Modelo de indução de necrose focal hepática: estudo experimental em ratos

Experimental induction model of hepatic focal necrosis: in rats

Resumos

OBJETIVO: Investigar a área de necrose focal induzida pela injeção intra-hepática de quatro diferentes substâncias no fígado de ratos. MÉTODOS: Foram utilizados 25 ratos Wistar, com peso variando entre 200 a 250 g, distribuidos em 5 grupos, que receberam 0,1cc das seguintes substâncias: Grupo I (Gr. I) - soro fisiológico a 0,9% (controle). Grupo II (Gr. II) - glicose hipertônica a 50%. Grupo III (Gr. III) - NaCl a 20%. Grupo IV (Gr. IV) - formol a 10%. Grupo V (Gr. V) - etanol. Os animais foram submetidos a laparotomia para que a punção fosse realizada no lobo hepático médio sob visão direta. Todos os animais foram sacrificados após 24 horas da injeção.. Os fígados foram avaliados histologicamente, com o intuito de mensurar a área do tecido necrótico. RESULTADOS: Nos cinco grupos estudados observou-se: Gr. I - 2829mm² (controle); Gr. II - 3805mm² (glicose hipertônica); Gr. III - 3930mm² (NaCl); Gr. IV - 4532mm² (formol) e Gr. V - 6432mm² (etanol). A análise estatística destes valores foi feita pelo método das comparações múltiplas. CONCLUSÃO: 1. O soro fisiológico foi à substância que causou a menor área de necrose (P< 0,05). 2. O NaCl a 20% e a glicose hipertônica a 50% produzem efeitos semelhantes (P > 0,05). 3. O formol a 10% produziu necrose mais extensa que a glicose hipertônica a 50% (P < 0,05) e que o NaCl a 20%, porém não apresentou diferença estatisticamente significativa com esta última (P > 0,05). 4. O etanol foi à substância que, comparada com as outras, mais necrose produziu (P < 0,05).

Fígado; Necrose; Ratos

PURPOSE: To investigate the extent of necrosis after the injection of four substances into the liver of rats. METHODS: Twenty-five male Wistar rats (weighting from 200 - 250g) and divided into five groups were used for this study. All the animals underwent a transverse laparotomy, each receiving 0,1ml of the following substances into the liver parenchyma: Saline solution (1st Group - Gr. I), 50% hypertonic glucose (2nd Group - Gr. II), 20% NaCl (3rd Group - Gr. III), 10% formaline solution (4th Group - Gr. IV) and ethanol (5th Group - Gr. V). All the animals were sacrificated 24 hours after surgical procedures. The livers were examined microscopically to measure the extent of induced necrosis. RESULTS: The results achieved were the following: 2829mm² - Gr. I; 3805mm² - Gr. II; 3930mm² - Gr. III; 4532mm² - Gr. IV; and 6432mm² - Gr. V.. Statistical analysis were made with Kruskal-Wallis test and P less than 0,05 were considered statistically significant. CONCLUSIONS: 1. A saline solution causes hepatic necrosis, although to a lesser extent than the other substances (P < 0,05). 2. 20% NaCl and 50% hypertonic glucose produce necrosis to the same extent (P > 0,05). 3. The necrosis induced by a 10% formaline solution was greater than that induced by 50% hypertonic glucose (P < 0,05) and 20% NaCl (P > 0,05). 4. The hepatic injection of ethanol produced the most intense hepatic necrosis when compared to saline solution, 20% NaCl, 50% hipertonic glucose and 10% formaline solution (P < 0,05).

Liver; Necrosis; Rats

ARTIGO ORIGINAL

Modelo de indução de necrose focal hepática: estudo experimental em ratos¹

Experimental induction model of hepatic focal necrosis, in rats

José Manoel da Silva Gomes Martinho^I; Heleno Pinto de Moraes^II; Marcelo Enne de Oliveira^III; Lucio Filgueiras Pacheco Moreira^III; Alexandre Cerqueira da Silva^III; Leonel dos Santos Pereira^IV; Francisco Maia^V

^IProfessor Adjunto do Departamento de Cirurgia Geral e Especializada da Universidade Federal Fluminense

^IIProfessor Adjunto do Departamento de Patologia da Universidade Federal Fluminense

^IIIMédico do Hospital Geral de Bonsucesso do Ministério da Saúde

^IVProfessor Adjunto do Departamento de Cirurgia da UFRJ

^VProfessor Titular do Departamento de Cirurgia Geral e Especializada da Universidade Federal Fluminense

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Investigar a área de necrose focal induzida pela injeção intra-hepática de quatro diferentes substâncias no fígado de ratos.

MÉTODOS: Foram utilizados 25 ratos Wistar, com peso variando entre 200 a 250 g, distribuidos em 5 grupos, que receberam 0,1cc das seguintes substâncias: Grupo I (Gr. I) - soro fisiológico a 0,9% (controle). Grupo II (Gr. II) - glicose hipertônica a 50%. Grupo III (Gr. III) - NaCl a 20%. Grupo IV (Gr. IV) - formol a 10%. Grupo V (Gr. V) - etanol. Os animais foram submetidos a laparotomia para que a punção fosse realizada no lobo hepático médio sob visão direta. Todos os animais foram sacrificados após 24 horas da injeção.. Os fígados foram avaliados histologicamente, com o intuito de mensurar a área do tecido necrótico.

RESULTADOS: Nos cinco grupos estudados observou-se: Gr. I - 2829mm² (controle); Gr. II - 3805mm² (glicose hipertônica); Gr. III - 3930mm² (NaCl); Gr. IV - 4532mm² (formol) e Gr. V - 6432mm² (etanol). A análise estatística destes valores foi feita pelo método das comparações múltiplas.

CONCLUSÃO: 1. O soro fisiológico foi à substância que causou a menor área de necrose (P< 0,05). 2. O NaCl a 20% e a glicose hipertônica a 50% produzem efeitos semelhantes (P > 0,05). 3. O formol a 10% produziu necrose mais extensa que a glicose hipertônica a 50% (P < 0,05) e que o NaCl a 20%, porém não apresentou diferença estatisticamente significativa com esta última (P > 0,05). 4. O etanol foi à substância que, comparada com as outras, mais necrose produziu (P < 0,05).

Descritores: Fígado. Necrose. Ratos.

ABSTRACT

PURPOSE: To investigate the extent of necrosis after the injection of four substances into the liver of rats.

METHODS: Twenty-five male Wistar rats (weighting from 200 - 250g) and divided into five groups were used for this study. All the animals underwent a transverse laparotomy, each receiving 0,1ml of the following substances into the liver parenchyma: Saline solution (1^st Group - Gr. I), 50% hypertonic glucose (2^nd Group - Gr. II), 20% NaCl (3^rd Group - Gr. III), 10% formaline solution (4^th Group - Gr. IV) and ethanol (5^th Group - Gr. V). All the animals were sacrificated 24 hours after surgical procedures. The livers were examined microscopically to measure the extent of induced necrosis.

RESULTS: The results achieved were the following: 2829mm² - Gr. I; 3805mm² - Gr. II; 3930mm² - Gr. III; 4532mm² - Gr. IV; and 6432mm² - Gr. V.. Statistical analysis were made with Kruskal-Wallis test and P less than 0,05 were considered statistically significant.

CONCLUSIONS: 1. A saline solution causes hepatic necrosis, although to a lesser extent than the other substances (P < 0,05). 2. 20% NaCl and 50% hypertonic glucose produce necrosis to the same extent (P > 0,05). 3. The necrosis induced by a 10% formaline solution was greater than that induced by 50% hypertonic glucose (P < 0,05) and 20% NaCl (P > 0,05). 4. The hepatic injection of ethanol produced the most intense hepatic necrosis when compared to saline solution, 20% NaCl, 50% hipertonic glucose and 10% formaline solution (P < 0,05).

Key words: Liver. Necrosis. Rats.

Introdução

O melhor método para o tratamento de lesões malignas primárias ou secundárias do fígado é a ressecção ^1_5. Entretanto existem pacientes que, por problemas diversos, como idade avançada, múltiplos nódulos ou risco cirúrgico proibitivo, são inoperáveis ^6,7.

Na literatura encontram-se relatos de vários procedimentos, isolados ou associados ^8_10 com o intuito de evitar a intervenção cirúrgica, prolongar a sobrevida ou mesmo curar estes pacientes¹¹.

Dentre as alternativas mais usadas destacam-se a coagulação por microondas^12,13, a fotocoagulação por laser¹⁴, a crioterapia^11_15, a quimioembolização arterial e a injeção percutânea do etanol^16_18.

Esta última apresenta como vantagens ser um método barato, de fácil execução e que permite a repetição várias vezes no mesmo paciente⁷, principalmente em tumores com menos de 3 cm¹⁶. O etanol age induzindo uma necrose hepática focal. Após 271 injeções, em 23 pacientes, Livraghi¹⁹ não encontrou células tumorais viáveis em biópsias ou em ressecções realizadas em pacientes portadores de hepatocarcinoma.

Encontram-se relatos da aplicação experimental de outras substâncias com a mesma finalidade, ou seja, a destruição de tecido tumoral hepático. Honda²⁰ induziu tumores em fígado de ratos e injetou água a 80 graus Celsius, comparando o efeito com o do etanol. Concluiu que a água quente produziu necrose na mesma intensidade que o etanol.

Ohnishi²¹ injetou ácido acético em fígados de ratos e concluiu que, dependendo da concentração utilizada, este era mais letal para o hepatócito que o etanol.

Na literatura nacional, entretanto, não encontramos estudo clínico ou experimental que abordasse especificamente este assunto.

O propósito desta investigação foi avaliar, experimentalmente, em ratos, a extensão da necrose hepática induzida pela injeção de glicose hipertônica a 50%, NaCl a 20%, formol a 10% e etanol.

Métodos

Foram utilizados 25 ratos Wistar, machos, pesando entre 200 e 250 gramas. Os animais foram anestesiados por inalação de éter, inicialmente em campânula fechada e, posteriormente, mantidos sob máscara. Na mesa de cirurgia foram posicionados em decúbito dorsal, tricotomizados e fixados com elásticos nas patas.

Depois dos cuidados de anti-sepsia, realizou-se uma incisão transversa subcostal direita. O ligamento falciforme foi parcialmente seccionado, liberando o fígado da parede abdominal anterior. Em seguida realizou-se a punção do lobo médio^{22, 25} com agulha 10 x 4,5mm e injetou-se 0,1ml da substância a ser estudada. A punção e a injeção foram sempre feitas na mesma topografia, guardando a mesma distância da borda inferior do fígado e do ligamento falciforme à esquerda, na mesma profundidade e ângulo de inclinação em relação à cápsula de Glisson.

Cada grupo de cinco animais recebeu as seguintes substâncias: glicose hipertônica a 50%, NaCl a 20%, formol a 10% e etanol. Os cinco animais restantes receberam soro fisiológico (grupo controle).

O abdome dos animais foi fechado com fio inabsorvível em sutura contínua no plano músculo-aponeurótico e pontos separados na pele.

Os animais foram alojados individualmente em gaiolas, permanecendo com ração liberada.

Nenhum animal morreu ou apresentou sinais de doença. Após 24 horas, com a mesma rotina seguida para a cirurgia, o lobo mediano, contendo a lesão foi retirado e processado para estudo morfológico. Em seguida, os animais foram sacrificados por secção da aorta abdominal e medula espinhal, ainda sob anestesia.

Após fixação em formol a 10% por sete dias, as peças foram seccionadas em fatias de espessura constante de 3 mmatravés de uma guia de metal em forma de "U" e uma navalha histológica descartável. À medida que o lobo era seccionado, as peças eram colocadas lado a lado e uma das suas faces marcada com tinta nanquim para, não só orientar a inclusão em parafina como evitar que as faces adjacentes de fatias consecutivas fossem examinadas à microscopia de luz. As fatias, em grupos de duas a quatro por lâmina, eram colocadas em envelopes de papel filtro, identificadas com o número do animal e com o número do bloco (ex: Rato 1 - Bloco 1), perfazendo um total de três lâminas por animal. A numeração do bloco sempre se iniciava pela extremidade mais próxima à área de secção do fígado, portanto, a mais afastada da borda hepática. Todo este processamento foi realizado pela mesma pessoa, com a utilização da mesma guia, obtendo-se fatias de fígado com 0,25cm de espessura.

O processamento histológico teve início com a desidratação do material em banhos consecutivos de álcool. A diafanização foi feita com banhos de xilol e a inclusão realizada em parafina histológica. Utilizou-se uma estufa a 60 graus centígrados.

A inclusão nos blocos de parafina foi feita com o cuidado de se posicionar a face marcada da fatia do fígado voltada para cima. A seguir os blocos foram seccionados utilizando-se um micrótomo rotativo Spencer 820, obtendo-se cortes de 5m que foram corados pelas hematoxilina de Harris e eosina alcoólica (H - E). Por último, as lâminas foram montadas com bálsamo do Canadá e lamínulas de vidro.

A quantificação da necrose foi realizada utilizando-se um Mini-Mop (Carl Zeiss), integrado a um fotomicroscópio Nikon com câmara lúcida. Um ponto de luz de cor vermelha projetado sobre o corte histológico e que desloca-se de acordo com a movimentação do mouse ligado ao Mini-Mop, traça o contorno da necrose em todas as lâminas. O percurso do ponto luminoso foi medido por um programa próprio do sistema que calcula a área delimitada, ou seja, a área de necrose.

Os dados referentes aos cinco grupos estudados foram analisados comparando-se seus valores através do teste não paramétrico de Kruskal - Wallis, com a adoção do nível de significância de 5% de probabilidade, segundo Campos (1983) ²⁶. Quando significante o valor do teste, utilizou-se o método das comparações múltiplas para localizar as diferenças entre pares de tratamentos.

Resultados

Macroscopicamente todos os fígados examinados apresentaram necrose hepática. Histologicamente, a quantificação das áreas de necrose mostrou diferenças entre os diversos grupos (Tabela 1).

No grupo I (soro fisiológico a 0,9%), a soma dos valores das áreas de necrose foi de 2829mm².

No grupo II (glicose hipertônica a 50%), o somatório foi de 3805mm².

No grupo III (NaCl a 20%), o total encontrado foi de 3930mm².

No grupo IV (formol a 10%), a área total de necrose encontrada foi de 4532mm².

No grupo V (etanol), encontrou-se a maior área de necrose com 6432mm².

Aplicado o teste não paramétrico de Kruskal - Wallis, seu valor correspondeu a H = 38,72 (P < 0,01), indicando diferença significante entre os grupos.

Em seguida, utilizou-se o método das comparações múltiplas para localizar as diferenças entre pares de tratamentos.

O grupo controle, representado por ratos que receberam soro fisiológico a 0,9%, foi o que estatisticamente demonstrou menor área de necrose (P< 0,05) em relação aos outros grupos.

O grupo V foi o que apresentou a necrose mais extensa , sendo também esta diferença, quando comparada com todas as outras substâncias, estatisticamente significante (P < 0,05).

Os grupos II e III, representados respectivamente pelos ratos injetados com glicose hipertônica a 50 % e NaCl a 20%, não apresentaram diferença estatística (P > 0,05), quando comparados entre si.

O formol a 10% produziu área de necrose menor que o grupo V (P< 0,05) e maior que todas as outras substâncias testadas, não apresentando porém diferença estatística significante com relação ao grupo III (P > 0,05).

Discussão

Um percentual significativo de pacientes é portador de neoplasias irressecáveis do fígado por vários motivos, tais como, idade avançada, múltiplos nódulos hepáticos, cirrose avançada, dificuldade de acesso à lesão ou mesmo recusa do paciente em submeter-se a uma cirurgia de alto risco^6,27,28. Por isso, um grande número de proposições apareceram na literatura como terapias alternativas para esses casos, algumas durante o ato operatório, outras não cirúrgicas^11,9,29,30.

A injeção intratumoral de etanol vem sendo proposta por Sugiura³¹ como procedimento simples e barato³² para o tratamento do carcinoma hepatocelular único ou múltiplo³³, de pequeno tamanho e, mais raramente, para hiperplasia adenomatosa³⁴ e tumores secundários³⁵.

O etanol é injetado no tumor ou na artéria que o vasculariza através uma agulha fina e sob controle ultrassonográfico^32,36. O mecanismo de ação do álcool dá-se por duas maneiras. A primeira por desidratação imediata do citoplasma pela difusão dentro da célula, com conseqüente necrose por coagulação, seguida por reação fibrótica e a segunda, pela entrada do etanol na circulação sangüínea, induzindo necrose da célula endotelial e agregação plaquetária com conseqüente trombose de pequenos vasos, causando isquemia do tecido neoplásico^37,7.

Na maioria dos casos há necessidade de múltiplas aplicações da substância^38,39. A complicação decorrente do procedimento mais relatada é a dor, causada pelo derrame na cavidade peritoneal ⁴. Sua prevenção é feita, porém, pela injeção lenta do etanol e retirada da agulha alguns segundos após o término da injeção³². Com a finalidade de diminuir o inconveniente de uma distribuição irregular do etanol dentro do tumor, Sheu⁴⁰ utilizou uma agulha multiperfurada na ponta. Outra complicação é a febre baixa que pode cursar com a necrose do tumor.³²

Giovannini³⁵ injetou o etanol em 40 pacientes com 55 tumores secundários do fígado, relatando necrose completa em 31 casos (56%). A média de sobrevida nesses pacientes foi de 21 meses, chegando a 39% em três anos.

A avaliação da resposta ao tratamento tem sido acompanhada pela ultrassonografia, tomografia computadorizada^41,42, o doppler colorido⁴³ e a ressonância nuclear magnética^44,45.

Burgener⁴⁶ avaliou experimentalmente o efeito da injeção percutânea do etanol em adenocarcinomas implantados na pata posterior de ratos. Concluiu que a injeção intramuscular do etanol produziu uma necrose de coagulação local, seguida de formação de tecido de granulação e subsequente fibrose, sem sintomas colaterais sistêmicos. Em comparação com animais de controle, a injeção intratumoral induziu necrose parcial ou completa do tumor, reduziu a taxa de crescimento e causou a erradicação completa em 25 % dos casos.

Festi e col.⁴⁷, em trabalho experimental, avaliaram os efeitos locais e sistêmicos da injeção do etanol. Injetaram de 0,1 a 2 ml/kg de peso em fígado de coelhos e os sacrificaram em intervalos variando de 1 a 30 dias. Concluiram que a injeção do etanol era bem tolerada, não produzindo efeitos colaterais, sendo a área de necrose dependente da dose injetada.

O nosso trabalho foi realizado em ratos, injetando-se quantidade padronizada de várias substâncias em fígado sadio. Não nos propusemos a estudar os efeitos locais das substâncias injetadas em longo prazo nem seus efeitos colaterais. Devemos contudo registrar que os animais sacrificados não apresentaram sinais de doença. O espaço de tempo de 24 horas entre a injeção intra-hepática das substâncias e o sacrifício dos animais preencheu nossa expectativa que era a de estudar a área de necrose produzida, sem a interferência das fases subseqüentes.

Os achados de nossa experimentação, utilizando o etanol, foram semelhantes aos de Festi e col.⁴⁷. Embora o nosso tempo de observação tenha sido de apenas 24 horas, constatamos necrose nos fígados de todos os animais que receberam esta substância.

Outras substâncias são relatadas na literatura, principalmente a japonesa, utilizadas com a mesma finalidade, e apontam uma tendência atual dos pesquisadores em buscar alternativas que não impliquem em cirurgias extensas, de grande risco para os pacientes e cujo resultado em termos de sobrevida sejam iguais ou melhores que as ressecções.

Honda²⁰, em trabalho experimental, injetou água a 80 graus Celsius ou etanol para o tratamento de tumores hepáticos induzidos em ratos. Concluiu que a água quente induzia necrose em tumores hepáticos tanto quanto o etanol. No mesmo ano utilizou clinicamente a água quente⁴⁸. Em 1994, publicou os resultados de um grupo de 20 pacientes com carcinoma hepatocelular com menos de 3 cm que foram tratados com injeção percutânea de soro fisiológico quente. Não houve complicações e um efeito terapêutico foi obtido em todos os casos⁴⁹.

Em nosso estudo as substâncias utilizadas foram injetadas na temperatura ambiente. Nesta condição, o efeito do etanol foi muito superior ao do soro fisiológico e ao NaCl a 20%.

Ohnishi²¹ injetou ácido acético em várias concentrações ou etanol em ratos. Comparou os diâmetros médios das áreas de necrose e concluiu que o ácido acético nas concentrações acima de 40% era mais efetivo que o etanol. Em 1996 o ácido acético foi utilizado clinicamente pelo mesmo autor em carcinoma hepatocelular maior ou menor de 3 cm, mostrando ser mais eficaz que o etanol como indutor de necrose focal^50,51,52. Mostrou também que a recidiva era maior em pacientes tratados com etanol do que com o ácido acético⁵³.

Em nosso experimento, o soro fisiológico, utilizado como controle, também produziu necrose. No entanto, a quantidade de necrose foi menor quando comparada com todas as outras substâncias (P < 0,05).

Não encontramos na literatura, mesmo na internacional, referências a estudos com as outras substâncias utilizadas em nossa pesquisa.

Verificamos, conforme pode-se depreender, que tanto a glicose hipertônica a 50% quanto o NaCl a 20% e o formol a 10% foram efetivos na produção de necrose em tecido hepático sadio, provavelmente pela hipertonicidade das duas primeiras e pelo efeito cáustico do formol.

Estas três substâncias carecem portanto de investigação experimental, a fim de testar a sua eficácia no que tange à indução de necrose em tecido tumoral. Um experimento que nos parece atraente para comprovar tal hipótese seria o de primeiro induzir tumor no fígado de ratos e em seguida administrá-las isolada ou em associação, utilizando o mesmo modelo deste estudo, para avaliar a eficiência na destruição de células tumorais.

Conclusões

1. O soro fisiológico causou a menor área de necrose, comparada com as outras;

2 NaCl a 20% e a glicose hipertônica a 50% produzem áreas de necrose semelhantes;

3 O formol a 10% produziu necrose mais extensa comparada ao uso da glicose hipertônica a 50%;

4 O etanol foi à substância que, comparada com as outras, produziu maior área de necrose.

Data do recebimento: 15/12/2003

Data da revisão: 06/01/2004

Data da aprovação: 22/01/2004

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

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Trabalho realizado no Laboratório de Fisiologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Abr 2004
• Data do Fascículo
  Jan 2004

Histórico

• Aceito
  22 Jan 2004
• Revisado
  06 Jan 2004
• Recebido
  15 Dez 2003