e acetato de etila conforme a metodologia e em equipamento Soxhlet modificado de Carvalho et al. (2009), obtendo-se as frações hexano, clorofórmio, acetato de etila e remanescente (fração final do extrato após a partição com todos os solventes).

Atividade alelopática

Para o teste do crescimento foi utilizado cipselas de L. sativa (alface), classe fiscalizada, cultivar Baba de Verão, fornecedor Top Seeds, lote 24716, com 99% de germinação detectados por meio de teste padrão de germinação. Foram preparadas soluções em concentrações decrescentes de 0,8; 0,4; 0,2 e 0,1 mg mL^-1 das frações da polpa, utilizando os solventes, hexano, clorofórmio, acetato de etila e água para dissolver as soluções. Um mL de cada uma das soluções foi impregnado em folha de papel Whatman número 6, o material permaneceu em estufa a uma temperatura de 50 ºC por 24 horas. Após a evaporação dos solventes, os papéis de fi ltro correspondentes a cada diluição foram colocados em caixas gerbox sob fluxo laminar. As caixas gerbox foram previamente desinfetadas com hipoclorito de sódio. Na seqüência foram adicionados 6 mL de água destilada e distribuídas 20 cipselas de L. sativa em cada caixa gerbox. Após as caixas foram colocadas em um germinador Mangelsdorf, marca Biomatic, previamente regulado a uma temperatura de 24 ºC. Em paralelo houve a germinação dos controles dos solventes utilizados e de água nas mesmas condições de preparo. Passados sete dias, foram efetuadas as leitura em papel milímetrado dos comprimentos da radícula e do hipocótilo.

O mesmo procedimento de preparo, com as mesmas concentrações e controles utilizados para o teste de crescimento foi realizado para o teste da germinação. Verifi cou-se diariamente quantas sementes germinaram na presença das frações, em comparação com os controles no período de cinco dias, uma vez que dentro deste período todas as sementes germinaram. Desta forma, foi possível avaliar se a fração inibiu ou estimulou a germinação. Os resultados foram submetidos à análise de acordo com a germinação do grupo controle. Foram consideradas sementes germinadas aquelas que apresentavam extensão radicular igual ou superior a 2 mm (Lobo et al. 2008).

O índice de velocidade de germinação foi calculado por meio da seguinte fórmula IVG = G1/N1 + G2/N2 + G3/N3 + G4/N4 + G5/N5, onde G1, G2... G5, Gn é o número de sementes germinadas e N1, N2 .. N5, Nn é o número de dias após a semeadura (Hoff mann et al. 2007).

O delineamento estatístico foi inteiramente casualizado com quatro repetições. Para análise estatística, foi utilizado o programa SISVAR (Ferreira 2000) e a comparação das médias realizada por meio do teste Scott-Knott com 5% de probabilidade (Centenaro et al. 2009).

Ensaio de toxicidade frente aos nauplios de Artemia salina

Muitos agrotóxicos além das características alelopáticas apresentam efeitos tóxicos para o meio ambiente e para a saúde humana, uma vez que resíduos destes permanecem nos alimentos, podendo causar efeitos adversos ao sistema nervoso, ter ação imunodepressora ou ser cancerígeno (Caldas & Souza 2000). O presente ensaio foi realizado no sentido de verifi car se os extratos testados apresentam características poluidoras do meio ambiente. Uma baixa toxicidade pode ser considerada uma característica interessante para utilização de extratos vegetais com propriedades alelopáticas em ambientes naturais para controle de plantas daninhas. Para a análise foi utilizada a metodologia de (Meyer et al.1982) adaptada. Os cistos de A. salina foram incubados em água do mar artificial (35 g de sal marinho dissolvidos em 1 L de água destilada) na concentração de 0,5 mg mL^-1. A cultura foi mantida sob aeração e agitação constantes, em uma temperatura entre 26 a 30 ºC por 48 horas para a eclosão dos mesmos. Na primeira hora do processo foi mantida a iluminação de 20 W e o pH no período de 48 horas foi verificado e ajustado ente 8 a 9. Após a eclosão dos cistos, 10 larvas de Artemia salina foram transferidas para tubos contendo água artificial do mar, com três diferentes concentrações das frações obtidas do extrato da polpa do fruto de E. edulis: 10, 100 e 1000 ppm. Foi utilizado sulfato de quinidina como controle positivo de toxicidade nas mesmas concentrações e a água do mar artificial como controle negativo.

Os náuplios foram incubados por 24 horas, decorrido este período de contato os sobreviventes foram contados. Os dados foram analisados pelo método Probits (Finney 1962) e expressos como CL₅₀ (concentração letal média) e percentual de mortalidade. São consideradas tóxicas as sustâncias quando a CL₅₀ foi menor que 1000 ppm. Resultados com 100% de mortalidade significam elevada toxicidade e de 0% sem toxicidade.

Resultados

Análise da atividade alelopática

No bioensaio do crescimento as avaliações do comprimento dos hipocótilos e das radículas das plântulas de alface submetidas às frações obtidas do extrato etanólico da polpa de E. edulis podem ser observados nas Tab. 1 e Tab. 2, respectivamente. Em ambos as frações hexano, clorofórmio e acetato de etila foram estatisticamente iguais ao controle água, não demonstrando assim efeito sobre o crescimento das plântulas. No entanto a fração remanescente demonstrou uma inibição sobre o crescimento da parte aérea, nas concentrações de 0,2 e 0,4 mg, indicando o potencial alelopático da mesma. Também foi demonstrado efeito alelopático da fração remanescente nestas mesmas concentrações sobre o crescimento da radícula, como pode observado na Tab. 2. A Fig. 1 representa o efeito da fração remanescente sobre o percentual de inibição do crescimento, que foi calculado pela comparação da média do crescimento do controle água e a média da fração remanescente. Na concentração de 0,2 mg houve inibição do crescimento do hipocótilo em 47,29% e na concentração de 0,4 mg ocorreu 31,75% de inibição do crescimento. Da mesma forma foi verificada a inibição sobre o desenvolvimento da radícula, na concentração de 0,2 houve inibição de 46,3% e na concentração de 0,4 mg 41,76%.

A fração remanescente também alterou o índice de velocidade de germinação (Tab.3), todas as concentrações foram estatisticamente diferentes do controle, contribuindo também para o potencial alelopático desta fração. As outras frações demonstraram ser estatisticamente iguais ao controle.

Análise toxicológica

Os resultados do ensaio de toxicidade frente aos náuplios de A. salina podem ser observados na Tab. 4. O controle positivo sulfato de quinidina apresentou uma CL₅₀ de 50,12 ppm. Em relação à taxa de mortalidade na concentração de 1000 ppm de sulfato de quinidina, 100% das artemias morreram, na concentração de 100 ppm 80%, e na concentração de 10 ppm a taxa de mortalidade foi de 0%. Para todas as frações obtidas do extrato etanólico da polpa a CL₅₀ foi superior a 1000 ppm, e em nenhuma das concentrações testadas foi verificada a mortalidade das artemias, ou seja em todas as concentrações a taxa de mortalidade foi de 0%.

Discussão

No teste de crescimento nota-se que a fração remanescente demonstrou inibição tanto sobre o crescimento do hipocótilo e quanto o da radícula nas concentrações de 0,2 e 0,4 mg, demonstrando ação alelopática. De forma geral, as raízes mostram-se mais sensíveis à ação de substâncias presentes nos extratos quando comparados com as demais estruturas das plântulas, fato este que pode ser explicado pelas raízes estarem em contato direto com o aleloquímico (Borella & Pastorini 2009), porém este fato não ocorreu, pois a inibição do crescimento foi proporcional em ambas Assim pode-se explicar a maior atividade alelopática apreas estruturas na concentração de 0,2 mg, no entanto na sentada pela concentração 0,2 mg. concentração de 0,4 mg foi observado maior sensibilidade A fração remanescente além de inibir o crescimento da radícula ao extrato das plântulas também modificou o índice de velocidade de É importante salientar que a natureza química dos ale-germinação, todas as concentrações foram estatisticamente loquímicos é muito diversa e alguns só atuam em presença diferentes do controle. As alterações nos padrões de germide outros, em combinações e proporções específi cas, sendo nação podem resultar em efeitos sobre a permeabilidade difícil distinguir e identificar os efeitos individuais, devido das membranas, transcrição e tradução do DNA, funcioà complexidade biológica do processo. (Pereira et al. 2008). namento de mensageiros secundários, na respiração com o seqüestro de oxigênio pelos fenóis e formação de enzimas (Ferreira & Aquila 2000). A fração remanescente apresenta compostos fenólicos, alguns compostos fenólicos podem atuar como inibidores da germinação (Ducca & Zonetti 2008), justificando os resultados encontrados. As sementes com IVG alterado levam mais tempo para germinar, pois possuem maior dificuldade para alongar o sistema radicular, uma vez que ficam mais tempo em contato com os aleloquímicos (Hoff mann et al. 2007). Os resultados evidenciam que a fração remanescente diminuiu a velocidade de desdobramento e translocação dos componentes nutritivos, conseqüentemente diminuindo a velocidade de germinação e o desenvolvimento das estruturas.

O ensaio de toxicidade frente aos náuplios de A. salina é utilizado como método alternativo para a determinação da toxicidade, pois demonstra a sensibilidade da A. salina a substâncias tóxicas (Utyama et al. 2007). Os testes de toxicidade são necessários para avaliar a poluição aquática, uma vez os testes físico-químicos não são efi cazes para detectar os efeitos deletérios causados à biota, bem como não detectam várias classes de compostos químicos poluentes (Barbieri 2004). Devido a sua ampla distribuição geográfica e resistência ambiental, a Artemia sp é utilizada para inúmeros estudos de ecotoxicidade e na avaliação de produtos como pesticidas, derivados do petroquímicos e dispersantes, metais pesados, derivados carcinogênicos e metabólitos de microorganismos desde a década de 50 (Bevilacqua et al. 2008). Em relação ao presente ensaio foi verificado que as frações obtidas do extrato etanólico apresentaram uma CL₅₀ superior a 1000 ppm indicando que as frações não são tóxicas, também foi verifi cado 0% de mortalidade nas concentrações estudadas, confi rmando a não toxicidade das frações.

A aplicação indiscriminada de agrotóxicos afeta tanto a saúde humana quanto ecossistemas naturais. Os impactos na saúde podem atingir tanto os aplicadores dos produtos, os membros da comunidade e os consumidores dos alimentos contaminados com resíduos (Soares et al. 2003). O desejo crescente de substituir os insumos químicos sintéticos nos agroecossistemas por materiais produzidos naturalmente motiva pesquisas aplicadas à alelopatia, isto porque os benefícios da pesquisa alelopática podem ser utilizados para melhorar a sustentabilidade dos sistemas de produção e a conservação da vegetação natural ou seminatural, pois representam uma alternativa biológica com ação específica e menos prejudicial ao meio ambiente (Tur et al. 2010). Porém os produtos naturais estão sujeitos aos mesmos problemas tóxicos dos pesticidas. Assim pesquisas alelopáticas devem estar associadas a estudos de ecotoxicidade e toxicidade para humanos, uma vez que substâncias desenvolvidas e utilizadas como agrotóxicos podem causam danos ao meio ambiente e a saúde humana.

Com base nos resultados e nas condições em que foram realizados os experimentos, conclui-se que a fração remanescente do extrato da polpa de E. edulis demonstrou efeito alelopático sobre cipselas e plântulas de L. sativa, bem como ausência de toxicidade frente aos náuplios de A. salina. Mais estudos devem ser conduzidos com espécies invasoras e com ensaios alelopáticos de campo a fim de complementar a aplicação da fração remanescente na pesquisa de novos modelos de herbicidas.

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPES pela bolsa de estudos concedida a primeira autora, e a Andrey Pabst, da empresa Alicon Alimentos, pelo fornecimento do material vegetal.

Recebido em 1/11/2010

Aceito em 22/03/2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Set 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Recebido
  01 Nov 2010
• Aceito
  22 Mar 2011