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Ciência Rural

Print version ISSN 0103-8478On-line version ISSN 1678-4596

Cienc. Rural vol.37 no.6 Santa Maria Nov./Dec. 2007

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84782007000600047 

NOTA
DEFESA FITOSSANITÁRIA

 

Seleção de antagonistas fúngicos a Fusarium solani e Fusarium oxysporum em substrato comercial para mudas

 

Selection of fungi antagonistic to Fusarium solani and Fusarium oxysporum in commercial substrate for seedlings

 

 

Luciana Zago EthurI; Elena BlumeI, 1; Marlove Fátima Brião MunizI; Maria Georgina Veiga FloresI

IDepartamento de Defesa Fitossanitária, Centro de Ciências Rurais (CCR), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), 97105-900, Santa Maria, RS, Brasil. E-mail: eblume@smail.ufsm.br

 

 


RESUMO

Testes in vitro são geralmente utilizados para a seleção inicial de agentes de biocontrole contra fungos de solo, faltando metodologias que utilizem solo e/ou substrato. O objetivo deste trabalho foi realizar a seleção massal de isolados fúngicos antagônicos a F. solani e F. oxysporum em substrato comercial para mudas. Foram realizados dois experimentos com os patógenos F. solani e F. oxysporum e com 98 possíveis antagonistas fúngicos, dos gêneros Penicillium claviforme, Penicillium, Aspergillus e Cladosporium. A suspensão dos patógenos foi inserida no substrato, em copos plásticos, sendo acrescentada, cinco dias depois, a suspensão dos demais fungos. Avaliou-se o número de unidades formadoras de colônia de F. solani e F. oxysporum por grama de substrato após nove dias. Dos 98 isolados utilizados contra F. solani, 43 % não diferiram da testemunha e 57% reduziram o seu desenvolvimento em substrato, sendo que os três melhores isolados fúngicos foram do gênero Penicillium claviforme. Os três isolados de Penicillium claviforme selecionados para F. solani também foram eficientes para F. oxysporum.

Palavras-chave: biocontrole, fungos de solo, Penicillium claviforme spp.


ABSTRACT

Tests in vitro are usually used for the initial selection of biocontrol agents against soil fungi, lacking methodologies using soil and/or substrate. The objective of this research was to accomplish the mass selection of fungi isolates antagonistic to F. solani and F. oxysporum in commercial substrate for seedlings. Two experiments were conducted, with the pathogens F. solani and F. oxysporum, and 98 possible antagonistic fungi of the genera Penicillium claviforme, Penicillium, Aspergillus and Cladosporium. The suspension of the pathogens was inoculated in the substrate, in plastic cups, and the suspension of the other fungi was added five days later. The number of colony-forming unit of F. solani and F. oxysporum/g of substrate was counted after nine days. Of the 98 isolates used against F. solani, 43% did not differ from the control, and 57% reduced its development in the substrate, with the three best isolates belonging to the genus Penicillium claviforme. The three isolates of Penicillium claviforme selected for F. solani were also efficient against F. oxysporum.

Key words: biocontrol, soil fungi, Penicillium claviforme spp.


 

 

F. solani (Mart.) Hans e F. oxysporum Schlecht são fitopatógenos habitantes do solo causadores de podridões de raiz e murchas, respectivamente. Esses patógenos são importantes devido aos danos econômicos causados no setor agrícola e por sua distribuição cosmopolita (GHINI & NAKAMURA, 2001). O controle de doenças causadas por patógenos de solo é dificultado devido à complexidade do ambiente, no qual o controle químico tem sua eficiência prejudicada ou sua aplicação dificultada. Além disso, o controle químico pode causar danos na microbiota benéfica e deixar resíduos no ambiente, buscando-se no controle biológico uma alternativa mais sustentável.

Um dos pontos centrais para o biocontrole ser efetivo contra fungos de solo é o antagonista, pois as chances de sucesso nos programas de controle biológico estão no isolamento e na seleção de microrganismos antagônicos eficientes (GHINI & KIMATI, 1989). A maior parte dos trabalhos que visam à seleção de antagonistas fúngicos a fitopatógenos ocorre com testes in vitro, que são mais fáceis e rápidos que os efetuados com solo, permitindo que uma grande população seja avaliada (MARIANO, 1993), mas que nem sempre apresentam correlação com os resultados obtidos em condições de campo (GHINI & NAKAMURA, 2001).

Para Penicillium claviforme spp., os testes in vitro mais utilizados na seleção em massa de isolados antagonistas de fungos de solo são o pareamento de culturas (confronto direto) e a detecção de metabólitos voláteis e não-voláteis, todos realizados em meios de cultura à base de ágar (BELL et al., 1982; ASKEW & LAING, 1994; PATRICIO et al., 2001; ETHUR et al., 2005).

Uma alternativa à seleção in vitro, para a supressividade de solos contra Fusarium, foi proposta por TOYOTA et al. (1996) e GHINI & NAKAMURA (2001), baseando-se no desenvolvimento do patógeno sobre agregados de solo previamente colonizados por possíveis antagonistas. Entretanto, essa metodologia é trabalhosa e difícil de ser empregada em seleção massal com vários isolados de possíveis antagonistas. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar seleção massal de isolados fúngicos antagônicos a F. solani e F. oxysporum em substrato comercial para mudas, para serem utilizados em programas de controle biológico.

Nos ensaios, foram utilizados um isolado de F. solani e dois isolados de F. oxysporum, causadores de murcha no pepineiro e no tomateiro, e 98 isolados fúngicos de possíveis antagonistas, obtidos de solo não-rizosférico e rizosférico dessas olerícolas.

No primeiro experimento para a seleção de antagonistas, foram utilizados os 98 isolados dos gêneros Penicillium claviforme (73 isolados), Penicillium (14), Aspergillus (7) e Cladosporium (4) e um isolado de F. solani. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com 99 tratamentos (98 isolados de possíveis antagonistas e testemunha apenas com F. solani), com quatro repetições.

O fitopatógeno foi repicado para placas de Petri contendo meio NS (Nash & Snyder - 20g de ágar, 15g de peptona, 0,5g de MgSO4.7H2O, 1,0g de KH2PO4, 1g de quintozene e 1L de água), as quais foram deixadas em incubadora a 24°C por 7 dias. Após isso, foram acrescentados 3mL de água destilada e esterilizada por placa, e o micélio e os esporos foram removidos com o auxílio da alça de Drigalsky, formando uma suspensão. As suspensões foram ajustadas para 106 esporos mL-1.

Dois gramas de substrato (não esterilizado) foram adicionados em copos plásticos com capacidade para 50mL. Em seguida, foi inoculado 1mL da suspensão do fitopatógeno no substrato e os copos foram fechados com papel filme e papel manteiga. Os copos foram deixados em temperatura ambiente e, a cada dois dias, foi acrescentado 1mL de água destilada e esterilizada para evitar o ressecamento do substrato. Cinco dias depois da inoculação do patógeno, após ter ocorrido a colonização do substrato (constatada por testes anteriores, dados não publicados), foi acrescentado 0,5mL da suspensão dos possíveis antagonistas fúngicos (108 esporos mL-1) retirados com o auxílio de alça de Drigalsky de placas de Petri contendo meio BDA (batata, dextrose e ágar). No tratamento testemunha, foi aplicado 0,5mL de água destilada e esterilizada. Após nove dias, os dois gramas de substrato dos copos foram acrescentados a frascos de vidro com 98mL de água destilada e esterilizada e colocados em agitador mecânico por 30 minutos. Dessa suspensão original, foram retirados 5mL e acrescentados em frasco com 95mL de água destilada e esterilizada. Dessa diluição, uma alíquota de 1mL foi espalhada em placas de Petri contendo meio NS, utilizando-se quatro repetições. Antes de o meio de cultura ser plaqueado, acrescentaram-se 5mL de cloranfenicol 10% para cada litro de meio de cultura. As placas foram incubadas em câmara climatizada a 24°C, com fotoperíodo de 12h, durante sete dias. Após a incubação, o número de colônias de Fusarium foi contado em cada placa e calculado o número de unidades formadoras de colônia (UFC) g-1 de substrato.

Para o segundo experimento, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 16 (15 isolados fúngicos e testemunha) x 2 (isolados de F. oxysporum), com 4 repetições. Foram utilizados 15 isolados fúngicos dos gêneros Penicillium claviforme (9 isolados), Penicillium (2), Aspergillus (2) e Cladosporium (2); e dois isolados de F. oxysporum, que foram utilizados separadamente. Foi realizado sorteio de dois isolados fúngicos para cada gênero e, para Penicillium claviforme, foram sorteados seis mais os três isolados que apresentaram melhor desempenho no experimento anterior. A metodologia foi a mesma utilizada no primeiro experimento.

Os resultados foram submetidos à análise de variância pelo teste F e ao teste de Tukey a 5%, para comparação de médias. As médias em UFC de F. solani e F. oxysporum foram transformadas para LOG10 (UFC + 1). As análises foram realizadas com o auxílio do programa estatístico SOC (EMBRAPA, 1997).

Dos 98 isolados fúngicos utilizados como possíveis antagonistas, 42 isolados (43%) não diferiram da testemunha e os demais isolados reduziram significativamente o desenvolvimento do patógeno, sendo que três do gênero Penicillium claviforme apresentaram os melhores resultados (Tabela 1). Na análise microbiológica do substrato Plantmax®, constatou-se a presença de fungos dos gêneros Penicillium claviforme, Penicillium, Aspergillus e Fusarium, em quantidades inferiores às inoculadas e obtidas nas avaliações dos experimentos.

Os isolados de Penicillium claviforme foram mais efetivos na redução da população de F. solani, quando comparados aos gêneros Penicillium, Aspergillus e Cladosporium. Ao contrário de GHINI & NAKAMURA (2001), que, em experimento utilizando microcosmos e com acréscimo dos antagonistas anteriormente ao do patógeno (F. oxysporum f. sp. phaseoli Kendrich & Snyder), encontraram maior redução na população do patógeno com isolados de Penicillium sp. do que com Penicillium claviforme sp. Já TOYOTA et al. (1996), em trabalho com microcosmos, utilizando como patógeno F. oxysporum f. sp. raphani Kendrich & Snyder, encontraram maior redução da população do patógeno com isolado de Penicillium claviforme viride Pers. ex Fr., seguido por Penicillium claviforme Bainier e por Cladosporium herbarum Link ex Fr.

Foram selecionados, através desse método, três isolados de Penicillium claviforme, HTSR5, ETSR20 e ETSR8, com potencial antagônico a F. solani (Tabela 1).

Deve-se ressaltar que, uma vez que esse método não representa um patossistema completo, assim como a metodologia desenvolvida por GHINI & NAKAMURA (2001), a seleção baseia-se no efeito direto dos antagonistas na redução da população do patógeno em substrato. Segundo TOYOTA et al. (1996), uma estratégia para controlar a doença é prevenir a proliferação do patógeno no solo ou diminuir sua densidade populacional.

Para o experimento com F. oxysporum, não ocorreu interação entre os fatores isolados fúngicos de antagonistas (gênero Penicillium, Aspergillus, Cladosporium e Penicillium claviforme) e patógenos (2 isolados de F. oxysporum) mas ocorreram diferenças significativas entre os isolados fúngicos de antagonistas (Tabela 2). Todos os isolados fúngicos reduziram a população dos patógenos, ocorrendo menor número de UFC do que no tratamento testemunha, demonstrando potencial antagônico aos dois isolados de F. oxysporum.

A redução máxima na população de F. oxysporum (Tabela 2), assim como de F. solani (Tabela 1), foi apresentada pelos isolados do gênero Penicillium claviforme, sendo que as maiores médias foram as dos isolados HTSR5, ETSR20 e ETSR8.

 

 

REFERÊNCIAS

ASKEW, D.J.; LAING, M.D. The in vitro screening of 118 Penicillium claviforme isolates for antagonism to Rhizoctonia solani and an evaluation of different environmental sites of Penicillium claviforme as sources of aggressive strains. Plant and Soil, v.159, p.277-281, 1994.        [ Links ]

BELL, D.K. et al. In vitro antagonism of Penicillium claviforme species against six fungal plant pathogens. Phytopathology, v.72, n.4, p.379-382, 1982.        [ Links ]

EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Ambiente de software NTIA, versão 3.2.2 ; manual do usuário. Campinas: Centro Nacional de Pesquisa Tecnológica em Informática para Agricultura, 1997. 258p.        [ Links ]

ETHUR, L.Z. et al. Fungos antagonistas a Sclerotinia sclerotiorum em pepineiro cultivado em estufa. Fitopatologia Brasileira, v.30, n.2, p.127-133, 2005.        [ Links ]

GHINI, R.; KIMATI, H. Método de iscas para obtenção de isolados de Penicillium claviforme antagônicos a Botrytis cinerea. Jaguariúna: EMBRAPA-CNPDA, 1989. 13p. (Boletim de Pesquisa, 3).        [ Links ]

GHINI, R.; NAKAMURA, D. Seleção de antagonistas e nutrientes que induzem supressividade de solos a Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli em microcosmos e in vivo. Summa Phytopathologica, v.27, n.3, p.318-322, 2001.        [ Links ]

MARIANO, R.L.R. Métodos de seleção in vitro para o controle microbiológico de patógenos de plantas. Revisão Anual de Patologia de Plantas, v.1, p.369-409, 1993.        [ Links ]

PATRICIO, F.R.A. et al. Seleção de isolados de Penicillium claviforme spp. antagônicos a Pythium aphanidermatum e Rhizoctonia solani. Summa Phytopathologica, v.27, p.223-229, 2001.        [ Links ]

TOYOTA, K. et al. Microbiological factors affecting the colonisation of soil aggregates by Fusarium oxysporum f. sp. raphani. Soil Biology & Biochemistry, v.28, n.10, p.1513-1521, 1996.        [ Links ]

 

 

Recebido para publicação 11.10.06
Aprovado em 07.03.07

 

 

1 Autor para correspondência.

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